CN114410790A - 一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法 - Google Patents

一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法,包括有:球形核酸报告子、RCA产物和CRISPR/Cas12a体系;其中:球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子;RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物;CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物。本发明SNA在生理环境中具有优异的抵抗核酸酶切割的能力。因此,用SNA报告子代替ssDNA报告子可以提高CRISPR/Cas12a体系的稳定性;并利用滚环扩增(RCA)具有操作简单、反应温度温和、扩增效率高等优点,将RCA与CRISPR/Cas12a体系结合在一起,在可以显著提高体系的灵敏度。

Description

一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法。
背景技术
循环肿瘤DNA(ctDNA)是原发肿瘤组织、循环肿瘤细胞和其他微转移灶通过凋亡、坏死、直接分泌的方式释放进入外周血循环系统,与癌症具有高度相关性。循环肿瘤DNA检测是一种无创的液体活检技术。与传统的侵入性的组织活检技术相比,液体活检更能揭示肿瘤在空间和时间上的异质性;提供更全面的疾病描述;并且可以实时检测药物疗效和耐药性。并且循环肿瘤DNA的半衰期很短,一般只有15分钟到两个小时,因此比传统的蛋白质类生物标志物更能准确的反应肿瘤的当前状况。有研究表明,ctDNA的水平能实时反应全身肿瘤负荷变化,患者体内的ctDNA在经过有效治疗后会急剧降低。因此,循环肿瘤DNA可用于癌症的早期诊断、个体化治疗以及术后监测。
尽管ctDNA具有很大的应用潜力,但由于其在血液中的浓度很低,且需要在大量野生型序列存在的条件下检测少量突变型序列,因此并没有广泛应用到临床实际样本的检测中。当前,ctDNA的检测方法主要是DNA深度测序和数字聚合酶链式反应。虽然这两种方法对ctDNA的检测具有较好的灵敏度和选择性,但都有其不可避免的缺点,如技术复杂,成本高,耗时长,需要专业的人员分析海量的数据且通量有限、容易产生假阳性信号等。因此现在急需开发出一种灵敏度高,选择性好,操作简单,成本低廉且快速的ctDNA的检测方法。
成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(CRISPR/Cas)系统是存在于细菌和古生菌中的自适应免疫防御体系,被广泛应用于基因编辑领域。其中CRISPR/Cas12a(Cpf1)是II类V型CRISPR/Cas系统,该体系是由crRNA引导的,与靶核酸进行特异性识别和切割(顺式切割),从而触发其对底物单链DNA的非特异性切割活性(反式切割),实现每秒上千次的翻转。CRISPR/Cas体系具有操作简单,反应温度温和,良好的识别特异性以及高效的信号放大能力等优点,因此广泛应用于生物传感领域。
然而,CRISPR/Cas12a体系也存在两个显著的缺点。一方面是稳定性较差,因为Cas12a的反式切割底物一般是ssDNA,但ssDNA在血清等复杂生理环境中的稳定性较差,容易被核酸酶所降解,产生假阳性信号。另一方面是单纯的CRISPR/Cas12a体系的灵敏度较低,不能用于临床低丰度样本的检测。因而如何研究一种利用CRISPR/Cas12a体系实现检测ctDNA具有重大的研究意义。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法,该检测系统中球形核酸技术、CRISPR/Cas12a体系和RCA技术结合在一起,可以提高ctDNA检测的稳定性和灵敏度,避免产生假阳性的产生。
本发明这种检测ctDNA的生物传感检测系统,包括有:球形核酸报告子、RCA产物和CRISPR/Cas12a体系;
其中:球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子;RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物;CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物;
5’磷酸化线性挂锁探针序列如序列1所示,具体为:AAATCACTGAGTTTATCATGTATTATAATTTCGTATGTAAGCTACCTGAGATCTTCTGTACAATTGATCCTCTCTCTA;crRNA的序列如序列2所示,具体为:UAAUUUCUA CUAAGUGUAGAUGUAUGUAAGCUACCUGAG。
本发明这种检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,包括以下步骤:
S1:金纳米粒子的制备:在干净的圆底烧瓶中加入氯金酸溶液,放入油浴锅中,溶液沸腾设定时间后加入柠檬酸钠溶液,提高转速,溶液颜色变成酒红色后,再继续煮沸,然后待其自然冷却到室温后,得到含金纳米金纳米粒子的分散液,低温避光保存;
S2:球形核酸报告子的制备:用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链,将处理后的巯基DNA链与步骤1)金纳米粒子分散液按照设定的比例混合,再加入吐温20和Citrate-HCl,37℃放置过夜;然后向溶液中加入NaCl,放置过夜;最后用无酶水洗3次,洗掉多余的ssDNA,得到球形核酸报告子;
S3:滚环扩增RCA反应:将5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4连接酶混合在1×T4连接酶反应缓冲液中,进行第一次孵育,然后通过热处理灭活T4连接酶,最终获得环状DNA模板;扩增反应中,向上述反应液中加入dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液,进行第二次孵育,同样通过热处理灭火phi29酶,最终得到RCA产物;
S4:RCA-CRISPR/Cas12a切割反应:将LbCas12a蛋白和crRNA在1×NEB缓冲液中孵育,形成稳定的LbCas12a/crRNA二元复合物;然后,将LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物进行混合反应,再然后将SNA报告子加入到上述混合液中,继续反应,反应完毕后,检测反应液的荧光。
所述步骤S1中,氯金酸溶液的质量浓度为0.005~0.015wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为2~4wt%,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液溶液的体积比为95~105:1;油浴温度为120~140℃,转速为700~900rpm;设定时间为5~15min;提高转速至1100~1300rpm;继续煮沸时间为20~40min,最终获得金纳米粒子的平均尺寸为10~15nm。
所述步骤S2中,FAM荧光基团修饰的巯基DNA链的核苷酸序列如序列3所示,具体为:FAM-TTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1;处理后巯基DNA链与金纳米粒子的摩尔比490~510:1;加入吐温20至其浓度为0.01%;Citrate-HCl的浓度为0.5M,pH=7;分多次NaCl的浓度为3M,加入NaCl至反应体系中NaCl终浓度为1M。
所述步骤S3中,5’磷酸化线性挂锁探针的浓度为90~110nM,T4连接酶的浓度为1000U/μL,5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CA E542KM和T4连接酶的体积比为(1~3):(1~3):(0.2~0.4);第一次孵育温度为18~22℃,第一次孵育时间为18~22min;dNTP浓度为2.0~3.0mM;BSA浓度为18~22mg/mL,phi29酶浓度为8~12U/μL,5’磷酸化线性挂锁探针、dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液的体积比为(1~3):(7~9):(0.7~0.9):(0.3~0.5):(3~5);第二次孵育温度为28~32℃,第一次孵育时间为28~32min。
所述步骤S3中,ctDNA-PIK3CAE542KM的序列为如序列4所示,具体为:CTCAGTGATTTTAGAGAGAGGAT;获得RCA产物的序列是一个循环序列,具体为:5'-CTCAGTGATTTTAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGC TTACATACGAAATTA TAATTGTACAATAACTCAGTGATTT TAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGCT TACATACGAAATTATAATTGTACAATAA……
所述步骤S4中,LbCas12a蛋白和crRNA的比例为1nM:10nM;LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物、SNA报告子的体积比为1:5:5;孵育温度为37℃,孵育时间为20~40min;混合反应时间为50~70min;继续反应时间为50~70min。
本发明的有益效果:1)本发明SNA在生理环境中具有优异的抵抗核酸酶切割的能力。因此,用SNA报告子代替ssDNA报告子可以提高CRISPR/Cas12a体系的稳定性;并利用滚环扩增(RCA)具有操作简单、反应温度温和、扩增效率高等优点,将RCA与CRISPR/Cas12a体系结合在一起,在可以显著提高体系的灵敏度。2)本发明中的检测ctDNA的生物传感检测系统可以实现复杂血清环境中ctDNA的高灵敏、特异性检测,在缓冲液中的检测限可低至10aM。
附图说明
图1本发明检测方法的工艺流程图;
图2实施例1中不同浓度的ctDNA所对应荧光强度图;
图3实施例2中生物传感检测系统对ctDNA选择性研究的结果图;
图4实施例3中生物传感检测系统检测复杂环境中ctDNA的结果图;
图5实施例4中两种不同报告子生物传感检测系统对检测ctDNA的稳定性结果图。
具体实施方式
实施例1-生物传感器灵敏度分析
本发明的检测方法流程原理图,如图1所示,具体步骤如下:
本实施例提供一种基于ctDNA高灵敏、特异性检测的生物传感器的具体实施方式,具体为以下步骤:
S1、制备13nm金纳米粒子:圆底烧瓶先用王水浸泡,再用超纯水彻底清洗干净。在干净的圆底烧瓶中加入100mL 0.01wt%的氯金酸溶液,然后将圆底烧瓶放入油浴锅中,将油浴温度设置为130℃,转速设置为800rpm。待溶液沸腾后再继续煮沸10min,以去除溶液中的溶解氧。将转速提高到1200rpm,然后向溶液中快速加入1mL 3wt%的柠檬酸钠,溶液由浅黄色,快速变为黑灰色,再转变为紫红色,最后变为酒红色,颜色不变后再继续煮沸30min。之后待溶液自然冷却到室温后,放到4℃避光保存,测得金纳米粒子的平均尺寸为13nm。
S2、制备球形核酸报告子::在37℃下,用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链1.5h,之后通过3次超滤去除多余的TCEP(10000rpm,4℃,15min)。将处理后的巯基DNA链与金纳米粒子按摩尔比500:1的比例混合,再加入0.01%吐温20和10uL Citrate-HCl(0.5M PH=7.5),37℃放置过夜。第二天,每隔1h加入3M NaCl到上述溶液中,使NaCl的终浓度为1M,同样在37℃下放置过夜。最后用无酶水洗3次(16200rpm,4℃,20min),洗掉未反应的ssDNA,得到球形核酸报告子SNA。
S3、滚环扩增反应:将2μL 100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、分别加入2μL不同浓度的PIK3CAE542KM(0pM-10pM)和0.3μLT4连接酶(1000U/μL)混合在1×T4连接酶反应缓冲液中,在20℃下孵育20分钟,然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶,最终获得环状DNA模板。扩增反应中,在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)和4μLphi29缓冲液,30℃孵育30min,65℃加热10分钟,最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
S4、RCA-CRISPR/Cas12a切割反应:1nM LbCas12a蛋白和10nM crRNA在1×NEB缓冲液2.1中37℃孵育30分钟,形成稳定的二元复合物。然后,将2uL LbCas12a/crRNA复合物与10uLRCA产物混合并在37℃下孵育60分钟,进行顺式切割。接下来,将10uL SNA报告子加入到上述混合液中,37℃下反应60分钟后,进行荧光检测,其结果如图2所示,从图中可以看出ctDNAPIK3CA E542KM的浓度越高荧光强度越高,最低可检测到10aM的ctDNA;说明本发明中的生物传感检测系统对ctDNA有很高的灵敏度。
表1:方法中涉及的序列及序列信息
Figure BDA0003492078730000051
Figure BDA0003492078730000061
实施例2
本实施例的步骤与实施例1的区别仅在于滚环扩增反应阶段。在本实施例中,将2μL 100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、分别将2μL不同种类的ctDNA(PIK3CAE542KM、mismatch-PIK3CAE542KM、KRAS G12DM)和0.3μLT4连接酶(1000U/μL)混合在1×T4连接酶反应缓冲液中,在20℃下孵育20分钟,然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶,最终获得环状DNA模板。扩增反应中,在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)和4uLphi29缓冲液,30℃孵育30min,65℃加热10分钟,最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
所述生物传感检测系统选择性分析结果如图3所示,RCA-CRISPR/Cas12a体系仅对靶标(PIK3CA E542KM)有明显的荧光响应,而对于碱基错配的PIK3CAE542KM以及其他不相关ctDNA(KRAS G12DM)的荧光响应很低,说明该体系具有较好的选择性。
实施例3
本实施例的步骤与实施例1的区别仅在于滚环扩增反应阶段。在实施例3中,将2μL100nM 5’磷酸化线性挂锁探针、2uL 10pM PIK3CAE542KM、0.3μLT4连接酶(1000U/μL)、2μL10×T4连接酶反应缓冲液和13.7μL无酶水(或者13.7μL 10%人血清),在20℃下孵育20分钟,然后在65℃下热处理5分钟以灭活T4连接酶,最终获得环状DNA模板。扩增反应中,在上述反应液中加入8μL dNTP(2.5mM)、0.8μLBSA(20mg/mL)、0.4μLphi29酶(10U/μL)、4μLphi29缓冲液和6.8μL无酶水(6.8μL 10%人血清),30℃孵育30min,65℃加热10分钟,最终得到长ssDNA产物即RCA产物。
本发明的生物传感器检测系统在缓冲液和复杂血清环境中的检测性能对比分析结果如图4所示,RCA-CRISPR/Cas12a体系在缓冲液和复杂血清环境中的荧光响应趋势基本相同,说明该体系有望用于临床血清样本中ctDNA的高灵敏和特异性检测。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于,没有S1和S2步骤;步骤S4中SNA报告子采用ssDNA报告子进行替代,两者的对比效果如图5所示,由图可知:在100%FBS中ssDNA报告子基本被完全降解,荧光强度显著升高;而SNA报告子基本没有被降解,荧光强度保持不变。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种用于检测ctDNA的生物传感检测系统及其检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 5’磷酸化线性挂锁探针(人工序列)
<400> 1
aaatcactga gtttatcatg tattataatt tcgtatgtaa gctacctgag atcttctgta 60
caattgatcc tctctcta 78
<210> 2
<211> 39
<212> RNA
<213> crRNA(人工序列)
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga uguauguaag cuaccugag 39
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> FAM荧光基团修饰的巯基DNA链(人工序列)
<400> 3
tttttttttt ttttt 15
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> ctDNA-PIK3CA E542KM(人工序列)
<400> 4
ctcagtgatt ttagagagag gat 23

Claims (7)

1.一种检测ctDNA的生物传感检测系统,其特征在于,包括有:球形核酸报告子、RCA产物和CRISPR/Cas12a体系;
其中:球形核酸报告子为巯基DNA链修饰的金纳米粒子;RCA产物为待检测物ctDNA与5’磷酸化线性挂锁探针进行RCA扩增反应获得的产物;CRISPR/Cas12a体系中包含有LbCas12a蛋白和crRNA形成的稳定二元复合物;
5’磷酸化线性挂锁探针序列如序列1所示,具体为:AAATCACTGAGTTTATCATGTATTATAATTTCGTATGTAAGCTACCTGAGATCTTCTGTACAATTGATCCTCTCTCTA;crRNA的序列如序列2所示,具体为:UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUAUGUAAGCUACCUGAG。
2.根据权利要求1所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,包括以下步骤:
S1:金纳米粒子的制备:在干净的圆底烧瓶中加入氯金酸溶液,放入油浴锅中,溶液沸腾设定时间后加入柠檬酸钠溶液,提高转速,溶液颜色变成酒红色后,再继续煮沸,然后待其自然冷却到室温后,得到含金纳米粒子的分散液,低温避光保存;
S2:球形核酸报告子的制备:用TCEP活化处理FAM荧光基团修饰的巯基DNA链,将处理后的巯基DNA链与步骤1)金纳米粒子分散液按照设定的比例混合,再加入吐温20和Citrate-HCl,37℃放置过夜;然后向溶液中加入NaCl,放置过夜;最后用无酶水洗3次,洗掉多余的ssDNA,得到球形核酸报告子;
S3:滚环扩增RCA反应:将5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CAE542KM和T4连接酶混合在1×T4连接酶反应缓冲液中,进行第一次孵育,然后通过热处理灭活T4连接酶,最终获得环状DNA模板;扩增反应中,向上述反应液中加入dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液,进行第二次孵育,同样通过热处理灭火phi29酶,最终得到RCA产物;
S4:RCA-CRISPR/Cas12a切割反应:将LbCas12a蛋白和crRNA在1×NEB缓冲液中孵育,形成稳定的LbCas12a/crRNA二元复合物;然后,将LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物进行混合反应,再然后将SNA报告子加入到上述混合液中,继续反应,反应完毕后,检测反应液的荧光。
3.根据权利要求2所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,其特征在于,所述步骤S1中,氯金酸溶液的质量浓度为0.005~0.015wt%,柠檬酸钠溶液的浓度为2~4wt%,氯金酸溶液与柠檬酸钠溶液溶液的体积比为95~105:1;油浴温度为120~140℃,转速为700~900rpm;设定时间为5~15min;提高转速至1100~1300rpm;继续煮沸时间为20~40min,最终获得金纳米粒子的平均尺寸为10~15nm。
4.根据权利要求2所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,其特征在于,所述步骤S2中,FAM荧光基团修饰的巯基DNA链的核苷酸序列如序列3所示,具体为:FAM-TTTTTTTTTTTTTTT-BHQ1;处理后巯基DNA链与金纳米粒子的摩尔比490~510:1;加入吐温20至其浓度为0.01%;Citrate-HCl的浓度为0.5M,pH=7;分多次NaCl的浓度为3M,加入NaCl至反应体系中NaCl终浓度为1M。
5.根据权利要求2所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,其特征在于,所述步骤S3中,5’磷酸化线性挂锁探针的浓度为90~110nM,T4连接酶的浓度为1000U/μL,5’磷酸化线性挂锁探针、待检测的ctDNA-PIK3CAE542KM和T4连接酶的体积比为(1~3):(1~3):(0.2~0.4);第一次孵育温度为18~22℃,第一次孵育时间为18~22min;dNTP浓度为2.0~3.0mM;BSA浓度为18~22mg/mL,phi29酶浓度为8~12U/μL,5’磷酸化线性挂锁探针、dNTP、BSA、phi29酶和phi29缓冲液的体积比为(1~3):(7~9):(0.7~0.9):(0.3~0.5):(3~5);第二次孵育温度为28~32℃,第一次孵育时间为28~32min。
6.根据权利要求2所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,其特征在于,所述步骤S3中,ctDNA-PIK3CAE542KM的序列为如序列4所示,具体为:CTCAGTGATTTTAGAGAGAGGAT;获得RCA产物的序列是一个循环序列,具体为:5'-CTCAGTGATTTTAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGC TTACATACGAAATTA TAATTGTACAATAACTCAGTGATTT TAGAGAGAG GATCAATTGTACAGATG ATCTCAGGTAGCT TACATACGAAATTATAATTGTACAATAA……。
7.根据权利要求2所述的检测ctDNA的生物传感检测系统的检测方法,其特征在于,所述步骤S4中,LbCas12a蛋白和crRNA的比例为1nM:10nM;LbCas12a/crRNA二元复合物与RCA产物、SNA报告子的体积比为1:5:5;孵育温度为37℃,孵育时间为20~40min;混合反应时间为50~70min;继续反应时间为50~70min。
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