CN113686934A - 一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas12a‑RCA电化学传感器检测体系及其应用。本发明所述CRISPR/Cas12a‑RCA电化学传感器检测体系可用于大肠杆菌O157:H7的检测，操作简单，成本低廉，可以从不同的菌中准确区分出大肠杆菌O157:H7，检测特异性强；其检测浓度范围也广，在10～10⁷CFU·mL^‑1范围内具有良好的线性关系，且检测灵敏度高，最低检测限为10CFU·mL^‑1，检测结果准确可靠。本发明所述检测方法不仅适用于食品中大肠杆菌O157:H7的检测，在其他病原菌或临床诊断的检测中同样具有巨大应用潜力。

Description

一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用

技术领域

本发明属于食源性病原菌快速检测技术领域。更具体地，涉及一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用。

背景技术

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种能引起人类肠道疾病甚至死亡的食源性致病菌，因其感染剂量低，致病性强，引起广泛关注。目前检测大肠杆菌O157:H7的主要方法包括细菌分离法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法等。分子生物学方法中的生物传感器检测方法具有快速、灵敏、操作简单、对操作人员要求低等特点。

CRISPR/Cas(成簇规律间隔短回文体重复序列相关系统)是一种发现于细菌和古细菌中的适应性免疫系统，该系统主要通过靶向切割侵入性DNA序列来工作，是一种能够进行基因编辑的生物技术。此外，研究人员发现部分Cas具有“附加切割”活性，可以切割靶标核酸之外的序列，将其用于生物检测方面，并取得系列重要的研究成果。近年来，CRISPR/Cas12a在核酸检测以及开发新型核酸检测生物传感器方面表现出巨大的潜力，CRISPR/Cas12a具有在靶向核酸和单链非靶向核酸(作为报告核酸)裂解时提供信号读数的独特特性。Fan等人将CRISPR/Cas12a结合RPA，建立了一种经济、特异、超灵敏的单增李斯特菌电化学生物传感器(Li F,Ye Q,Chen M,et al.An ultrasensitive CRISPR/Cas12a basedelectrochemical biosensor for Listeria monocytogenes detection[J].Biosensorsand Bioelectronics,2021,179:113073.)。Liu等将CRISPR/Cas12a和RPA相结合，实现了对食源性致病菌荧光检测(Liu H,Wang J,Zeng H,et al.RPA-Cas12a-FS:A frontlinenucleic acid rapid detection system for food safety based on CRISPR-Cas12acombined with recombinase polymerase amplification[J].Food chemistry,2021,334:127608.)。但这些方法都需要对病原体的核酸进行提取以及核酸扩增，产生特异性DNA序列激活CRISPR/Cas12a，并酶切特异性核酸产生检测信号，检测过程相对复杂，不适用于食源性致病菌的快速检测，建立一种灵敏、简便的大肠杆菌O157:H7快速检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种操作简单、成本低廉、检测灵敏度高、特异性好的CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用。所述检测体系中的CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统能够裂解金电极上的发夹探针产生电流信号的变化，利用该检测体系可以实现食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的电化学传感快速检测。

本发明的第一个目的是提供一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系。

本发明的第二个目的是提供一种利用CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系检测大肠杆菌O157:H7的方法。

本发明的第三个目的是提供CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种可用于检测大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系，其包含大肠杆菌O157:H7抗体磁珠、CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统以及修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针；

所述CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统包含crRNA、RCA功能产物及Cas12a蛋白；其中，crRNA是利用SEQ ID NO.1所示crRNA模板和SEQ ID NO.2所示T7启动子序列合成并纯化所得；RCA功能产物是利用SEQ ID NO.3所示5'-磷酸化线性挂锁探针和SEQ ID NO.4所示连接探针先合成DNA环形探针，再通过RCA扩增反应合成所得，RCA功能产物中包含大肠杆菌O157:H7的适配体序列；

所述DNA发夹探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

在5'-磷酸化线性挂锁探针中，含有大肠杆菌O157:H7适配体序列的互补序列，通过RCA反应，在DNA聚合酶的作用下，以互补序列为模板复制出一条互补的链，这条形成的互补链即为大肠杆菌O157:H7的适配体序列。

本发明设计筛选得到的5'-磷酸化线性挂锁探针和连接探针可以将大肠适配体与可以启动酶切系统的靶标DNA结合在一起，且二者不互补，可以保证适配体序列正常发挥功能。本发明利用RCA反应，在5'-磷酸化线性挂锁探针及连接探针作用下，形成的功能性RCA产物中富含大量重复单元，包括可与大肠杆菌O157:H7特异性结合的适配体序列，以及可与crRNA特异性互补启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶活性的靶标ssDNA序列，合成得到的大量大肠杆菌适配体序列就可以与大肠杆菌表面结合，从而无需对大肠杆菌进行核酸提取即可实现大肠杆菌O157:H7的检测，使得检测过程更简便快捷。

优选地，DNA发夹探针上修饰有电化学信号分子亚甲基蓝(MB)，见实施例1。

本发明还提供一种利用CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系检测大肠杆菌O157:H7的方法，包含以下步骤：

S1.Au电极预处理后，将修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针溶于TCEP的PBS缓冲液中，通过S-Au键使修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针结合在Au电极上，滴加6-巯基-1-己醇溶液于室温避光条件下进行封闭处理；

S2.将处理过的大肠杆菌O157:H7抗体磁珠、待测样品以及RCA产物恒温孵育，在存在靶标大肠杆菌O157:H7情况下，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的三明治夹心结构，用PBS缓冲溶液清洗吸干，并用PBS缓冲液制成悬浮液，在悬浮液中加入Cas12a蛋白、crRNA及RNA酶抑制剂，室温孵育，使Cas12a蛋白、crRNA及RCA产物上的ssDNA三者结合形成CRISPR/Cas12a酶切系统；

S3.将步骤S2中反应溶液滴加在步骤S1处理好的Au电极上，孵育酶切后用电化学传感器差分脉冲伏安法响应进行检测。

发明原理：本发明利用RCA反应，在5'-磷酸化线性挂锁探针及连接探针作用下，形成的功能性RCA产物中富含大量重复单元，包括可与大肠杆菌O157:H7特异性结合的适配体序列，以及可与crRNA特异性互补启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶活性的靶标ssDNA序列，合成得到的大量大肠杆菌适配体序列就可以与大肠杆菌表面结合。

在对电化学生物传感器的Au电极进行处理后，将富含有T序列且修饰有电化学信号分子亚甲基蓝(MB)的MB-DNA发夹探针通过Au-S键固定在Au电极上，并使用MCH(6-巯基-1-己醇)封闭活性位点以减少后续检测程序中的非特异性吸附。将修饰有大肠杆菌O157:H7特异性抗体的磁珠、大肠杆菌O157:H7及提前制备好的RCA产物共同孵育，RCA产物上的适配体可与大肠杆菌O157:H7的细胞膜蛋白表面特异性结合，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的三明治夹心结构。将Cas12a蛋白及crRNA加入到制备好的三明治夹心结构中，crRNA与其在RCA产物上的靶标ssDNA结合后，启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶活性，再将混合溶液滴加在金电极上，切割金电极上MB-DNA发夹探针，使MB从电极上脱落，产生电化学信号的改变。

优选地，步骤S2中RCA产物的用量为0.5～3μL，见实施例2。

更优选地，步骤S2中RCA产物的用量为1.5～3μL，见实施例2。

优选地，步骤S2中大肠杆菌O157:H7抗体磁珠的用量为1～6μL，见实施例2。

更优选地，步骤S2中大肠杆菌O157:H7抗体磁珠的用量为4～6μL，见实施例2。

优选地，步骤S2中“抗体-靶标-RCA产物”的孵育时间为20～120min，见实施例2。

更优选地，步骤S4中“抗体-靶标-RCA产物”的孵育时间为80～120min，见实施例2。

优选地，步骤S2中Cas12a的使用浓度为150～350nM，见实施例2。

更优选地，步骤S2中Cas12a的使用浓度为250～350nM，见实施例2。

优选地，步骤S2中crRNA的使用浓度为50～300nM，见实施例2。

更优选地，步骤S4中crRNA的使用浓度为150～300nM，见实施例2。

优选地，步骤S2中CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间为20～70min，见实施例2。

更优选地，步骤S4中CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间为40～70min，见实施例2。

优选地，步骤S4中所述电化学传感器差分脉冲伏安法(DPV)测量在20mM PBS缓冲液(50mMNaCl，2.5mM MgCl₂，pH 7.4)中进行，振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s，电压在-0.5V～-0.1V范围，见实施例2。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统信号放大技术来测定食源性致病菌大肠杆菌O157:H7，CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统具有核酸内切酶活性，其具有以下优点：

(1)本发明所述CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系的检测特异性好，可从同类大肠杆菌中准确区分出大肠杆菌O157:H7，检测浓度范围广，在10～10⁷CFU·mL^-1范围内具有良好的线性关系，且检测灵敏度高，其最低检测限为10CFU·mL^-1，检测结果准确可靠；

(2)本发明所述CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统电化学传感器采用“一步法”完成，无需对病原体的核酸进行提取，不仅大大缩短了检测的时间，而且避免了反复洗涤的过程，实现了简单易操作；

(3)本发明所述CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统利用RCA技术可以大量扩增与crRNA结合的靶标ssDNA的RCA产物，放大CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶效率，提高酶切产生的信号强度，可以有效增加检测的灵敏度，通过电化学信号响应变化定性定量的分析样品中的大肠杆菌O157:H7；

(4)本发明所述利用CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系检测大肠杆菌O157:H7的方法具有检测成本低、检测时间短、所需检测样品用量小等优势，可实现低浓度食源性致病菌-大肠杆菌O157:H7的分析检测；

(5)本发明所述检测方法通过大肠杆菌O157:H7抗体磁珠对大肠杆菌O157:H7进行分离，消除了复杂环境的干扰，可以成功运用于实际样品中大肠杆菌O157:H7的检测，且无需进行任何前期处理；

(6)本发明所述检测方法不仅适用于食品中大肠杆菌O157:H7的检测，在其他病原菌或临床诊断的检测中同样具有巨大应用潜力。

附图说明

图1为CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统的大肠杆菌O157:H7电化学检测原理图。

图2为RCA产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为CV和EIS测量不同处理阶段的Au电极获得的生物传感器响应结果，其中图A为CV的测量结果，图B为EIS的测量结果，图B中的a对应裸Au电极，b对应MB-DNA/MCH/靶标修饰电极，c对应MB-DNA修饰电极，d对应MB-DNA/MCH修饰电极。

图4为EIS测量不同处理阶段的Au电极以及ZSimpWin软件计算的的相对应拟合曲线，红色曲线为EIS测量结果，绿色曲线为拟合曲线，其中图A对应裸Au电极，图B对应MB-DNA/MCH/靶标修饰电极，图C对应MB-DNA修饰电极，图D对应MB-DNA/MCH修饰电极。

图5为电化学生物传感器可行性的分析检测结果，其中曲线a对应Au/MB-DNA/MCH/PBS/Cas12a/crRNA，曲线b对应Au/MB-DNA/MCH/大肠杆菌O157:H7/Cas12a，曲线c对应Au/MB-DNA/MCH/大肠杆菌O157:H7/crRNA，曲线d对应Au/MB-DNA/MCH/大肠杆菌O157:H7/Cas12a/crRNA。

图6为电化学传感检测条件优化结果，其中图A对应酶切时间，图B对应孵育时间，图C对应磁珠用量，图D对应RCA产物用量，图E对应Cas12a的浓度，图F对应crRNA的浓度。

图7为电化学生物传感器的灵敏度检测结果，其中图A为电化学生物传感器对不同浓度大肠杆菌O157:H7的DPV响应结果，图B为DPV的阴阳酶切电流响应率与大肠杆菌O157:H7的标准曲线。

图8为电化学生物传感器的特异性检测结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明中所涉及的食源性致病菌菌株，包括大肠杆菌O157:H7(CICC 21530)、大肠杆菌(CICC 10389)、鼠伤寒沙门氏菌(CCICC 21482)、金黄色葡萄球菌(CICC 21600)、单核细胞增生李斯特菌(CICC 21529)和副溶血性弧菌(CICC 21617)均由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

实施例1电化学传感检测所需试剂的制备及其可行性分析

本发明的发明原理如图1所示，其是利用RCA反应，在5'-磷酸化线性挂锁探针及连接探针作用下，形成功能性RCA产物，其中富含有大量重复单元可与大肠杆菌O157:H7特异性结合的适配体序列以及与crRNA特异性互补启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶活性的靶标ssDNA序列。

在对电化学生物传感器的Au电极进行处理后，将富含有T序列且修饰有电化学信号分子亚甲基蓝(MB)的MB-DNA发夹探针通过Au-S键固定在Au电极上，并使用MCH(6-巯基-1-己醇)封闭活性位点以减少后续检测程序中的非特异性吸附。将修饰有大肠杆菌O157:H7特异性抗体的磁珠、大肠杆菌O157:H7及提前制备好的RCA产物共同孵育，RCA产物上的适配体可与大肠杆菌O157:H7的细胞膜蛋白表面特异性结合，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的三明治夹心结构。将Cas12a蛋白及crRNA加入到制备好的三明治夹心结构中，crRNA与其在RCA产物上的靶标ssDNA结合后，启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统核酸内切酶活性，再将混合溶液滴加在金电极上，切割金电极上MB-DNA发夹探针，使MB从电极上脱落，产生电化学信号的改变。

基于上述电化学传感器检测体系，本发明设计并合成了制备电化学传感检测体系试剂所需的核苷酸序列，如表1所示，序列均交由上海生工生物工程股份有限公司合成。未标记的引物采用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)纯化法纯化，而标记的引物采用高效液相色谱(HPLC)纯化法纯化。

表1核苷酸序列

表1中，crRNA模板序列的下划线部分是与T7启动子的互补序列。5'-磷酸化线性挂锁探针的下划线的部分是与连接探针的互补序列，斜体部分为大肠杆菌O157:H7特异性识别适配体序列的互补序列，通过RCA反应，在DNA聚合酶的作用下，以斜线部分为模板复制出一条互补的链，这条形成的互补链即为大肠杆菌O157:H7的适配体序列。MB-DNA序列中的加粗部分为MB-DNA发夹的互补区，可以使一条DNA形成发夹结构。

1、CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统的制备

CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统包含crRNA、RCA功能产物及Cas12a蛋白。

(1)RCA功能产物的制备

35.5μL RCA杂交缓冲溶液(20mMTris-HCl，100mMNaCl，4mM MgCl₂，pH 8.0)中加入5'-磷酸化线性挂锁探针(终浓度0.1～1μM)与连接探针(终浓度0.1～1.2μM)，在95℃下孵育5～20min，55℃下孵育30～90h，缓慢冷却至室温，随后使用T4 DNA连接酶进行连接反应。向上述缓冲溶液中加入5μL 2×T4 DNA连接酶缓冲溶液和10U T4 DNA连接酶，16℃条件下孵育12-24h，连接挂锁探针缺口，并在65℃条件下加热5-20min以失活T4 DNA连接酶。

RCA扩增反应：

Phi29 DNA聚合酶或Bst聚合酶等进行RCA扩增反应，在制备所得的DNA环形探针溶液中加入dNTPs(终浓度1-5mM，每个dNTP加2μL)、2μL 20U Phi29 DNA聚合酶，5μL 2×Phi29DNA聚合酶的反应缓冲液(连接酶自带的溶液，原溶液是10×的用超纯水稀释成2×溶液)及33μL无酶水，共100μL，在30℃条件下下孵育24h，在65℃下加热10min以灭活Phi29 DNA聚合酶，得到大量RCA产物。

将RCA产物与等体积无酶水混合，保存在4℃下直至使用。

RCA产物的验证：制备得到的RCA产物用琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图2所示，其中M为5000bp DNA marker，泳道1使用RCA缓冲溶液替代引物作为空白对照，无任何RCA产物条带出现，泳道2的初始位置有一个明亮且清晰的条带，这是具有大分子质量的RCA功能产物，结果表明RCA产物是由引物链触发，排除缓冲溶液的干扰。

(2)crRNA的合成与纯化

crRNA合成需使用crRNA模板和T7启动子序列。

crRNA的合成：将crRNA模板与T7启动子序列干粉置于离心机中，室温下4 000rpm离心60s，用超纯水稀释至100μM，存放于4℃冰箱待用；使用HiScribe^TMT7快速高产RNA合成试剂盒合成crRNA，在无酶的离心管中分别加入2μL 100μM的crRNA模板与T7启动子序列，以及14μL无酶水，置于PCR仪中95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温；在上述溶液中加入2μL T7RNA聚合酶，10μL NTP Buffer Mix，37℃下孵育16h，在T7 RNA聚合酶的作用下由crRNA模板转录成crRNA；在反应溶液中加入68μL无酶水和2μL DNase I酶，共100μL体系，37℃下孵育15min。

crRNA的纯化参照

RNA纯化试剂盒进行。

2、Au电极的预处理及修饰

首先，将Au电极在新鲜的食人鱼溶液(浓H₂SO₄/30％过氧化氢，V:V＝3:1)中处理10～60min，用超纯水彻底洗涤以去除表面上修饰的核酸等有机物；然后抛光，直至获得光滑的镜面电极。用无水乙醇和超纯水依次超声处理Au电极2～10min，以除去电极表面的杂质；在0.5M H₂SO₄溶液中进行循环电位扫描，直到获得稳定的Au电极伏安峰；最后，用超纯水浸泡的脱脂棉擦拭电极，并用高纯度氮气吹干。

将亚甲基蓝(MB)标记的DNA发夹探针(MB-DNA)溶解于10mM TCEP中，并在室温黑暗条件下放置1h以减少二硫键，然后取10μL处理好的MB-DNA探针滴在Au电极表面，并在室温黑暗下孵育12h，MB-DNA探针与Au通过S-Au键结合在Au电极上，用超纯水冲洗后，将电极滴入1mM MCH溶液室温黑暗处理1h，以封闭电极表面未占用位置并消除非特异性吸附的影响。最后，用超纯水彻底冲洗，置于室温黑暗中备用。

本发明采用传统的三电极系统，其中以Au电极作为工作电极，以铂丝作为辅助电极，以Ag/AgCl电极作为参比电极。通过电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安法(CV)的响应来评估传感器界面的修饰情况。CV和EIS测量的电解液在含有5mM[Fe(CN)6]^3-/4-0.1M KCl中进行，CV测量的电位范围为-0.2V～0.6V，扫描速率为50mV·s^-1。EIS测量的频率范围为0.1Hz～100kHz，幅度为5mV。

本发明对不同处理阶段的Au电极都进行了测量，结果如图3所示，其中图3A为CV的测量结果，图3B为EIS的测量结果。图3B中的a对应裸露Au电极，b对应MB-DNA/MCH/靶标修饰电极，c对应MB-DNA修饰电极，d对应MB-DNA/MCH修饰电极。

由图3A可知，裸Au电极具有[Fe(CN)6]^3-/4-的典型氧化还原峰(曲线a)；表明传感界面具有高效的电子转移能力。当将MB-DNA孵育到金电极后，在电极表面形成带负电荷的DNA单层阻碍了电子介体向电极表面的扩散，氧化还原峰显着降低(曲线c)；加入MCH阻断时，观察到氧化还原峰进一步降低(曲线d)；将CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统滴加在电极表面后，MB-DNA从金电极上脱落下，导致电活性位点暴露，因此氧化还原峰的电流增加(曲线b)。

图3B中EIS测量的结果与CV的结果一致，通过ZSimpWin软件中，Randles等效电路(图3B中的插图)，将EIS所得的阻抗响应进行拟和，得到等效电路四个元件的电参数，分别为电荷转移的电阻(Rct)、电解质的电阻(Rs)、Warburg的阻抗(Zw)、恒定相的电容(CPE)。从结果看出测量数据与拟合曲线之间具有良好的拟合性，如图4所示，表明该等效电路适合于本电化学生物传感器。

表2列出了等效电路中四个元件的电参数值。在奈奎斯特图中，高频区域的圆弧代表电子转移限制，其直径代表电荷转移电阻(Rct)；低频区域中具有45°相角的直线表示电解质扩散限制，反映在Warburg阻抗(Zw)的大小。如图3B所示，裸Au电极(曲线a)的Rct值较低，约为122.3Ω，表明金电极表面具有良好的电荷转移能力；将MB-DNA通过Au-S键修饰到电极上，阻抗电弧的直径显着增大(曲线c)，Rct值达到13050Ω，表明MB-DNA已成功固定到电极表面；将MCH孵育在电极上，半圆的直径继续增大(曲线d)，Rct值变为约17130Ω，这表明MCH封闭了电极的未结合位点从而导致了电荷转移限制；将CRISPR/Cas12a蛋白、crRNA及制备好的夹心结构滴加在电极后，电弧直径变小(曲线b)，Rct值约为3699Ω。

上述结果表明，启动后的CRISPR/Cas12a系统的具有ssDNase活性，可以切割金电极表面的MB-DNA，使MB从金电极上脱落下来，从而增加了电子探针在界面处的扩散和电子传递。这些结果表明该电化学传感器已按照设计的试验方案进行，可发挥其工作功能，数据整理见表2。

表2电化学阻抗谱拟合等效电路元件的电参数值

Rct：电荷转移电阻；Rs是工作电极和参比电极之间的电解质电阻；Zw反映了离子从电解质溶液到界面的扩散；CPE(Yo和n分别是恒定相元件的非零实数分量，分别对应于能量耗散和表面异质性。)反映了电极表面的非理想状态。

3、CRISPR/Cas12a-RCA电化学生物传感器的可行性分析

(1)大肠杆菌O157:H7抗体磁珠的预处理：每次试验前将抗体磁珠用等体积的1mM的PBS缓冲溶液洗涤至少三次，洗涤结束后用等体积的缓冲溶液悬浮备用；

(2)将4μL磁珠、50μL大肠杆菌O157:H7及2μL RCA产物加入PCR管中，于37℃条件下孵育100min，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的三明治夹心结构，用50μL0.1～10mM的PBS缓冲溶液洗涤四次，最后用5μL0.1～10mM的PBS缓冲溶液悬浮备用；

(3)将4μL 300μM Cas12a、4μL 200μM crRNA及2μL 2U RNA酶抑制剂与步骤(2)中悬浮溶液混合，室温下孵育15min，使Cas12a蛋白、crRNA及RCA产物上的ssDNA三者结合形成CRISPR/Cas12a酶切系统；

(4)将上述步骤(3)中孵育的CRISPR/Cas12a酶切系统溶液滴加在处理好的Au电极上，37℃条件下孵育酶切60min，即可应用电化学传感器差分脉冲伏安法(DPV)响应进行检测。

DPV测量在20mM PBS缓冲液(50mM NaCl，2.5mM MgCl2，pH 7.4)中进行，振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s，电压在-0.5V～-0.1V范围。

所述电化学生物传感器的可行性分析结果如图5所示。在不存在靶标大肠杆菌O157:H7时，抗体磁珠无法与RCA产物结合形成三明治夹心结构，没有与crRNA互补，启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统的靶标ssDNA，加入crRNA及Cas12a后，无法切割金电极上的MB-DNA，DPV曲线中的-0.3V附近出现了明显的峰值电流(曲线a)；在存在靶标大肠杆菌O157:H7时，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的“夹心结构”，加入Cas12a但不加入crRNA时，没有启动CRISPR/Cas12a酶切系统，无法切割金电极上的MB-DNA，DPV曲线仍有明显的峰值电流(曲线b)；同理，加入crRNA但不加入Cas12a时，DPV曲线依旧有明显的峰值电流(曲线c)；当将crRNA及Cas12a共同加入该传感器后，启动CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统，切割金电极上的MB-DNA，DPV曲线的峰值电流极具下降(曲线d)；基于上述结果，可以确定本发明所述传感器必须在大肠杆菌O157:H7靶标、crRNA以及Cas12a同时存在的情况下才能启动，上述结果也表明，可以将该传感平台用于大肠杆菌O157:H7检测。

实施例2电化学传感检测条件的优化

本发明研究过程中发现，抗体磁珠与靶标-大肠杆菌O157:H7以及RCA产物三者形成夹心结构的孵育时间以及CRISPR/Cas12a酶切的孵育时间对CRISPR/Cas12a-RCA电化学生物传感器的检测效果会有影响。由于抗体磁珠与RCA产物浓度过高会发生非特异的偶联现象，使阴性造成一定的假阳性，RCA产物的用量与后续CRISPR/Cas12a酶切系统也有影响。因此，在确定方法的可行性后，还需寻找抗体磁珠与RCA产物的最佳检测用量，最后对CRISPR/Cas12a酶切系统中重要的Cas12a及crRNA的浓度进行优化。本发明根据阴阳酶切电流响应率进行试验条件优化，计算公式如下：ΔI％＝[(In_阴性–In_阳性)/In_阴性]×100％，结果数据均进行3次重复。

1、CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间的优化

MB-DNA作为本发明电化学检测传感平台的信号输出，通过其信号响应来分析靶标大肠杆菌O157:H7的含量，而CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间直接影响MB-DNA信号值的响应。因此，本发明首先对CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间进行了优化。

本发明选择了6个酶切时间，即20、30、40、50、60和70min，对最优酶切时间进行探索。结果如图6A所示，随着酶切时间的增加，ΔI％的值也随之增加，当酶切时间达到60min后，ΔI％基本不变且达到90％以上。

2、大肠杆菌O157:H7孵育时间的优化

靶标大肠杆菌O157:H7的孵育时间影响“抗体-靶标-RCA产物”夹心结构的结合效率。在CRISPR/Cas12a酶切系统的最优酶切时间条件下，选择6个孵育时间，分别为20、40、60、80、100和120min，进行孵育时间的优化探索。结果如图6B所示，ΔI％随着孵育时间的增加而增加，当孵育时间为100min时，ΔI％达到最大响应，且响应率为90％以上。

3、抗体磁珠的用量优化

磁珠的用量直接影响检测中抗体的含量，故对抗体磁珠的用量也需进行优化。本发明在最佳酶切时间和孵育时间条件下对磁珠用量进行了优化，设置了6个磁珠用量选择梯度，分别为1、2、3、4、5和6μL，进行磁珠最佳用量的优化探索。结果如图6C所示，随着磁珠用量的增加，ΔI％也随之增加，当磁珠用量为4μL以后，ΔI％基本不变，酶切响应率达已到90％以上。

4、RCA产物用量的优化

RCA产物中的ssDNA序列可以与CRISPR/Cas12a酶切系统中的crRNA互补，两者的结合会影响后续切割MB-DNA探针信号值的响应。本发明在优化的最佳酶切时间、孵育时间及磁珠用量条件下，设置了6个RCA产物用量，分别为0.5、1、1.5、2、2.5和3μL，进行RCA产物最佳用量的优化探索。结果如图6D所示，随着RCA产物量的增加，ΔI％也随着增加，当RCA产物用量达到2μL后，ΔI％基本不变且达到90％以上。

5、Cas12a使用浓度的优化

Cas12a作为CRISPR/Cas12a酶切系统中不可缺少的部分，只有当Cas12a、crRNA与靶标ssDNA三者都存在时才能启动酶切系统，Cas12a浓度对MB-DNA探针信号值的响应有极大的影响。本发明在最佳酶切时间、孵育时间、磁珠用量及RCA产物用量的条件下，将Cas12a浓度设置5个梯度，分别为150、200、250、300和350nM，进行优化探索。结果如图6E所示，随着Cas12a浓度的增加，ΔI％也随着增加，当Cas12a的浓度为300nM时，ΔI％达到90％以上，检测效果好。

6、crRNA使用浓度的优化

crRNA作为CRISPR/Cas12a酶切系统中不可缺少的部分直接影响MB-DNA探针信号值的响应。本发明在最佳酶切时间、孵育时间、磁珠用量、RCA产物用量及Cas12a浓度条件下，将crRNA浓度设置6个梯度，分别为50、100、150、200、250和300nM，进行优化探索。结果如图6F所示，随着crRNA浓度的增加，ΔI％也随之增加，当Cas12a的浓度达到200nM时，ΔI％达到90％以上，且基本不变。

实施例3电化学传感检测灵敏度及特异性分析

在所优化的最佳试验条件下，本发明利用DPV响应对电化学传感器的灵敏度进行了分析，将大肠杆菌O157:H7按照10倍梯度稀释成10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷CFU·mL^-1。结果如图7所示，图7A显示了DPV信号与大肠杆菌O157:H7浓度对数之间对应关系，由图可知，氧化峰值电流随着靶标菌浓度的增加而减小。图7B的结果表明DPV响应的ΔI％与靶标菌浓度(对数标度)在10～10⁷CFU·mL^-1范围内存在良好的线性关系(R²＝0.9942)，对应的回归方程为Y＝10.71X+18.90，其中Y和X分别代表了ΔI％和大肠杆菌O157:H7浓度的对数，本发明所构建的大肠杆菌O157:H7电化学传感检测方法的最低检测限为10CFU·mL^-1。

本发明还用不同菌属的E.coli O157:H7、E.coli、Sal.t、S.Aur、List.m及Vibiro.p菌株，测试了电化学生物传感器系统DPV响应的ΔI％，以此评估该方法的特异性。结果如图8所示，由图8可知，10⁶CFU·mL^-1靶标菌引发了强烈的ΔI％，而10⁶CFU·mL^{- 1}E.coli、Sal.t、S.Aur、List.m及Vibiro.p对应的ΔI％的平均值低于20％，低于靶标菌的最低检测限，表明该方法可以特异性的从不同菌属病原菌中区分出大肠杆菌O157:H7中区分出大肠杆菌O157:H7，该电化学适配体传感器对病原性大肠杆菌O157:H7具有很高的特异性。

实施例4实际样品检测

为了评估该方法在实际样品检测中的适用性，使用脱脂奶粉样品进行了回收试验检测，该样品添加了浓度为10³、10⁴和10⁵CFU·mL^-1的大肠杆菌O157:H7，该方法的回收率从93±4.23％到109±1.56％(表3)，结果表明，该生物传感器平台可为初步的实际应用提供可行和可靠的病原细菌测量。

表3脱脂奶粉样品中大肠杆菌O157:H7的检测

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东海洋大学

广东海洋大学深圳研究院

<120> 一种CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcttgtatt cccagcgtgc gccatctaca cttagtagaa attaccctat agtgagtcgt 60

attaatttc 69

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 3

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgggaatac aagcaaaata tgccctcggt tgtggtatta tacggcattc ctctccggac 60

aaccctcgcg gcatctcgtc cacactgcct aaaggcgcac g 101

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgcttgtatt cccagcgtgc gcc 23

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagcgttcc tttaccattt ttttaactta tttggttttt ttttt 45

Claims (10)

1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系，其特征在于，包含大肠杆菌O157:H7抗体磁珠、CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统以及修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针；

所述CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统包含crRNA、RCA功能产物及Cas12a蛋白，其中，crRNA是利用SEQ ID NO.1所示crRNA模板和SEQ ID NO.2所示T7启动子序列合成并纯化所得；RCA功能产物是利用SEQ ID NO.3所示5'-磷酸化线性挂锁探针和SEQ ID NO.4所示连接探针先合成DNA环形探针，再通过RCA扩增反应合成所得，RCA功能产物中包含大肠杆菌O157:H7的适配体序列；

所述DNA发夹探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

2.根据权利要求1所述电化学传感器检测体系，其特征在于，所述DNA发夹探针上修饰有电化学信号分子亚甲基蓝。

3.一种利用CRISPR/Cas12a-RCA电化学传感器检测体系检测大肠杆菌O157:H7的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.Au电极预处理后，将修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针溶于TCEP的PBS缓冲液中，通过S-Au键使修饰有电化学信号分子的DNA发夹探针结合在Au电极上，滴加6-巯基-1-己醇溶液于室温避光条件下进行封闭处理；

S2.将处理过的大肠杆菌O157:H7抗体磁珠、待测样品以及RCA产物恒温孵育，在存在靶标大肠杆菌O157:H7情况下，形成“磁珠-靶标-RCA产物”结合的三明治夹心结构，用PBS缓冲溶液清洗吸干，并用PBS缓冲液制成悬浮液，在悬浮液中加入Cas12a蛋白、crRNA及RNA酶抑制剂，室温孵育，使Cas12a蛋白、crRNA及RCA产物上的ssDNA三者结合形成CRISPR/Cas12a酶切系统；

S3.将步骤S2中反应溶液滴加在步骤S1处理好的Au电极上，孵育酶切后用电化学传感器差分脉冲伏安法响应进行检测。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述CRISPR/Cas12a-RCA酶切系统中RCA产物的用量为0.5～3μL。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中大肠杆菌O157:H7抗体磁珠的用量为1～6μL。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中“抗体-靶标-RCA产物”的孵育时间为20～120min。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中Cas12a的使用浓度为150～350nM。

8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中crRNA的使用浓度为50～300nM。

9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S3中CRISPR/Cas12a酶切系统的酶切时间为20～70min。

10.权利要求1或2任一所述电化学传感器检测体系在检测大肠杆菌O157:H7或制备检测大肠杆菌O157:H7的产品中的应用。

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