CN112522441A - 一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针及其试剂盒，本发明以新型冠状病毒的特异性核酸序列为靶基因，设计CRISPR/Cas13a系统的介导RNA，基于CRISPR/Cas13a系统的高灵敏、高特异对新型冠状病毒进行快速、高灵敏、高特异核酸检测，基于该检测方法构建了新型冠状病毒核酸快速检测试剂盒。本发明试剂盒最低检测下限为100fM，反应时间约为30分钟，可对密切接触人群和疑似人群，开展便捷的社区检测乃至居家监测，不仅能有效避免人群大量扎堆前往定点医院，避免因此造成的公共资源浪费和二次交叉传染，还能有效的筛选出潜伏期的无症状感染人群，为阻断传播途径提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，特别是一种基于 CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针及其试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要通过呼吸道飞沫传播和接触传播，人群普遍易感；该病毒感染具有潜伏期(1-14天)，感染潜伏期的病人一般无症状，但已经具备很强的传染性。目前SARS- CoV-2病毒感染的临床初步诊断主要依据流行病学史、发热、咳嗽、肺部毛玻璃样改变为主，确诊则需通过荧光实时定量PCR(RT- PCR)进行病毒核酸载量检测或通过二代测序进行病毒核酸序列分析。然而RT-PCR病毒核酸检测与二代测序存在检测时间和周期长、环境要求高、技术力量要求高、硬件设备要求高等一系列问题，只能在省/市疾病预防控制中心和较大规模的三甲医院开展。密切接触人员或疑似病例只有出现相应症状时，才能前往医院采集标本进行相关检测；目前各个医院的发热门诊均是SARS-CoV-2病毒感染人群的聚集地，也是重要的感染源头，贸然前往医院检查容易造成病毒感染的加剧传播。此外部分潜伏早期的感染人群，不仅无症状，而且容易出现核酸检测假阴性的结果，这样容易造成传染源的忽视，不利于疫情的防控。若能在家庭或者社区，就能便捷、快速、低成本的对2019-nCoV病毒核酸进行初筛和每天反复监测，则能有效的筛选与鉴定被感染人群(尤其是潜伏期的无症状感染人群)、分离出隐性的传染源，进而高效的隔离被感染人群、阻断传播途径，将病毒感染的防控端口前移，这将极大的推进SARS-CoV-2病毒感染的有效和及时防控。因此，迫切需要发展一种快速、低成本、环境使用要求低的居家或社区使用的病毒核酸检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针及其试剂盒，以满足在恒温条件下，利用 CRISPR/Cas13a系统对预先处理的鼻咽拭子、血液、尿液等含新型冠状病毒RNA的样本进行快速检测。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，包括了Cas13a 及其缓冲液、介导RNA、荧光报告分子，介导RNA与新型冠状病毒核酸的保守靶基因段互补，当介导RNA与新型冠状病毒核酸的保守靶基因段互补时Cas13a被激活，切断处于荧光猝灭的荧光报告分子，产生荧光信号。
进一步的，Cas13a为不同原核生物分离得到的CRISPR核酸酶。
优选的，介导RNA包括5’端的重复子序列和3’端的靶向序列，二级结构为5’端重复子折叠成发夹结构而3’端呈线性结构。
进一步的，介导RNA的5’端重复子序列为
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，3’端靶向序列为靶向新型冠状病毒、并与病毒互补的28个寡核苷酸特异序列。
进一步的，介导RNA的分子序列为：
5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCUCCUGAUGAGGUUCCACCUGGUUU-3’。
其中，荧光报告分子为ssRNA-FQ，其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团的寡核苷酸分子。
优选的，荧光报告分子序列为5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’。
本发明还公开了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针的试剂盒，试剂盒采用上述检测探针，还包括有试剂盒盒体和检测垫，检测垫设置于试剂盒盒体内，试剂盒盒体上开设有加样口和检测口，检测探针负载于检测垫上，通过缓冲液的冲洗待测样从加样口加入于检测口进行荧光检测。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过对介导RNA及荧光报告分子的设计，合成出了具有强针对性和高抗干扰能力的介导RNA，可以高效的识别新型冠状病毒核酸并激活Cas13切断荧光报告分子，实现灵敏的荧光检测。
2.经过合理设计的试剂盒，采用荧光检测作为检测标记，相较于传统的核算检测或其他临床检测具有更高的检测灵敏度和更低的检测下限，是一种快速、低成本、环境使用要求低的居家或社区使用的病毒核酸检测试剂盒。
附图说明
图1为本发明核酸检测探针灵敏度结果图。
图2为本发明核酸检测探针特异性结果。
图3为本发明核酸检测探针荧光检测体系重复性结果图。
图4为本发明核酸检测探针抗干扰能力结果图。
图5为本发明核酸检测探针不同核酸提取方法检测结果比较结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，包括了Cas13a及其缓冲液、介导RNA、荧光报告分子，其中：
将新型冠状病毒SARS-CoV-2的保守靶基因ORF1ab与SARS、MERS等冠状病毒进行序列同源性比对分析，找出相对保守区域进行
介导RNA的设计以新型冠状病毒SARS-CoV-2的保守靶基因 ORF1ab与SARS、MERS等冠状病毒进行序列同源性比对分析，找出相对保守区域为基础进行设计。
介导RNA包括5’端的重复子序列和3’端的靶向序列。介导 RNA 5’端重复子序列根据所选用的不同种属来源的Cas13a进行选择，本实施例以LwaCas13a为例，介导RNA 5’端重复子序列为5’ -GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’。3’端靶向序列为靶向新型冠状病毒、与之互补的28个寡核苷酸特异序列。介导RNA 二级结构主要以单一模式存在(即5’端重复子折叠成发夹结构而 3’端呈线性)，同时靶向的新型冠状病毒的特异序列无明显的二级结构且针对新型冠状病毒保守。为此，设计了如下的介导RNA：
Lwa-ORF1ab-gRNA：
5’- GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCUCCUGAUGAGGUUCCACCUGGUUU-3’
荧光报告分子ssRNA-FQ为5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团的寡核苷酸分子，其具体序列为5’-FAM-UUUUU- BHQ1-3’。
本发明还公开了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针的试剂盒，试剂盒采用上述检测探针，还包括有试剂盒盒体和检测垫，检测垫设置于试剂盒盒体内，试剂盒盒体上开设有加样口和检测口，检测探针负载于检测垫上，通过缓冲液的冲洗待测样从加样口加入于检测口进行荧光检测。
实施例2
本实施例以实施例1中建立的检测探针为实验对象，以体外合成的病毒RNA为检验对象，进行实验分析。
新型冠状病毒SARS-CoV-2RNA的合成方法具体如下:
通过体外合成基因方式合成新型冠状病毒SARS-CoV-2保守靶基因ORF1ab保守区域，其序列如下：
5’- ACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATT ATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTT CTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTT CACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAAT AGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAATGCACTTTTATCTACTGA TGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAATTTACAACAC-3’
为方便后续启动RNA转录，在上述序列5’端引入T7启动子序列TAATACGACTCACTATAGGG。最终，通过基因合成方式合成以下的双链DNA，其序列为：
5’- TAATACGACTCACTATAGGGACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCA TGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGT TGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGA AATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATG CCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTT AATGCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAATTTACA ACAC-3’。
以上述带T7启动子的质粒为反应模板，采用HiScribeTM T7 Quick High YieldRNA Synthesis Kit(New England BioLabs,USA)进行体外RNA转录。具体如下：
表1合成试剂一览表
多个复管，37℃反应2小时，然后加入30ul无核酸酶水和2 ul DNase I，37℃温育15分钟以去除DNA。之后用Monarch RNA Cleanup Kits(New England BioLabs,USA)纯化RNA，并用Qubit (Thermo Fisher Scientific,USA)定量。多管分装，置于-80℃，避免反复冻融。
分析实验包括：
(1)核酸检测探针灵敏度检测、(2)核酸检测探针特异性检测、(3)核酸检测探针荧光检测体系重复性检测、(4)核酸检测探针抗干扰能力检测、(5)核酸检测探针不同核酸提取方法检测结果比较。
实验结果：
如图1所示：
以上述转录、纯化的新型冠状病毒RNA标准品为模板，进行一系列的梯度稀释，包括1uM，10nM，100pM，1pM，100fM。利用上述的新型冠状病毒CRISPR/Cas13a荧光检测体系进行检测。37℃恒温孵育30分钟，并采集FAM荧光信号。体系以无核酸酶水为阴性对照。检测结果发现，体系灵敏度能够达到100fM。
如图2所示：
收集呼吸道相关病原体核酸，包括NL63、HKU1、OC43、229E、 MERS、SARS等冠状病毒科，以及呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒、肠病毒、偏肺病毒等呼吸道病毒，肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体、流感嗜血杆菌等呼吸道细菌、支原体、衣原体。并以1uM新型冠状病毒 RNA标准品作为阳性对照，无核酸酶水作为阴性对照，利用上述的新型冠状病毒CRISPR/Cas13a荧光检测体系进行检测。检测结果发现，以新型冠状病毒RNA标准品为阳性对照与其他病原体核酸信号能够严格区分。体系特异性良好。
如图3所示：
以上述转录、纯化的新型冠状病毒RNA标准品为模板，进行一系列的梯度稀释，包括1uM，10nM，100pM，1pM，100fM。利用上述的新型冠状病毒CRISPR/Cas13a荧光检测体系对上述不同浓度体系的RNA标准品做重复检测。每个浓度不少于3个复孔。同时，体系以无核酸酶水为阴性对照。检测结果发现，体系重复性好。
如图4所示：
选择浓度为10pM的新型冠状病毒RNA标准品作为模板，分别考察体系在2％血清、EDTA抗凝剂、鼻咽拭子保存液、尿液等外源干扰物质的检测情况。检测结果发现，新型冠状病毒CRISPR/Cas13a 荧光检测体系在2％血清、EDTA抗凝剂、鼻咽拭子保存液、尿液等外源干扰物质存在条件下，依然能够较好地检测到新型冠状病毒RNA 信号。表明，上述检测体系抗干扰能力强。
如图5所示：
为方便用于快速检测，比较了试剂盒提取核酸与加热预处理标本后用于新型冠状病毒CRISPR/Cas13a荧光检测体系检测情况。以含有10pM浓度的新型冠状病毒RNA的2％血清为初始样本，试剂盒提取方法采用天隆血浆病毒核酸提取试剂盒及配套仪器进行核酸提取；而对于加热预处理方法，取200ul样本加入终浓度分别为 100mM和1mM的TCEP、EDTA，50℃裂解20分钟，95℃失活5分钟后用于上述检测体系检测。检测结果发现，试剂盒提取的样本用作模板，检测信号高于加热预处理初始样本方法。但不影响检测结果的判读。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于，包括了Cas13a及其缓冲液、介导RNA、荧光报告分子，所述的介导RNA与新型冠状病毒核酸的保守靶基因段互补，当所述的介导RNA与新型冠状病毒核酸的保守靶基因段互补时所述的Cas13a被激活，切断处于荧光猝灭的所述的荧光报告分子，产生荧光信号。
2.如权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的Cas13a为不同原核生物分离得到的CRISPR核酸酶。
3.如权利要求1或2所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的介导RNA包括5’端的重复子序列和3’端的靶向序列，二级结构为5’端重复子折叠成发夹结构而3’端呈线性结构。
4.如权利要求3所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的介导RNA的5’端重复子序列为5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，3’端靶向序列为靶向新型冠状病毒、并与病毒互补的28个寡核苷酸特异序列。
5.如权利要求4所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的介导RNA的分子序列为：
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCUCCUGAUGAGGUUCCACCUGGUUU-3’。
6.如权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的荧光报告分子为ssRNA-FQ，其5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团的寡核苷酸分子。
7.如权利要求6所述的一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针，其特征在于：所述的荧光报告分子序列为5’-FAM-UUUUU-BHQ1-3’。
8.一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸检测探针的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒采用权利要求1-7任意一项检测探针，还包括有试剂盒盒体和检测垫，所述的检测垫设置于试剂盒盒体内，所述的试剂盒盒体上开设有加样口和检测口，所述的检测探针负载于检测垫上，通过缓冲液的冲洗待测样从加样口加入于检测口进行荧光检测。
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