KR20180028028A - dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법 - Google Patents

dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 dCas9 단백질을 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법에 관한 것으로서, Cas9과 dCas9에 대한 기능적 차이를 바탕으로, dCas9 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 DNA, RNA 등을 포함한 핵산 증폭에 이용하면 핵산 증폭의 효율을 증가시킴으로써 최종적으로 타겟 진단의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있다.
특히, 바이오센서에 dCas9 및 이의 gRNA를 이용하면, 기존보다 핵산 증폭 효율이 2배 가량 높아지고, 비타겟과 타겟의 차이가 4배 이상 증가하며, 비타겟의 비특이적 증폭을 막아주기 때문에, 민감도와 특이도가 크게 향상되므로, 상기 조성물은 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상을 위해 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법{Composition and method for improving sensitivity and specificity on detection of nucleic acids with using dCas9 protein and gRNA for binding to target nucleic acid sequence}
본 발명은 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
천연 상태 그대로 검출하기 어려운 핵산을 표지하여 검출하는 방법은 분자생물학이나 세포생물학의 다양한 분야에 응용되어 왔다. 특이적인 혼성화 반응 (specific hybridization reaction)을 이용하는 서던 블로팅 (Southern blotting), 노던 블로팅 (Northern blotting), 인시츄 혼성화 (in situ hybridization), 핵산 마이크로어레이 (microarray)에서 신호를 검출하기 위해 표지 물질이 부착된 핵산이 널리 사용되어 왔다. 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)에서 표지된 단량체 (표지된 dNTP) 또는 표지된 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭함과 동시에 DNA를 표지하는 방법이 알려져 있다. 이렇게 표지된 DNA를 마이크로어레이로 검출할 수 있다.
PCR과 동시에 핵산을 표지하는 방법은 표지를 위한 별도의 단계가 필요하지 않은 장점이 있는 반면, 형광 염료 등으로 표지된 단량체를 사용하는 경우 표지되지 않은 단량체를 사용하는 경우보다 PCR의 효율이 떨어지는 단점이 있다. 또한, RNA는 PCR 방법으로 증폭할 수 없기 때문에 PCR로 표지하는 방법으로 RNA를 검출하려면 역전사 (reverse transcription)를 통해 cDNA를 제조하는 단계가 필요하고, 특히 마이크로RNA (microRNA, miRNA)와 같이 길이가 짧은 경우 cDNA 제조가 번거로운 문제가 있다. 이에, 보다 향상된 민감도와 특이도를 갖는 핵산 검출 기술의 개발이 절실한 실정이다.
앞서 설명된 방법들의 경우, 많은 양의 검출 핵산을 보유한 경우에 타겟이 되는 핵산을 검출하기에 용이한 방법들이다, 현재도 많이 사용하고 있음에도 불구하고, 적은 양의 타겟 핵산이 존재할 시에는 이를 검출하기가 매우 어려운 실정이며 (민감도가 낮음), 다른 저해제들로 인해서 특정 타겟만을 검출하지 못하고, 비특정 타겟을 잘못 검출하는 경우 (특이도가 낮음)가 빈번하다.
직접 환자를 대상으로 환자의 혈액, 소변 등과 같은 체액에서 검출할 시에는 보다 많은 저해제들로 인해서 민감도와 특이도가 매우 낮게 나오고 있는 실정이다. 요즘 전 세계적으로 새롭게 출범하는 바이러스나 박테리아의 경우, 초기에 진단하고 치료하는 것을 필요로 하기 때문에 빠르고 정확하게 검출할 수 있는 방법들이 필요한데, 이러한 신변종 질병의 경우, 타겟 인자들이 매우 적은 양으로 존재하기 때문에 보다 민감하고 특이도 있는 방법의 개발이 절실하다.
이와 더불어서 암을 일으키는 바이오마커들의 변이들을 확인하기 위한 방법에도 민감도와 특이도가 향상된 방법의 적용이 필요한 상황이다. 민감도와 특이도가 높은 새로운 기술의 개발만큼, 기존의 기술과 접목함으로써 민감도와 특이도를 높일 수 있는 기술의 개발이 중요하다.
미국공개특허 US2015/0211058(2015.07.30 공개)
본 발명의 목적은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 이를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 핵산 서열에 결합하는 단백질; 또는 상기 단백질 및 이와 결합하는 gRNA(guide RNA) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 표적 핵산 함유 시료에 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 첨가하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 표적 핵산 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법을 제공한다.
본 발명은 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법에 관한 것으로서, 결합 및 절단 기능을 갖는 Cas9과 절단 기능이 불활성화 되고 단지 결합 기능만을 갖는 dCas9에 대한 기능적 차이를 바탕으로, dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용하면 DNA, RNA와 같은 핵산 증폭에 이용할 경우 핵산 증폭의 효율을 증가시킴으로써 최종적으로 타겟 진단의 민감도와 특이도를 탁월하게 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물을 바이오센서에 적용할 경우, 기존보다 증폭효율이 2배 가량 높아지고, 비타겟과 타겟의 차이가 4배 이상 증가하며, 특히 비타겟의 비특이적 증폭을 막아주어 민감도와 특이도가 탁월하게 향상되므로, 본 발명은 민감도 및 특이도가 향상된 핵산 검출에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 CRISPR 매개 바이오센서의 개략도 (SMR sensor: silicon microring resonator sensor, with dCas9: dCas9 사용, with dCas9: No dCas9: dCas9 미사용)를 나타낸 것이고,
도 2 및 도 3은 쯔쯔가무시병 (scrub typhus, ST)의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시균 (Orientia tsutsugamushi, OT)과 중증열성혈소판감소증후군 (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)의 원인균인 부니아바이러스 (Bunyavirus)을 검출을 위해 제작한 gRNAs 디자인 개략도를 나타낸 것이고 (dsDNA: double stranded DNA, ssRNA: single stranded RNA, 표적 부위는 파란색으로 강조하고 PAM 서열은 붉은 색으로 표시),
도 4는 완충액 조건에서 gRNA 활성을 확인하기 위한 In vitro 절단 분석 결과로서, gRNA가 표적 PCR 산물과 매칭될 때만 Cas9 RNP는 RPA 완충액과 NEBuffer 3.1 조건 모두에서 PRC 산물을 절단하는 것을 나타낸 것이고 (ST: scrub typhus, SFTS: severe fever with thrombocytopenia syndrome),
도 5는 dCas9 RNP 및 5' 비오틴화 DNA 듀플렉스를 이용한 EMSA 분석 결과로서, 표적 DNA 듀플렉스는 RPA 완충액과 NEBuffer 3.1 조건 모두에서 매칭된 gRNA에 의해 단지 이동되었을 뿐, 절단되지 않는 것을 나타낸 것이고 (ST: scrub typhus, Ctrl: 표적 핵산 없는 대조군, sgRNA: single guide RNA),
도 6은 CRISPR 매개 바이오센서의 30분 이내 ST-DNA 검출 결과 (ST: SMR biosensor 단독, ST with dCas9 RNP: dCas9을 처리한 SMR 바이오센서, ST with Cas9 RNP: Cas9 처리한 SMR 바이오센서)를 나타낸 것이고 (ST: scrub typhus, ST with dCas9 RNP: dCas9 사용한 ST 검출, ST with Cas9 RNP: No dCas9: dCas9 미사용 ST 검출),
도 7은 CRISPR 매개 바이오센서의 15분 이내 ST 검출을 위한 공명 파장 이동 결과 (SMR biosensor alone: 검정, with dCas9 RNP: 밝은 회색, with Cas9 RNP: 어두운 회색)를 나타낸 것이고 (ST: scrub typhus, Empty: 표적 핵산 없는 대조군),
도 8은 CRISPR 매개 바이오센서의 30분 동안 상대적 공명 파장 이동 결과 [ST: scrub typhus, dCas9 RNP; ST without dCas9 RNP, ST with 1x dCas9 RNP (100 ng dCas9 + 75 ng gRNA), ST with 3x dCas9 RNP (300 ng dCas9 + 225 ng gRNA), and ST with 5x dCas9 RNP (500 ng dCas9 + 375 ng gRNA)]를 나타낸 것이고,
도 9a는 CRISPR 매개 바이오센서에 따른 ST의 dsDNA의 검출 한계 (0.54 aM 이하, 회색)를 나타낸 것으로 SMR 바이오센서 단독(검정색)보다 민감한 것을 나타낸 것이고 (ST: scrub typhus, ST with dCas9 RNP: dCas9 RNP 이용 ST 검출),
도 9b는 CRISPR 매개 바이오센서에 따른 SFTS의 RNA의 검출 한계 (0.63 aM 이하, 회색)를 나타낸 것으로 SMR 바이오센서 단독(검정색)보다 민감한 것을 나타낸 것이고 (SFTS: fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS with dCas9 RNP: dCas9 RNP 이용 SFTS 검출),
도 10은 DNA용 실시간 PCR의 검출 한계와 RNA용 실시간 RT-PCR의 검출 한계로, (a) 실시간 PCR에 의해 표적 DNA의 농도와 형광 신호의 Ct 값 간의 선형 상관관계를 나타내며, 낮은 농도(<100 copies/ml)의 표적 DNA는 검출되지 않았고 (over 40 Ct value), (b) 실시간 RT-PCR에 의해 표적 RNA의 농도와 형광 신호의 Ct 값 간의 선형 상관관계를 나타내며, 낮은 농도(<100 copies/ml)의 표적 RNA는 검출되지 않은 것 (over 40 Ct value)을 나타낸 것이고 (ST standard curve: ST 표준 검량선, SFTS standard curve: SFTS 표준 검량선),
도 11a는 CRISPR 매개 바이오센서에 따른 임상시료로부터 ST의 고민감 및 특이적 검출(회색)을 나타낸 것으로 SMR 바이오센서 단독(검정색)보다 민감하고 특이적으로 검출된 것 (P1-3: ST 환자 혈청으로 양성, N1-3: SFTS 환자 혈청으로 음성)을 나타낸 것이고,
도 11b는 CRISPR 매개 바이오센서에 따른 임상시료로부터 SFTS-RNA의 고민감 및 특이적 검출(회색)을 나타낸 것으로 SMR 바이오센서 단독(검정색)보다 민감하고 특이적으로 검출된 것 (P1-3: SFTS 환자 혈청으로 양성, N1-3: ST 환자 혈청으로 음성)을 나타낸 것이다.
본 발명은 표적 핵산 서열에 결합하는 단백질; 또는 상기 단백질 및 이와 결합하는 gRNA(guide RNA) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 표적 핵산 서열에 결합하는 단백질은 징크핑거 단백질(zinc finger protein) 또는 TAL 이펙터 단백질(Transription activator-like effector protein)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 및 이와 결합하는 gRNA(guide RNA) 복합체는 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 이와 결합하는 gRNA의 복합체 또는 dCpf1(dead Cpf1, nuclease-inactive Cpf1) 단백질 및 이와 결합하는 gRNA의 복합체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
가장 바람직하게는, 본 발명은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 이와 결합하는 gRNA의 복합체를 유효성분으로 포함할 경우, 핵산 검출의 민감도 및 특이도가 크게 향상된 조성물을 제공할 수 있다.
이에, 본 발명은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dCas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적은 오리엔티아 쯔쯔가무시균 (Orientia tsutsugamushi, OT), 부니아 바이러스 (Bunyavirus), 결핵균, 메르스 바이러스 및 호흡기 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 감염성 질환의 원인균 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 조성물은 핵산 중합효소, 표적 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 및 완충용액을 추가적으로 포함할 수 있다.
상세하게는, 상기 핵산은 특별히 제한되지 않으나, 모든 DNA 또는 RNA가 될 수 있고, 세포에 존재하는 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA, cfDNA, cfRNA, ctDNA 등이 될 수 있다.
본 발명의 "dCas9"은 Cas9의 아미노산 중에서 10번째 아스파르트산을 알라닌으로, 840번째 히스티딘을 알라닌으로 바꾼 변형체로 뉴클레아제 활동성을 억제한 것이다. 이전 보고에 따르면, Cas9 WT과 dCas9을 타겟하는 gRNA 및 DNA와 함께 처리한 후 전기영동한 결과로 Cas9 WT은 타겟하는 DNA를 잘라 절단 조각이 나타나지만, dCas9은 절단 조각이 나타나지 않는다. 이는 dCas9의 뉴클레아제 활동성이 억제된 것을 보여준다(Conformational control of DNA target cleavage by CRISPR-Cas9, Nature 527, 110-113).
또한, 본 발명은 dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 표적 핵산 함유 시료에 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 첨가하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 표적 핵산 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 dCas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계는 표적 핵산을 증폭시킬 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않으나, PCR, 실시간 PCR(real-time PCR; RT-PCR), 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 등온 핵산 증폭(isothermal nucleic acid amplification) 및 실리콘 공진기 센서(Silicon Microring Resonator; SMR) 등을 이용하여 표적 핵산을 증폭시킬 수 있다.
상세하게는, 상기 핵산은 특별히 제한되지 않으나, 모든 DNA 또는 RNA가 될 수 있고, 세포에 존재하는 염색체 DNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, rRNA, tRNA, miRNA 등이 될 수 있다.
한편, 상기에서 증폭된 산물은 당업계에서 알려진 방법에 의하여 검출(detection)될 수 있는데, 예를 들면 젤 전기영동(gel electrophoresis), ELGA(enzyme-linked gel assay), ECL(electrochmiluminescent), 형광물질, 방사선 동위원소 등을 이용할 수 있다.
상기 형광물질로는 로다민(rhodamine), 탐라(TAMRA) 등을 포함하는 로다민계; 플루오세인, FITC (fluorescein isothiocyanate) 및 FAM (fluorecein amidite)등을 포함하는 플루오세인계(fluorescein); 보디피계(bodipy, boron-dipyrromethene); 알렉사플로어계 (alexa fluor); 및 Cy3, Cy5, Cy7, 인도시아닌그린을 포함하는 시아닌계(cyanine) 등의 형광물질을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방사성 동위원소로는 H-3, C-14, P-32, S-35, Cl-36, Cr-51, Co-57, Co-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Tc-99m, Mo-99, P-32, CR-51, Ca-45, Ca-68 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 단백질 정제
재조합 dCas9 RNP (ribonucleoprotein) 정제를 위해, T7 Express BL21 (DE3) E.coli 세포를 pET28a-His6-dCas9 플라스미드로 형질전환 시켰다. 30 ℃, Luria-Bertani (LB) 브로스에서 E.coli를 OD600가 0.5-0.7이 될 때까지 배양한 후 16 ℃에서 16 시간 동안 0.2 mM의 이소프로필 β-d-l-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)로 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 5,000 g에서 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었고, 용출 완충액 [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 (pH 8.0), 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1 mg/mL 라이소자임]에서 초음파 처리하여 용출시켰다. 수용성 용출액은 8,000 g에서 원심분리하여 수득하였고, Ni-NTA 아가로스 비즈와 1-2 시간 동안 반응시켰다 (Qiagen). 단백질 결합 Ni-NTA 아가로스 비즈를 세정액[50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 (pH 8.0)]으로 세정하였고, dCas9 단백질은 이미다졸 함유 완충액 [50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸 (pH 8.0)]으로 용출시켰다. 100 K Amicon 원심분리 필터 (Millipore)를 이용하여 용출된 단백질 완충액을 이온 교환하고, 농축한 후 4-12 % Bis-Tris 겔 (ThermoFisher)로 분석하였다.
2. in vitro 절단 분석
오리엔티아 쯔쯔가무시균 (Orientia Tsutsugamushi, OT) 및 중증열성혈소판감소증후군 (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS) DNA 서열을 각각 함유하는 PCR 산물 (400 ng)을 재수화 완충액 5.9 ㎕ 과 280 mM 마그네슘 아세테이트 (MgAc) 용액 0.5 ㎕ [TwistAmp Basic RT 키트 제공]으로 혼합하였다. 완충액이 혼합된 PCR 산물 10 ㎕을 37 ℃에서 1 시간 동안 1 ㎍ Cas9 단백질과 750 ng sgRNA와 반응시켰다. 절단 분석의 양성 대조군으로 동일한 PCR 산물을 1x 완충액 3.1 (New England BioLabs) 조건으로 절단시켰다. RNase A (4 ㎍)을 첨가하여 sgRNA를 제거하고 아가로스 겔 전기영동으로 최종 산물을 분석하였다.
3. in vitro 결합 분석
dsDNA 주형은 5' 비오틴화 표적 DNA 가닥과 비-비오틴화 비-표적 DNA 가닥을 1:1.5 몰비율에서 어닐링 하여 준비하였다. 이때 각각의 서열은 다음과 같다.
1) 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 5' 비오틴화 표적 DNA 가닥
OT_1_F_biotin: TATAAAGATCTTGTTA AATTGCAGCGTCATGCAGGAATTAGGAAAGC (서열번호 2)
2) 오리엔티아 쯔쯔가무시균의 비-비오틴화 비표적 DNA 가닥
OT_1_R: GCTTTCCTAATTCCTGCATGACG CTGCAATTTAACAAGATCTTTATA (서열번호 3)
3) SFTS의 5' 비오틴화 표적 DNA 가닥
SFTS_F_biotin: AAAAATTAGCTGCCCAACAAGAAGAA GATGCAAAGAATCAAGGTGAA (서열번호 4)
4) SFTS의 비-비오틴화 비표적 DNA 가닥
SFTS_R: TTCACCTTGATTCTTTGCATCTTCTTCTTGTTGG GCAGCTAATTTTT (서열번호 5)
10 nM dsDNA를 절단 완충액 조건 하에서 300 nM dCas9 및 1 μM sgRNA와 반응시켰다. 37 ℃에서 20 분 동안 반응시킨 후, 5 mM MgCl2로 보강된 0.5x TBE 완충액을 이용하여 10% TBE 겔에 처리하였다. 그 후, in vitro 결합 상태를 화학발광 핵산 검출 모듈 키트 (ThermoFisher) 및 Biodyne B 나일론 멤브레인 (ThermoFisher)을 이용하여 제조자의 지침에 따라 전기영동 이동성 분석 (EMSA)을 수행하였다.
4. 실리콘 마이크로링 공진기(Silicon Microring Resonator; SMR) 제작
SMR 바이오센서를 표적 핵산의 검출을 위한 검출 시스템으로 이용하기 위해 종래 알려진 방법에 따라 SMR과 RPA (Recombinase Polymerase Amplification)를 제작하고 작동시켰다.
먼저, SMR 바이오센서를 산소 플라즈마 클리닝 (전력: 100W, O2: 80 sccm)을 1분 동안 처리하고, 실온에서 2시간 동안 95 % 에탄올에 용해된 2% 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES) 용액에 담구었다. 그 후, SMR 바이오센서를 120 ℃에서 15분 동안 경화시켰다. 그 후, SMR 바이오센서를 10 mM 소듐 시아노보로하이드라이드를 함유한 탈이온수에 용해된 2.5% 글루타르알데히드 (GAD)과 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 탈이온수로 세정하며, 고순도 질소 가스 하에서 건조하였다. 다음으로, SMR 바이오센서 상에 표적 프라이머를 고정화 하기 위하여, 바이오센서를 20 mM 소듐 시아노보로하이드라이드 용액을 함유한 PBS (1 mM)에 용해시킨 표적 프라이머와 실온에서 16 시간 동안 반응시키고, PBS로 세정하여 결합되지 않은 표적 프라이머를 제거하였다. 이때, 상기 표적 프라이머의 5' 위치에 아민기를 도입하여 사용하였다. ST와 SFTS 검출을 위한 프라이머는 SFTS-S 단편과 ST-56-kDa 타입-특이적 유전자를 각각 이용하여 디자인 하였다 (표 1 참조).
분석법 명명 서열 (5’-3’) 서열번호
RT-PCR SFTS-F CGAGAGAGCTGGCCTATGAA 서열번호 6
SFTS-R TTCCCTGATGCCTTGACGAT 서열번호 7
ST-F GCAGCAGCTGTTAGGCTTTT 서열번호 8
ST-R TTGCAGTCACCTTCACCTTG 서열번호 9
SMR 바이오센서 SFTS-F GGAGGCCTACTCTCTGTGGCAAGATGCCTTCA 서열번호 10
SFTS-R GGCCTTCAGCCACTTTACCCGAACATCATTGG 서열번호 11
ST-F GCAGCAGCAGCTGTTAGGCTTTTAAATGGCAATG 서열번호 12
ST-R GCTGCTTGCAGTCACCTTCACCTTGATTCTTTG 서열번호 13
5. SMR 바이오센서 단독 및 CRISPR 매개 바이오센서 작동
SMR 바이오센서 단독으로 이용하여 표적 핵산을 증폭하고 검출하기 위하여, RPA와 RT-RPA 용액을 각각 준비하였다. RPA와 RT-RPA 용액을 준비하기 위해 재수화 완충액 29.5 ㎕, RNase 억제제와 물 15 ㎕, 10 μM 각 프라이머 2.5 ㎕를 혼합하였다. 그 후, 반응 혼합물을 동결건조 효소에 첨가하고, 각 튜브의 캡에 분주된 280 mM 마그네슘 아세테이트 (MgAc) 용액 2.5 ㎕을 첨가하였다. 균질한 분배를 위해 단일 방향 진탕 혼합을 하였다. 혼합 후, 50 ㎕의 반응 완충액을 10 ㎕ 액적으로 5회 나누었다. 검출을 위한 반응 개시를 위해, 각각의 10 ㎕ 반응 액적에 환자의 혈청으로부터 추출된 핵산 5 ㎕와 dCas9 RNP (300 ng dCas9 및 225 ng gRNA) 3 ㎕를 첨가한 후, 컨트롤러를 갖는 thermo electric cooler (TEC, Alpha Omega Instruments) 상에 바이오센서를 놓고 일정한 DC 전압을 인가하였고 일정한 온도 (DNA는 38 ℃, RNA는 43 ℃)를 유지하였다. 바이오센서의 공명 스펙트럼을 즉시 측정하였고, 기준선을 얻기 위해 레퍼런스를 이용하였다. 파장 시프트는 최대 30분까지 매 5분 마다 측정하여 무표식 및 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링 하였다. 상대 공명 파장 시프트는 다음 식으로 계산하였다.
ΔΔpm = (표적 파장 값, pm) - (비표적 파장 값, pm)
6. 핵산 시료의 추출 및 준비
QIAamp Viral RNA Kit (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA)를 이용하여 SFTS 시료로부터 바이러스 RNA를 추출하였고, QIAamp DNA mini kit (Qiagen)를 이용하여 ST 시료로부터 게놈 DNA를 추출하였다. SFTS 바이러스 RNA 전사체 대조군을 준비하기 위해, 표적 영역을 함유한 RNA 단편을 안티센스 가닥 상에 T7 프로모터 서열을 함유하는 프라이머로 증폭하였다. MEGAscript T7 Transcription Kit (Ambion Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 in vitro에서 증폭산물을 전사시켰다. MEGAclear Kit (Ambion)를 이용하여 합성 RNA 전사체를 정제하였고 Nanodrop spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 정량하였다. ST 박테리아 DNA 대조군을 준비하기 위해, 표적 영역을 함유한 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 Nanodrop spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)로 정량하였다.
7. 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR 분석
주형으로 이용한 표적 DNA는 임상 시료로부터 얻었고, 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 실시간 PCR 및 실시간 RT-PCR 분석을 수행하였다. 실시간 PCR은 95 ℃에서 15분 동안 변성 공정, 95 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초 및 72 ℃에서 30초의 45회 주기와, 72 ℃에서 10분 최종 연장 단계로 수행하였다. 표적 DNA (5 ㎕)를 총 20 ㎕의 반응물 [2x brilliant SYBR green RT-qPCR master mix 및 25 pmol의 각 프라이머]에서 증폭시켰다.
그리고, 실시간 RT-PCR 분석은 AriaMx (Aligent) Instrument 프로토콜을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 즉, 표적 RNA (5 ㎕)를 총 20 ㎕의 반응물 [2x brilliant SYBR green RT-qPCR master mix 및 25 pmol의 각 프라이머]에서 증폭시켰다. 초기 cDNA 합성 단계는 50 ℃에서 20분, 그 후 95 ℃에서 15분, 95 ℃에서 15초, 55 ℃에서 20초 및 72 ℃에서 20초의 15회 주기와, 40 ℃에서 30초 동안 냉각 단계로 수행하였다. AriaMx Real-Time PCR System (Agilent)를 이용하여 증폭산물의 SYBR Green 신호를 얻었다.
8. 임상 표본 준비
ST 및 SFTS 혈청 시료를 아산 메디컬 센터의 환자로부터 수집하였다. SFTS는 DiaStar 2X OneStep RT-PCR Pre-Mix kit (SolGent, Daejeon, South Korea)를 이용하여 혈청에서 실시간 RT-PCR에 의해 바이러스 RNA를 검출하였다. ST 진단은 연속 시료에서 면역형광 분석 (IFA; SD Bioline Tsutsugamushi Assay; Standard Diagnostics, Yongin, South Korea)의 단일 양성 결과 또는 IFA 역가의 ≥ 1:640 또는 4배 증가 중 어느 하나를 확인하여 판단하였다. 이러한 프로토콜은 아산 메디컬 센터의 IRB (Institutional Review Board, 임상시험심사위원회)에 의해 승인 받았고, 모든 참가자에게 동의를 받아 진행하였다.
<실시예 1> CRISPR 매개 바이오센서의 민감도 및 특이도 분석
도 1과 같이, CRISPR/dCas9와 SMR 바이오센서의 조합을 이용하여 표식 없이 실시간으로 임상 시료로부터 병원성 핵산을 검출할 수 있었다. 이러한 병원성 핵산의 검출을 위해, 쯔쯔가무시병 (scrub typhus, ST)의 원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시균(Orientia tsutsugamushi, OT)과 중증열성혈소판감소증후군 (severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)의 원인균인 부니아바이러스 (bunyavirus)를 표적으로 하는 gRNA를 각각 제작하였다 (도 2 및 도 3 참조).
in vitro 절단 분석과 전기영동 이동성 분석 (EMSA)을 통해 RPA 완충액에서 Cas9 RNP는 표적 DNA 절단을 유도하고, dCas9 RNP는 표적 DNA와 결합하는 것을 관찰하였다 (도 4 및 도 5 참조).
또한, SMR 바이오센서에서 dCas9 RNP가 검출 민감도를 향상시키는지를 검토하기 위해, ST 시료로부터 DNA 단편을 증폭하고 dCas9 RNP로 처리된 ST에서 신호의 증강을 관찰하였고, 이를 ST 단독과 Cas9 RNP로 처리된 ST와 비교한 결과, 도 6과 같이 dCas9 RNP로 처리된 ST에서 검출 민감도가 향상되었고, 이러한 민감도 향상은 SMR 바이오센서 상에서 dCas9 RNP의 표적 단편과의 특이적 결합에 의한 것이며,기존보다 증폭효율이 2배 가량 높아졌고, 비타겟과 타겟의 차이가 4배 이상 증가하였으며, 특히 비타겟의 비특이적 증폭을 막아주어 민감도와 특이도가 탁월하게 향상된 것으로 나타났다 (도 7 참조).
그리고, 도 8과 같이 병원성 핵산의 검출 민감도 향상을 위해 dCas9 RNP를 농도별로 처리하였고, 3x dCas9 RNP (300 ng의 dCas9 + 225 ng의 gRNA)에서 병원성 핵산의 검출 효율이 가장 우수한 것으로 나타났다. [1x dCas9 RNP (100 ng dCas9 + 75 ng gRNA), 3x dCas9 RNP (300 ng dCas9 + 225 ng gRNA), 5x dCas9 RNP (500 ng dCas9 + 375 ng gRNA)]
본 발명에 따른 CRISPR 매개 바이오센서의 검출 한계는 도 9a 및 도 9b와 같이 dCas9 RNP를 이용하여 30분 이내 ST (0.54 aM) 및 SFTS (0.63 aM)로 각각 검출하는 것을 확인하였다. 이러한 검출 한계는 SMR 바이오센서 단독 (~10 copies) (도 9a, 도 9b) 및 실시간 PCR (~100 copies)의 검출 한계 (도 10)보다 탁월한 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 CRISPR 매개 바이오센서를 이용하면 ST 및 SFTS와 같은 병원성 핵산을 SMR 바이오센서 단독 또는 실시간 PCR 방법보다 매우 민감하게 검출할 수 있었다.
<실시예 2> CRISPR 매개 바이오센서를 이용한 임상 시료 분석
본 발명에 따른 CRISPR 매개 바이오센서가 신속성, 고민감성 및 특이성을 요구하는 신종 감염성 질환에서의 임상 적용에 유용한지를 검토하였다. SFTS와 ST는 실질적으로 임상 증상이 중첩되므로, 초기에 이들을 구분하기 위한 분자적 진단 테스트는 매우 중요하며, ST용 특이적 항미생물 치료법과 SFTS용 적절한 예방법을 제공하기 위해 반드시 필요하다.
이에, 본 발명에서는 3명의 ST를 갖는 환자와, 3명의 SFTS를 갖는 환자로 구성된 총 6명의 환자로부터 임상 시료를 선별하였다.
ST의 진단용 시료를 ST 프라이머를 갖는 CRISPR 매개 바이오센서로 분석한 결과, 도 11a와 같이 SFTS 시료가 아닌 ST 시료에서만 향상된 신호가 관찰되었다. 또한, 이러한 시료들로부터 SFTS를 진단하기 위해 SFTS 프라이머를 갖는 CRISPR 매개 바이오센서로 분석한 결과, 도 11b와 같이 단지 SFTS 시료에서만 향상된 신호가 관찰되었다.
따라서, 본 발명에 따른 CRISPR 매개 바이오센서는 임상시료로부터 ST와 SFTS를 신속하면서도 민감하고 특이적으로 명확하게 구분할 수 있었다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Composition and method for improving sensitivity and specificity on detection of nucleic acids with using dCas9 protein and gRNA for binding to target nucleic acid sequence <130> ADP-2017-0295 <150> KR 10-2016-0115024 <151> 2016-09-07 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1389 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclease-inactive Cas9 <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Pro Pro Lys Lys 1365 1370 1375 Lys Arg Lys Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1380 1385 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Orientia Tsutsugamushi <400> 2 tataaagatc ttgttaaatt gcagcgtcat gcaggaatta ggaaagc 47 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Orientia Tsutsugamushi <400> 3 gctttcctaa ttcctgcatg acgctgcaat ttaacaagat ctttata 47 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Bunyavirus <400> 4 aaaaattagc tgcccaacaa gaagaagatg caaagaatca aggtgaa 47 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Bunyavirus <400> 5 ttcaccttga ttctttgcat cttcttcttg ttgggcagct aattttt 47 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgagagagct ggcctatgaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttccctgatg ccttgacgat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcagcagctg ttaggctttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttgcagtcac cttcaccttg 20 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggaggcctac tctctgtggc aagatgcctt ca 32 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggccttcagc cactttaccc gaacatcatt gg 32 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gcagcagcag ctgttaggct tttaaatggc aatg 34 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gctgcttgca gtcaccttca ccttgattct ttg 33

Claims (11)

  1. 표적 핵산 서열에 결합하는 단백질; 또는 상기 단백질 및 이와 결합하는 gRNA(guide RNA) 복합체를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  2. dCas9(dead Cas, nuclease-inactive Cas9) 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 유효성분으로 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 dCas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 표적은 오리엔티아 쯔쯔가무시균 (Orientia tsutsugamushi, OT), 부니아 바이러스 (Bunyavirus), 결핵균, 메르스 바이러스 및 호흡기 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 감염성 질환의 원인균인 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 핵산 중합효소, 표적 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머 및 완충용액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 키트.
  8. 표적 핵산 함유 시료에 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA(guide RNA)를 첨가하여 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 표적 핵산 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 dCas9 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계는 PCR, 실시간 PCR(real-time PCR; RT-PCR), 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR), 등온 핵산 증폭(isothermal nucleic acid amplification) 및 실리콘 공진기 센서(Silicon Microring Resonator; SMR)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는, 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상 방법.
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