CN110218802A - 一种检测呼吸道病原体核酸的方法 - Google Patents

一种检测呼吸道病原体核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测呼吸道病原体核酸的方法。本发明研究得到基于CRISPR/Cas12a技术检测3种呼吸道病原的特异性核酸序列位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现这3种病原的定性检测，能特异性区分这3种病原的不同型别；并构建了基于CRISPR/Cas12a的呼吸道病原核酸检测检测系统和检测试剂盒。该技术对呼吸道病原核酸检测特异性好、灵敏度高，还能够实现多位点同时检测，同时该技术可在室温下进行，操作方便快捷，检测成本低，对于呼吸道病原的检测与筛查具有重要的意义，应用前景好。

Description

一种检测呼吸道病原体核酸的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种检测呼吸道病原体核酸的方法。
背景技术
呼吸道感染性疾病常急性起病，以干咳、胸闷、呼吸困难等呼吸道症状为主要表现，并可伴有乏力、头痛、肌肉关节酸痛等全身症状，是全球发病和死亡的第二大常见病因。呼吸道病原诊断方法有镜检、细菌培养、抗原抗体检测、生化反应、分子生物学方法等。常用的诊断方法往往是基于经验判断或是单个病原体的检测，基于症候群的常见病原整体检测的产品很少。呼吸道常见感染病原菌有：分枝杆菌复合群(Mycobacterium complex，MC)，百日咳博德特菌(Bordetella pertussis,BP)，肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae,CP)。为实现呼吸道传染病的早期检测并控制其传播风险，开发低成本、准确、高效、快速地检测呼吸道传染病病原的诊断方法非常重要。
经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临床微生物实验室中使用的一般方法，如病原体分离培养，特别是对于病原微生物和病毒的分离培养，是早期的病原体金标准鉴定技术。该方法存在对的问题主要有：分离培养耗时长，往往需要几天时间，无法实现短时间内迅速得到检测结果，且必须高度依赖检测实验室硬件及实验操作人员条件，且不适用于目前未有成熟培养手段的病原微生物和病毒的检测。(2)免疫学检测：以基于抗原-抗体的免疫反应，识别病原相关蛋白，从蛋白水平对病原体进行检测。该方法存在检测灵敏度较低，且特异性受环境等影响较大，检测的窗口期较长，无法满足诊疗需求，仅适用于初筛而不能作为及时确诊的依据，不能够识别同一类病原的不同亚型等问题。
基于分子的诊断方法可以提高检测抗性基因的速度和准确性，这对医院和社区环境中的感染控制、预防、治疗很有意义。目前分子诊断方法主要是聚合酶链反应(PCR)：包括普通PCR、等位基因特异性PCR、实时荧光定量PCR、PCR-Sanger测序技术、PCR-基因芯片技术等。PCR是从核酸水平对病原体进行检测，整个实验需要1～2小时完成。该方法的主要缺点在于进行PCR检测时需要依赖PCR仪或昂贵的实时定量PCR仪，及其它多种配套设备，以及专门的PCR实验室和专业操作人员。PCR检测无法实现即时检验、床旁诊断和无特定实验室检测条件的场景应用，因此无法满足基层、用户终端、现场的检验需求。同时，PCR检测可能存在假阳性和灵敏度不足等问题。
目前，基于CRISPR/Cas蛋白系统的基因检测、编辑显示出了较好的应用前景。然而正如合适靶标寻找并设计制备出精确、特异性靶向目标基因的gRNA是CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术，合适靶标以及高效、特异性靶向gRNA也是基于CRISPR/Cas12a实现基因检测的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有呼吸道病原检测技术的缺陷和不足，研究发现一系列基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点，针对该系列位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现呼吸道病原的核酸检测；并基于此构建了一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原的检测方法及检测试剂盒。
本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点及gRNA组合。
本发明另一目的是提供一套针对3种呼吸道病原的CRISPR/Cas12a检测系统。
本发明再一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸的检测方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究得到一组基于CRISPR/Cas12a系统的3种呼吸道病原核酸检测靶标位点，针对该位点可进行基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高。
所述3种呼吸道病原核酸检测靶标位点的序列如SEQ ID NO.1-17任一所示。该靶标位点能特异性区分3种呼吸道病原的不同型别且包含Cas12a识别的PAM序列。
同时所述靶标位点在作为呼吸道病原核酸检测位点方面的应用，以及作为基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
基于上述研究成果，本发明还提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原检测方法，是利用CRISPR/Cas12a系统检测上述靶标位点。
具体是利用Cas12a蛋白和对应所述靶标位点的gRNA进行CRISPR核酸检测。
所述gRNA的设计原则为：在选取gRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。
作为优选的可选择方案，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.18-55任一或任几个所示。该gRNA组合也应在本发明的保护范围之内。
同时本发明还提供一种呼吸道病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统或试剂盒，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA的序列对应于SEQ ID NO.1-17任一所示靶标位点。优选地，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.18-55任一或任几个所示。
另外，上述Cas12a蛋白为具有核酸内切酶活性且具有附属切割活性的Cas12a蛋白。比如LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a、AsCas12a等。
所述ScCas12a的序列如SEQ ID NO.56所示，所述SsCas12a的序列如SEQ ID NO.57所示，所述LbCas12a的序列参照Addgene号pMAL-his-LbCpf1-EC(Plasmid#79008)，FnCas12a的序列参照Addgene号6-His-MBP-TEV-FnCpf1(Plasmid#90094)、AsCas12a的序列参照Addgene号AsCpf1-2NLS(Plasmid#102565)。
本发明的检测方案可以针对分枝杆菌复合群(Mycobacterium complex，MC)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis,BP)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae,CP)特异性区分这3种病原的不同型别，同时实现多重检测，可用于呼吸道相关病原的检测筛查。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究发现了基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测靶标位点，针对该位点利用CRISPR/Cas12a系统可实现呼吸道病原核酸检测，检测特异性好、灵敏度高，可在25-37℃的室温下实现高灵敏、高精度的分子检测，具有更好的特异性和兼容性，检测成本低廉、操作方便、快捷。检测限值可达到阿摩尔级(10-18摩尔/L)，实现靶标单分子检测，能特异性区分这3种病原的不同型别；同时还能实现多位点同时检测，临床检测效果优异，对于呼吸道病原的检测与筛查具有重要的意义。
附图说明
图1-3为LbCas12a对3种呼吸道病原的不同gRNA检测效果。
图1为实施例2中对分枝杆菌复合群(MC)的不同靶标位点的gRNA检测效果。
图2为实施例2中对百日咳博德特菌(BP)的不同靶标位点的gRNA检测效果。
图3为实施例2中对肺炎衣原体(CP)的不同靶标位点的gRNA检测效果。
图4为实施例4中8例结核分枝杆菌阳性的临床样本的检测效果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》(PCR 2:A PRACTICALAPPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
实施例1基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测位点的发现
本研究针对的呼吸道常见感染病原菌是分枝杆菌复合群(Mycobacteriumcomplex)，百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)，肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)。我们获取这3种呼吸道病原基因组序列，通过生物信息学分析比对，寻找3种病原各株型的特异性鉴定区域。具体操作方法如下，在NCBI核酸序列库查找这3种病原的全基因组序列，获取其现有的所有全基因组序列并根据序列完整度筛选出参考基因组；对上述基因组序列进行同源性分析，寻找该病原在不同基因组序列间保守但相对于人基因组(hg19)特异性的靶标基因序列。以20bp碱基为单位，在上述序列中搜寻含有“TTTN”的序列并导出相关序列做为gRNA靶向序列的备选数据库。
通过评估相关病原靶点不同的型别差异，备选gRNA序列在不同菌株间的特异性，备选gRNA序列的GC含量、碱基均一性、序列保守性等系列参数，并经过大量的实验，针对不同区域设计gRNA并构建CRISPR/Cas12a系统进行研究，最终确认得到这3种病原的特异的鉴定靶标区域，序列如SEQ ID NO.1-17所示。，以SEQ ID NO.18-55所示序列为基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测gRNA，所得检测方案均具有很好的检测效果(表1)。
表1基于CRISPR/Cas12a呼吸道病原核酸检测的靶标基因及对应的gRNA靶向序列
实施例2基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原核酸检测案例
1、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达
采用源自Lachnospiraceae bacterium的Cas12a蛋白基因，经过密码子优化，使基因更适合在哺乳动物细胞中表达。优化后的Cas12a蛋白基因克隆入带6-His组氨酸标签的pET28a质粒，方便蛋白纯化表达。Cas12a蛋白重组表达载体转化，表达菌采用BL21star(DE3)。
具体蛋白表达条件为：在培养菌液OD600＝0.6时加入0.5mMIPTG培养4小时。收集菌体进行蛋白纯化。纯化条件为：将菌体重悬于裂解液(50mM Tris,pH8.0，300mM NaCl，5％甘油，20mM咪唑)，进行超声破碎(70％振幅，2s On/4s Off，3分钟，Sonics 750w超声仪)，离心分离上清液，以镍柱纯化，以含250mM咪唑的裂解液洗脱，浓缩洗脱组分，以Superdex 200，Tricorn 10/300凝胶色谱柱进行纯化。SDS-PAGE检测以及凝胶柱纯化，获得的纯化后的Cas12a蛋白，放-80℃保存。
2、制备靶标DNA
靶核苷酸可经过PCR扩增、重组酶聚合酶扩增(RPA)，NASBA等温扩增、或环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)方式扩增靶标DNA。
重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)：采用NCBIPrimer blast设计RPA引物，扩增片段大小为80-120nt，引物的变性温度可为54-67℃、Opt＝60，长度为30-35nt、Opt＝32，引物中GC含量为40-60％，根据设计序列合成DNA引物。
模版序列为实施例1中SEQ ID NO.1所示(来源于结核分枝杆菌基因组序列)。
其中RPA引物包括：
FP:TGTTGTGGGTGGCCTTTCATAGAACTGCGA
RP:AACGCAGAACAGGACGGTAGTGTTCAACAC
分别参考Basic和BasicRT(TwistDx)试剂盒进行RPA反应，不同的是，在模板片段加入之前，先加入280mM的MgAc，即乙酸镁。在37℃下反应30分钟。采用MinElute gel extraction kit(Qiagen)试剂盒纯化后获得靶标DNA。
3、制备gRNA
gRNA引物序列设计原则：选取靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTTN-3’序列；且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。可通过http://www.rgenome.net/cas-designer/在线软件辅助设计。
gRNA引物结构：
5’-靶向序列-“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”-CCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3’
其中“ATCTACACTTAGTAGAAATTA”序列可替换为“ATCTACAACAGTAGAAATTA”或“ATCTACAACAGTAGAAATTA”或“ATCTACAACAGTAGAAATTA”或“GCATGAGAACCATGCATTTC”或“ACCTAATTACTAGGTAATTT”或“ATCTACAAAAGTAGAAATCC”或“ATCTACAATAGTAGAAATTA”或“ATCTACAAAGTAGAAATTAT”或“ATCTACAAACAGTAGAAATT”。
参照T7RNApolymerase kit(Thermo)试剂盒说明书，将带T7启动子的DNA片段、T7引物、T7聚合酶混合，37℃孵育过夜；再采用RNeasy mini kit(Qiagen)，获得纯化的gRNAs。
T7引物序列：TGTAATACGACTCACTATAGGG
T7 gRNA引物序列：
“靶向序列”-5’-ATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3’
靶向序列包括：SEQ ID NO.18-55
4、单重CRISPR/Cas12a病原检测体系的有效性验证
检测体系包括：2μl RPA产物，45nM纯化的LbCas12a，22.5nM gRNA，100nM在LbCas12a切割时可发出荧光的报告DNA链，即非特异单链DNA荧光探针(DNAseAlert QCSystem,Thermo Scientific)，0.5μl RNase抑制剂(Promega)，及核酸酶检测缓冲液(20mMTris,60mM NaCl,10mM MgCl 2,pH 7.3)。反应体系置于荧光分析仪(BioTek)，在37℃(除非另有说明)下反应30min，取终末荧光值进行结果判读。
分析CRISPR/Cas12a反应荧光数据：为了计算去除背景的荧光数据，方便不同条件之间的比较，样品的初始荧光被去除。背景荧光(无靶核苷酸或无gRNA的条件下)会从样品中去除，从而获得扣除背景荧光的数据。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性，小于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阴性。检测结果如图1-3所示，结果表明：所述Cas12a蛋白和所设计的gRNA可识别切割靶标位点并产生荧光信号，说明设计的gRNA序列可特异性识别相关的病原靶标序列，可用于相关病原的定性检测。
5、单重CRISPR/Cas12a检测体系的特异性验证
设置3组实验，取3种不同靶标基因的RPA产物，分别选择与其对应的一种gRNA和两种不相关gRNA进行组合反应，验证gRNA序列的特异性。具体操作：从表1中的17种靶标序列中选择3种靶标基因(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)，取这3种不同靶标基因的RPA产物，分别对3种不同的gRNA(SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.24)进行上述的CRISPR/Cas12a剪切反应，灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。
结果显示：SEQ ID NO.1与其对应的gRNA(SEQ ID NO.18)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.24)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQ IDNO.2与其对应的gRNA(SEQ ID NO.21)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.18和SEQID NO.24)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。SEQ ID NO.3与其对应的gRNA(SEQ IDNO.24)反应为阳性，与其非对应的gRNA(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.21)反应，检测结果无荧光值产生，为阴性。上述结果证明三种病原的靶标序列与gRNA序列互为特异，相对应的gRNA具有良好的特异性。具体结果如表2所示。
表2.单重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果
反应组合 模板 gRNA 结果
组合1 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.18(靶标序列为SEQ ID NO.1) 阳性
组合2 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.21(靶标序列为SEQ ID NO.2) 阴性
组合3 SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.24(靶标序列为SEQ ID NO.3) 阴性
组合4 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.18(靶标序列为SEQ ID NO.1) 阴性
组合5 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.21(靶标序列为SEQ ID NO.2) 阳性
组合6 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.24(靶标序列为SEQ ID NO.3) 阴性
组合7 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.18(靶标序列为SEQ ID NO.1) 阴性
组合8 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.21(靶标序列为SEQ ID NO.2) 阴性
组合9 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.24(靶标序列为SEQ ID NO.3) 阳性
实施例3基于CRISPR/Cas12a系统的多重呼吸道病原核酸检测方法
为了实现对多种呼吸道病原菌的同时检测，我们开发了针对上述病原靶标的多重检测体系。首先对选择的3种呼吸道病原基因组鉴定区域及对应gRNA序列进行分析，根据这些序列的相似性，GC含量，碱基均一性，有无形成二级发夹结构，同一反应有无交叉反应等参数，对反应体系和gRNA组合方式进行优化。
1、具体操作：按照实施例2中步骤3的方法制备好gRNA后，取4种gRNA按等比例混合(SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.27)，然后按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。检测反应中的模板则分别为所选gRNA对应靶标基因的RPA产物，他们是SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。实验中灭菌水做空白对照，无靶核酸的样本为阴性对照，其它条件不变。结果分析时去除样本背景荧光后，大于或等于阴性对照样本的荧光值的3倍定义为阳性。
实验结果表明，特异性的靶标基因的RPA产物(SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4)加入多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性；非特异性的靶标基因的RPA产物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)加入多重gRNA反应体系后，没有荧光产生，结果为阴性；说明实验建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。
2、基于以上实验结果，为了实现对上述3种呼吸道病原同时进行定性检测，我们对本专利筛选出的靶标基因和gRNA序列进行组合和优化，每种病原挑选两个靶标位点和对应的gRNA进行组合。根据GC含量、无发夹结构、无无交叉反应等原则，优化组合方式。在本实施例中，我们通过计算模拟和实验验证，挑选了两种gRNA组合方案。方案一、6种gRNA等比混合，6种gRNA分别为：SEQ ID NO.18(靶标序列为SEQ ID NO.1)，SEQ ID NO.21(靶标序列为SEQ ID NO.2)，SEQ ID NO.30(靶标序列为SEQ ID NO.6)，SEQ ID NO.34(靶标序列为SEQID NO.8)，SEQ ID NO.46(靶标序列为SEQ ID NO.13)，SEQ ID NO.49(靶标序列为SEQ IDNO.14)；方案二、6种gRNA等比混合，6种gRNA分别为：SEQ ID NO.26(靶标序列为SEQ IDNO.4)，SEQ ID NO.29(靶标序列为SEQ ID NO.5)，SEQ ID NO.32(靶标序列为SEQ IDNO.7)，SEQ ID NO.39(靶标序列为SEQ ID NO.10)，SEQ ID NO.52(靶标序列为SEQ IDNO.16)，SEQ ID NO.54(靶标序列为SEQ ID NO.17)。
为了验证这两种方案，我们分别使用结核分枝杆菌基因组、百日咳博德特菌基因组、肺炎衣原体基因组作为模板，验证两种gRNA组合的特异性。按照实施例2中步骤4的方法配制CRISPR/Cas12a检测体系，检测多重gRNA方法的特异性。实验结果表明，三种病原的基因组核酸加入上述组合的多重gRNA反应体系后，均有特异性荧光产生，结果为阳性(表3)。说明针对三种呼吸道病原建立的多重CRISPR/Cas12a检测体系具有良好的特异性。
表3.多重CRISPR/Cas12a检测体系特异性验证组合及实验结果
本实施例中，我们只呈现了病原基因组核酸样本对两种gRNA组合方案为例，运用本专利中列出的gRNA序列进行其他形式组合，都应在本专利的保护范围之内。本领域技术人员可以理解的是，可以采用本领域常规的替代方法替换本发明实施例中常规的Cas12a基因的克隆、重组表达载体的构建、Cas12a蛋白的表达及纯化、靶核苷酸/目标基因片段的扩增等步骤中的一种或多种，以期获得类似或等同的效果。
实施例4基于CRISPR/Cas12a系统的临床样本检测
我们收集了8例呼吸道痰液样本，经荧光定量PCR验证均为结核分枝杆菌阳性。对该批样本进行灭活和核酸提取后，利用本发明方案进行CRISPR/Cas12a技术检测。
具体方法：
1、核酸处理：选取300μl液化后痰液样本，采用柱提法提取核酸(口腔拭子基因组提取试剂盒)，用30μl灭菌水溶解核酸产物；
2、CRISPR/Cas12a基因克隆及蛋白表达，gRNA制备(SEQ ID NO.26)、病原检测体系及荧光检测方法参考上述实施例3，其中阳性对照为合成的靶标基因质粒(SEQ ID NO.4)。
3、实验结果如图4所示，8例临床样本检测均有荧光产生，为阳性，说明CRISPR/Cas12a系统可用于结核分枝杆菌临床样本的检测。
另外，上文中SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57所示序列如下：
SEQ ID NO.56：(ScCas12a的序列)
ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGGAATACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATCTATTTCCGCTCCGGCACCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGTCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGAAAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTCTTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGAAAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACCAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCATCGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCC
SEQ ID NO.57：(SsCas12a的序列)
ATGCAGACCCTGTTTGAGAACTTCACAAATCAGTACCCAGTGTCCAAGACCCTGCGCTTTGAGCTGATCCCCCAGGGCAAGACAAAGGACTTCATCGAGCAGAAGGGCCTGCTGAAGAAGGATGAGGACCGGGCCGAGAAGTATAAGAAGGTGAAGAACATCATCGATGAGTACCACAAGGACTTCATCGAGAAGTCTCTGAATGGCCTGAAGCTGGACGGCCTGGAGAAGTACAAGACCCTGTATCTGAAGCAGGAGAAGGACGATAAGGATAAGAAGGCCTTTGACAAGGAGAAGGAGAACCTGCGCAAGCAGATCGCCAATGCCTTCCGGAACAATGAGAAGTTTAAGACACTGTTCGCCAAGGAGCTGATCAAGAACGATCTGATGTCTTTCGCCTGCGAGGAGGACAAGAAGAATGTGAAGGAGTTTGAGGCCTTCACCACATACTTCACCGGCTTCCACCAGAACCGCGCCAATATGTACGTGGCCGATGAGAAGAGAACAGCCATCGCCAGCAGGCTGATCCACGAGAACCTGCCAAAGTTTATCGACAATATCAAGATCTTCGAGAAGATGAAGAAGGAGGCCCCCGAGCTGCTGTCTCCTTTCAACCAGACCCTGAAGGATATGAAGGACGTGATCAAGGGCACCACACTGGAGGAGATCTTTAGCCTGGATTATTTCAACAAGACCCTGACACAGAGCGGCATCGACATCTACAATTCCGTGATCGGCGGCAGAACCCCTGAGGAGGGCAAGACAAAGATCAAGGGCCTGAACGAGTACATCAATACCGACTTCAACCAGAAGCAGACAGACAAGAAGAAGCGGCAGCCAAAGTTCAAGCAGCTGTATAAGCAGATCCTGAGCGATAGGCAGAGCCTGTCCTTTATCGCCGAGGCCTTCAAGAACGACACCGAGATCCTGGAGGCCATCGAGAAGTTTTACGTGAATGAGCTGCTGCACTTCAGCAATGAGGGCAAGTCCACAAACGTGCTGGACGCCATCAAGAATGCCGTGTCTAACCTGGAGAGCTTTAACCTGACCAAGATGTATTTCCGCTCCGGCGCCTCTCTGACAGACGTGAGCCGGAAGGTGTTTGGCGAGTGGAGCATCATCAATAGAGCCCTGGACAACTACTATGCCACCACATATCCAATCAAGCCCAGAGAGAAGTCTGAGAAGTACGAGGAGAGGAAGGAGAAGTGGCTGAAGCAGGACTTCAACGTGAGCCTGATCCAGACCGCCATCGATGAGTACGACAACGAGACAGTGAAGGGCAAGAACAGCGGCAAAGTGATCGCCGATTATTTTGCCAAGTTCTGCGACGATAAGGAGACAGACCTGATCCAGAAGGTGAACGAGGGCTACATCGCCGTGAAGGATCTGCTGAATACACCCTGTCCTGAGAACGAGAAGCTGGGCAGCAATAAGGACCAGGTGAAGCAGATCAAGGCCTTTATGGATTCTATCATGGACATCATGCACTTCGTGCGCCCCCTGAGCCTGAAGGATACCGACAAGGAGAAGGATGAGACATTCTACTCCCTGTTCACACCTCTGTACGACCACCTGACCCAGACAATCGCCCTGTATAACAAGGTGCGGAACTATCTGACCCAGAAGCCTTACAGCACAGAGAAGATCAAGCTGAACTTCGAGAACAGCACCCTGCTGGGCGGCTGGGATCTGAATAAGGAGACAGACAACACAGCCATCATCCTGAGGAAGGATAACCTGTACTATCTGGGCATCATGGACAAGAGGCACAATCGCATCTTTCGGAACGTGCCCAAGGCCGATAAGAAGGACTTCTGCTACGAGAAGATGGTGTATAAGCTGCTGCCTGGCGCCAACAAGATGCTGCCAAAGGTGTTCTTTTCTCAGAGCAGAATCCAGGAGTTTACCCCTTCCGCCAAGCTGCTGGAGAACTACGCCAATGAGACACACAAGAAGGGCGATAATTTCAACCTGAATCACTGTCACAAGCTGATCGATTTCTTTAAGGACTCTATCAACAAGCACGAGGATTGGAAGAATTTCGACTTTAGGTTCAGCGCCACCTCCACCTACGCCGACCTGAGCGGCTTTTACCACGAGGTGGAGCACCAGGGCTACAAGATCTCTTTTCAGAGCGTGGCCGATTCCTTCATCGACGATCTGGTGAACGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTATAATAAGGACTTTTCCCCATTCTCTAAGGGCAAGCCCAACCTGCACACCCTGTACTGGAAGATGCTGTTTGATGAGAACAATCTGAAGGACGTGGTGTATAAGCTGAATGGCGAGGCCGAGGTGTTCTACCGCAAGAAGAGCATTGCCGAGAAGAACACCACAATCCACAAGGCCAATGAGTCCATCATCAACAAGAATCCTGATAACCCAAAGGCCACCAGCACCTTCAACTATGATATCGTGAAGGACAAGAGATACACCATCGACAAGTTTCAGTTCCACATCCCAATCACAATGAACTTTAAGGCCGAGGGCATCTTCAACATGAATCAGAGGGTGAATCAGTTCCTGAAGGCCAATCCCGATATCAACATCATCGGCATCGACAGAGGCGAGAGGCACCTGCTGTACTATGCCCTGATCAACCAGAAGGGCAAGATCCTGAAGCAGGATACCCTGAATGTGATCGCCAACGAGAAGCAGAAGGTGGACTACCACAATCTGCTGGATAAGAAGGAGGGCGACCGCGCAACCGCAAGGCAGGAGTGGGGCGTGATCGAGACAATCAAGGAGCTGAAGGAGGGCTATCTGTCCCAGGTCATCCACAAGCTGACCGATCTGATGATCGAGAACAATGCCATCATCGTGATGGAGGACCTGAACTTTGGCTTCAAGCGGGGCAGACAGAAGGTGGAGAAGCAGGTGTATCAGAAGTTTGAGAAGATGCTGATCGATAAGCTGAATTACCTGGTGGACAAGAATAAGAAGGCAAACGAGCTGGGAGGCCTGCTGAACGCATTCCAGCTGGCCAATAAGTTTGAGTCCTTCCAGAAGATGGGCAAGCAGAACGGCTTTATCTTCTACGTGCCCGCCTGGAATACCTCTAAGACAGATCCTGCCACCGGCTTTATCGACTTCCTGAAGCCCCGCTATGAGAACCTGAATCAGGCCAAGGATTTCTTTGAGAAGTTTGACTCTATCCGGCTGAACAGCAAGGCCGATTACTTTGAGTTCGCCTTTGACTTCAAGAATTTCACCGAGAAGGCCGATGGCGGCAGAACCAAGTGGACAGTGTGCACCACAAACGAGGACAGATATGCCTGGAATAGGGCCCTGAACAATAACAGGGGCAGCCAGGAGAAGTACGACATCACAGCCGAGCTGAAGTCCCTGTTCGATGGCAAGGTGGACTATAAGTCTGGCAAGGATCTGAAGCAGCAGATCGCCAGCCAGGAGTCCGCCGACTTCTTTAAGGCCCTGATGAAGAACCTGTCCATCACCCTGTCTCTGAGACACAATAACGGCGAGAAGGGCGATAATGAGCAGGACTACATCCTGTCCCCTGTGGCCGATTCTAAGGGCCGCTTCTTTGACTCCCGGAAGGCCGACGATGACATGCCAAAGAATGCCGACGCCAACGGCGCCTATCACATCGCCCTGAAGGGCCTGTGGTGTCTGGAGCAGATCAGCAAGACCGATGACCTGAAGAAGGTGAAGCTGGCCATCTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTTCGTGCAGACACTGAAGGGCAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCC

Claims (9)

1.一种基于CRISPR/Cas12a系统的呼吸道病原检测方法，其特征在于，检测靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-17任一或任几个所示。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用Cas12a蛋白和gRNA进行CRISPR核酸检测，所述gRNA以所述靶标位点为靶序列进行设计。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.18-55任一或任几个所示。
4.一种呼吸道病原核酸的CRISPR/Cas12a检测系统，其特征在于，包括Cas12a蛋白和gRNA，所述gRNA以SEQ ID NO.1-17任一所示靶标位点为靶序列进行设计。
5.根据权利要求4所述检测系统，其特征在于，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.18-55任一或任几个所示。
6.根据权利要求4所述检测系统，其特征在于，所述Cas12a蛋白为LbCas12a、SsCas12a、ScCas12a、FnCas12a或AsCas12a。
7.一种基于CRISPR/Cas12a技术检测呼吸道病原系列靶标位点，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-17任一或任几所示。
8.权利要求7所述靶标位点在作为呼吸道病原核酸检测位点方面的应用。
9.权利要求7所述靶标位点在作为基于CRISPR/Cas12a系统的3种呼吸道病原核酸检测位点方面的应用。
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