WO2010102460A1 - 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒 - Google Patents

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WO2010102460A1
WO2010102460A1 PCT/CN2009/071018 CN2009071018W WO2010102460A1 WO 2010102460 A1 WO2010102460 A1 WO 2010102460A1 CN 2009071018 W CN2009071018 W CN 2009071018W WO 2010102460 A1 WO2010102460 A1 WO 2010102460A1
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real
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mmol
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高峰
刘震
许守民
汲勇
李桂民
郭凤尧
李望丰
张海燕
李显林
傅可为
于河舟
刘立霞
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东北制药总厂
沈阳奥美亚生物工程有限责任公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention belongs to the field of biomedical clinical diagnosis, and provides a high sensitivity and high specificity method for qualitatively and quantitatively detecting genetic material of pathogenic microorganisms by using LUX (Light Upon eXtention) fluorescent primer real-time PCR (polymerase chain reaction) detection technology Its kit. It can be used for clinical blood testing and diagnosis to determine the condition of patients infected with pathogenic microorganisms, to monitor and evaluate the efficacy of drugs, and to be used for blood screening and epidemiological investigations at central blood stations.
  • LUX Light Upon eXtention
  • fluorescent primer real-time PCR polymerase chain reaction
  • this technique still has the disadvantages of complicated operation, low sensitivity and high cost when performing multiple pathogenic microbial detection and determining pathogen load, and the detection technology needs to be improved and improved.
  • the key to the technology to be solved is to further increase the specificity and sensitivity of the test, and to reduce the cost and standardization of the method.
  • Fluorescence quantitative PCR technology in nucleic acid molecule detection technology has been widely used in molecular biology research and medical research. This technology not only realizes the quantification of DNA/RNA templates, but also has high sensitivity and specificity, can achieve multiple reactions, high degree of automation, pollution-free, real-time and accurate, and can be used for human immunodeficiency virus, hepatitis virus, Quantitative determination of pathogenic microorganisms such as influenza virus, human papillomavirus, herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, S.
  • pathogenic microorganisms such as influenza virus, human papillomavirus, herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, S.
  • the commonly used real-time fluorescent quantitative PCR technology for pathogenic microorganisms includes probes and dyes.
  • Probes are probes that specifically hybridize to target sequences to indicate an increase in amplification products. Fluorescent probe technology is based on the FRET principle of labeling groups. Several related techniques have been developed, such as TaqM an TM Probes, two-hybrid probes, molecular beacons, AmplisensOT, etc. However, the above-mentioned fluorescent probe technology increases the identification step of the probe, and although the accuracy is greatly improved, there is still a problem of high cost. For example, TaqManTM technology marks the fluorescent emission group (R) and the quenching group (Q) on both ends of a 20 - bp oligonucleotide probe, and sets up a standard template series and a negative control in the PCR reaction. .
  • HBV fluorescent quantitative PCR detection kit published by CN101158634A, "C-hepatitis C virus (HCV)-step fluorescence quantitative RT-PCR detection method and kit thereof", publication number CN101250592A, announcement
  • HCV Hepatitis C virus
  • Dyes are indicative of an increase in amplification products using rational features that bind to the minor groove of the double-stranded DNA.
  • SYBR Green I is a double-stranded DNA binding dye that binds to a minor groove. When combined with double-stranded DNA, its fluorescence is greatly enhanced. It has good versatility and low price relative to probes, but due to its binding to all double-stranded DNA, it is false positives due to primer dimers, single-stranded secondary structures, and incorrect amplification products. It will affect the accuracy of quantitative determination of amplification products, so there is a problem of insufficient detection accuracy during its use, and its sensitivity and precision are far less than that of fluorescent probe technology.
  • LUX primers In response to the problems of the above probes and fluorescent dyes, LUX primers have emerged, and such LUX primers utilize fluorescence. A new technique for quantification of labeled primers allows the primers to function as fluorescent probes at the same time.
  • the use of LUX primers does not require the design of probes, which saves costs and provides relaxed conditions for experimental design. Although its specificity is weaker than that of the probe, it is not affected by non-specific amplification, so its specificity is stronger than that of fluorescent dyes. At present, there are few new technologies applied at home and abroad.
  • the patent publication number CN1952174A "Special detection of bovine herpesvirus type I LUX fluorescent primers and nucleic acid amplification method" is the use of LUX primers to realize real-time PCR technology.
  • this patent only detects bovine herpesvirus type I (BHV-1), which does not involve any kind of human pathogenic microorganisms, and its application is very limited.
  • nucleic acids were extracted using QIAGEN DNA KIT technology, and the detection was simple and not precise enough.
  • the object of the present invention is to provide a method and a kit for simultaneously qualitatively and quantitatively detecting genetic material of a plurality of pathogenic microorganisms, and fundamentally solve the problems of complicated design and high cost of the existing fluorescent probe quantitative PCR technology, and the design thereof
  • the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer has the advantages of high sensitivity, high specificity and good stability.
  • the nucleic acid DNA/RA extraction method is simple and rapid, and the reverse transcription and real-time PCR detection process is completed in one step.
  • LUX's self-quenching single-labeled fluorescent primers are simple in design, easy to operate, low in cost, and easy to use. They are especially suitable for accurate quantitative detection of pathogenic microorganisms.
  • the technical scheme of the invention is: the method for qualitatively and quantitatively detecting the genetic material of the pathogenic microorganism, the technical point thereof comprises extracting the total nucleic acid of the pathogenic microorganism in the sample by using the nano magnetic beads method, and using the LUX-fluorescent labeling primer technology to complete the specimen.
  • Template real-time PCR or real-time RT-PCR detection process in which: LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and phases are designed with high conservatism, specificity and high efficiency by analyzing the DNA/RNA information of pathogenic microorganisms by special software.
  • the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer contains a hairpin structure and labels one of the following different color fluorophores: FAM, Alexa546, JOE, HEX, TET, the LUX itself quenches the single-labeled fluorescent
  • the PCR product of the primer is in the range of 60-120 base pairs, and in the real-time PCR reaction solution, a LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer or a plurality of the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers are added and monitored. Changes in fluorescent signals of different colors in a real-time PCR reaction system to achieve one or more pathogens in the sample Qualitative and quantitative detection thereof.
  • the real-time RT-PCR detection uses a one-step method to perform reverse transcription and real-time PCR detection of RA in the total nucleic acid of the pathogenic microorganism extracted from the sample, that is, adding reverse transcriptase and real-time PCR reaction solution in the real-time PCR reaction system. .
  • the nano magnetic beads method for extracting the total nucleic acid of the pathogenic microorganism in the sample is as follows: first, 400 ⁇ l of the sample is dissolved, and the sample is resuspended by adding 200 ⁇ l of the lysate, and the solution is immersed in a water bath at 65 ° C for 10 min, and the lyophilized solution of the ⁇ is added, and the ice bath is mixed.
  • Master Mix (5 ⁇ ) consists of:
  • the sample includes blood, semen, and saliva of a human or animal source.
  • the pathogenic microorganisms include viruses, bacteria, and other pathogenic microorganisms.
  • a kit for qualitatively and quantitatively detecting a genetic material of a pathogenic microorganism comprising a nucleic acid extraction reagent, a nucleic acid amplification reagent, a reference substance, and a standard, wherein the technical point is: the nucleic acid extraction reagent comprises a nano magnetic bead and a lysate , a binding solution, a rinsing liquid, an eluent, wherein a group of lysing liquids is: ⁇ 8.0 of 50 mmol/L Tris-HCK pH 8.0 of 10 mmol/L EDTA, 1% SDS, 4 mol/L guanidinium isothiocyanate, Carrier RNA 1 ⁇ ⁇ , lysate 2 is 0.5mol / L KAC, the composition of the binding solution is: 5mol / L guanidinium isothiocyanate, pH 6.6 20mmol / L Tris-HCl, 37.5% ethanol, the composition of the rinse
  • LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and corresponding unlabeled primers designed for hepatitis B virus HBV, hepatitis C virus HCV, HIV HIV-1, T-lymphocytic leukemia virus HTLV, and Treponema pallidum TP, respectively, in the nucleic acid amplification reagent The sequence is as follows:
  • Reverse primer GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
  • Reverse primer GCGGGTTGATCCAAGAAAGG
  • T-lymphocytic leukemia virus HTLV LUX primer forward: AAGGAACTGTAGAGCTGAGCc (ALX546)G
  • Reverse primer GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT
  • the Real time PCR Premix 5X further includes 5 mmol/L of MgCl 2 , 0.6 mg/ml of BSA, pH 8.3 of 20 mmol/L Tris-HCl, 75 mmol/L of KC1, 25 mmol/L of dNTP; HotStar Taq enzyme , PCR enhancer, protective agent.
  • Reverse transcriptase and R A enzyme inhibitors are also included in the Real time PCR Premix 5X.
  • the kit is a single kit for detecting a pathogenic microorganism or a combined kit for simultaneously detecting a plurality of pathogenic microorganisms.
  • Primer design is highly specific and has broad-spectrum cross-reaction: As a method for quantitatively detecting genetic material of pathogenic microorganisms, LUX-fluorescent labeling primer technology is used to complete real-time PCR or real-time RT-PCR detection of specimen templates. According to the analysis and comparison of the target gene sequences of various pathogenic microorganisms, the design of LUX self-quenching single label was designed by designing highly conserved, specific and highly efficient LUX self-quenching single-labeled fluorescent arch I and corresponding unlabeled primers.
  • Fluorescent arch I contains a hairpin structure and labels one of the following different fluorescent groups: FAM, Alexa546, JOE, HEX, TETo
  • the kits for this test are for hepatitis B virus HBV, hepatitis C virus HCV, AIDS Viral HIV-1, T-lymphocytic leukemia virus HTLV designed LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers, which are highly conserved and can cover different subtypes or varieties of pathogens, which is beneficial to application and promotion.
  • a method for simultaneously detecting a plurality of pathogenic microorganisms in one sample is also established, including simultaneous detection of hepatitis B virus, hepatitis C virus and HIV.
  • the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer used in the present invention provides sensitive, specific and accurate real-time PCR amplification by using special primers designed according to the target gene sequence. And testing.
  • the detection technology uses a self-developed PCR reaction system and optimizes various reaction conditions such as the concentration of each component of the reaction system, the detection annealing temperature and time, and the detection sensitivity reaches 50 copies/ml, reaching 7 An order of magnitude dynamic range increases the efficiency, specificity and stability of real-time PCR reactions.
  • the technology is easy to operate, fast detection, low cost, easy to apply:
  • Use the paramagnetic nano magnetic beads method to extract the total nucleic acid of pathogenic microorganisms in the sample, that is, extract the pathogen DNA/RNA, and then use one-step method to complete the total pathogenic microorganisms extracted from the sample.
  • Reverse transcription and real-time PCR detection of RNA in nucleic acids is simple, rapid, and inexpensive, and reduces the potential for cross-contamination. Easy to develop as an automated inspection system for high-throughput screening of large numbers of samples. Therefore, the reaction system can be used for real-time PCR detection of DNA pathogenic microorganisms, and can also be used for real-time RT-PCR detection of R A pathogenic microorganisms.
  • LUX-fluorescent labeling primer technique when using the LUX-fluorescent labeling primer technique, all that is required is a single reporter dye-labeled fluorescent primer and a corresponding unlabeled primer.
  • the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers can be either positive or reversed, making them simpler and less expensive than TaqMan probes.
  • the samples tested in the present invention include blood, semen and saliva of human or animal origin, and pathogenic microorganisms include viruses, bacteria and other microorganisms.
  • pathogenic microorganisms include viruses, bacteria and other microorganisms.
  • Suitable for routine blood sample testing also suitable for automated and high-throughput testing. Can judge the condition, prognosis and infectivity of infectious diseases, predict the effect of antiviral therapy, monitor and evaluate antiviral
  • the efficacy of drugs, improving the screening quality of blood and blood products and their application in epidemiological investigations provide an important reference for the monitoring and treatment of clinical pathogens and the screening of drugs.
  • the invention adopts a single-labeled self-quenching fluorescent primer and does not require a probe, so the design is simple and the detection cost is reduced, and the detection result can be analyzed by the melting point curve, which is advantageous for the promotion of the method and the development of the commercial kit.
  • This kit is used to detect 30 positive samples including HBV and HIV-1 in parallel with the kits produced by Shenzhen Piki and Shanghai Kehua.
  • the detection rate is 100%, and the sensitivity is better than the above kit.
  • the minimum detection limit is 50 CO pie S /ml.
  • Figure 1 is a standard curve of fluorescent real-time PCR for detecting HBV virus nucleic acid
  • Figure 2 is a standard curve of fluorescent real-time RT-PCR for detecting HCV viral nucleic acid
  • Figure 3 is a standard curve of fluorescent real-time RT-PCR for detecting HIV-1 viral nucleic acid
  • Figure 4 is a standard curve of fluorescent real-time RT-PCR combined detection of HBV, HCV, and HIV viral nucleic acids.
  • the method for qualitatively and quantitatively detecting genetic material of pathogenic microorganisms comprises extracting total nucleic acid of pathogenic microorganisms in the sample by using paramagnetic nano magnetic beads method, and performing real-time PCR or real-time RT-PCR detection on the sample template by using LUX-fluorescent labeled primer technology. process.
  • a LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer or a plurality of different color LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers are added to monitor the change of fluorescent signals of different colors in the real-time PCR reaction system.
  • LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and corresponding unlabeled primers were designed according to the analysis and comparison of the target gene sequences of pathogenic microorganisms by special software.
  • LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers contained hairpins. Structure and label the fluorescent group of one of the following different colors: FAM, Alexa546 JOE, HEX, TET, LUX self-quenching the PCR product of the single-labeled fluorescent primer in the range of 60-120 base pairs.
  • Samples that can be detected by this assay include blood, semen, and saliva from a source of human or animal origin.
  • the pathogenic microorganisms include viruses, bacteria and the like.
  • Reagents Various plasmids containing HIV-1, HBV and HCV sequences were deposited by Northeast Pharmaceutical Group Research Institute; HotStarTaq enzyme ( Takara TaqTM Hot star version, commercial product number DR007A), M-MLV reverse transcriptase (Reverse) Transcriptase M-MLV, product number D2640C), RNase inhibitor ( Ribomiclease Inhibitor, product number D2310C), Proteinase K (product number D9033), dUTP (product number R0133), UDG (product number EN0361), etc. were purchased from Dalian Bao Bioengineering Ltd.; Ordinary PCR primers, oligo, etc.
  • Tris (product number TB0194), MgCl 2 (product number NB0328), BSA (product number A1653), guanidine hydrochloride (product number 50950), guanidinium isothiocyanate (product number G0380), NaOH (product number M0173), HAC ( Product No. 20070723 ), SDS (commodity No. SB0485 ), EDTA (commodity No. 1926B030), etc. were purchased from Baotek Biotechnology Co., Ltd.; Nano Magnetic Beads (commodity No. S ML-015) were purchased from Shanghai Aorun Weina New Material Technology Co., Ltd. .
  • LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and corresponding unlabeled primers designed for highly conserved, specific and efficient LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers by special software, based on analysis and comparison of DNA/RNA information of pathogenic microorganisms.
  • the PCR product of the self-quenching single-labeled fluorescent primer is in the range of 60-120 base pairs.
  • Fluorescent primers can be either positive or reverse.
  • LUX-primer acts both as a nucleic acid probe and as a PCR amplification primer.
  • Primer synthesis and labeling synthesized by INVOTROGEN and fluorescently labeled.
  • sequences of the LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and corresponding unlabeled primers enumerated in the present invention are as follows:
  • Hepatitis B virus HBV (Conserved sequence of Accession No EU 595031 in GenBank)
  • Reverse primer GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
  • Hepatitis C virus HCV (Conserved sequence of Accession No AY 460204 in GenBank)
  • Reverse primer GCGGGTTGATCCAAGAAAGG
  • HIV HIV-1 (Accession No AF 286226. 1 conserveed Sequence in GenBank)
  • T-lymphocytic leukemia virus HTLV (Conservative sequence of Accession No AF 259264 in GenBank)
  • Spirulina syphilis TP (Conserved sequence of Accession No AE 008691 in GenBank)
  • Reverse primer GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT
  • More LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers can be designed as needed, and are suitable for the detection method of the present invention.
  • the extracted nucleic acid is RNA or contains RNA, it must be stored at 4 ° C and used for PCR amplification within 12 hours, because R A is highly susceptible to degradation by Rase.
  • the probe magnetic bead method and the general nucleic acid extraction method are also applicable to the detection technique of the present invention.
  • the nucleic acid type of the virus is DNA.
  • preparation of hepatitis B virus HBV standard the plasmid containing the full sequence of HBV is quantified and diluted to 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 with a sterile double distilled water.
  • lOVopies ⁇ L virus DNA calculation formula is as follows:
  • the nucleic acid type of the virus is RNA.
  • preparation of HCV and HIV-1 standards PCR reactions were carried out using primers containing the T7 promoter sequence, using HCV and HIV-1 full-length plasmids as templates, and then using the PCR product as a template and using an in vitro transcription system. Transcription reaction; the RA product was purified and quantified by a nucleic acid protein analyzer and diluted to 10 6 , 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 , 10 . Documents ⁇ l.
  • the virus RNA calculation formula is as follows:
  • Copy number (ng of RNA/ number of bps x 330) x 6.02 x 10 14
  • the fluorescent PCR instrument detects the fluorescence signal generated by each reaction tube, and the signal intensity exceeds the detector threshold.
  • the number of PCR amplification cycles (called CT) and the template content in the specimen are The negative logarithmic relationship is automatically recorded for the instrument.
  • the real-time fluorescence PCR instrument can realize the fluorescence signal change diagram of the whole process of specimen template amplification, which can visually judge the positive and positive of the specimen and distinguish its strength. Since the gradient of the positive control is set, the fitness of the gradient curve can determine the reliability of each test, and the virus copy number of the tested sample can be obtained from the curve comparison. In this way, the number of copies of the virus and virus in the sample can be obtained in the same test.
  • Real-time RT-PCR detection uses one-step method to perform reverse transcription and real-time PCR detection of RA in the total nucleic acid of pathogenic microorganisms extracted from the sample, that is, simultaneous addition of reverse transcriptase and real-time PCR reaction solution in the total reaction system.
  • the template is DNA, such as HBV, and the reaction system is:
  • the template is RNA, such as HIV-1, HCV, HTLV, etc.
  • the reverse transcription enzyme 2 U, RNase inhibitor, and reverse transcription primer are added to the real-time PCR reaction solution, and the total volume is still 50 ⁇ l.
  • the reaction system is:
  • Master Mix (5 ⁇ ) consists of:
  • reaction parameters were set according to different fluorescence types and amplification procedures: template for DNA, such as HBV, using program 1; template for R A, such as HIV-1, HCV, HTLV, using procedure 2. Put in the reaction plate or tube and turn it on. During the reaction, the fluorescence signal of each sample can be observed in real time through a computer.
  • the positive control should have an amplification curve with a Ct value before 25; the Ct value of the negative control should be greater than 40, at NTC. after that.
  • the positive template is HBV, HCV or HIV plasmid quantification standard, and the negative template is sterile double distilled water. If the Ct value is less than 40 and a typical amplification curve is present, it is judged to be a positive result; if the Ct value is greater than 40 or no amplification curve, a negative result is determined. Test samples larger than 1.0 l0 6 copies/ml can report the corresponding copy number according to the actual measured value. For samples with positive test results, the pathogenic microbial load in the sample was calculated based on the established quantitative standard curve (Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3).
  • HBV, HCV, HIV-unlabeled primer each 0.5 ⁇ 1
  • HBV, HCV, HIV- LUX marker primer each 0.5 ⁇ 1
  • HIV reverse transcription primers 0.5 ⁇ 1 each
  • Master Mix (5 ⁇ ) consists of:
  • the fluorescence PCR machine On the fluorescence PCR machine, set the reaction parameters according to different fluorescence types and amplification procedures, put them into the reaction plate or tube, and turn on the test. During the reaction, the fluorescence signal of each sample can be observed in real time through a computer.
  • the amplification curve, Ct value and concentration of each sample can be viewed in the quantitative analysis mode.
  • the positive control should have an amplification curve, and the negative control has the largest Ct value after NTC.
  • the corresponding copy number may be reported according to the actual measured value, or the sample may be re-measured by diluting the normal human plasma into the linear range of quantitative detection of the kit.
  • results After the reaction is completed, in the quantitative analysis mode, the amplification curve, Ct value and concentration of each sample are observed.
  • the positive control should have an amplification curve, and the Ct value is before 25; the Ct value of the negative control should be More than 40, after NTC.
  • the positive template is HBV, HCV or HIV plasmid quantification standard, and the negative template is sterile double distilled water. If the Ct value is less than 40 and a typical amplification curve is present, it is judged to be a positive result; if the Ct value is greater than 40 or no amplification curve, a negative result is determined.
  • Test samples larger than 1.0x10 6 CO pie S /ml can report the corresponding copy number according to the actual measured value. The sample with positive test results calculates the pathogenic microbial load in the sample based on the established quantitative standard curve and the dilution factor of the sample.
  • Fluorescence real-time RT-PCR detects the results of blood samples containing hepatitis B virus (HBV) HIV (HIV).
  • the blood sample containing virus is 100% efficient, and the hepatitis B virus load is between 5xl0 3 -10 6 copies/ml.
  • the HIV load is between 3xl0 2 -10 3 copies/ml.
  • the invention particularly designs a kit for qualitatively and quantitatively detecting genetic material of a pathogenic microorganism, which is a single kit for detecting a pathogenic microorganism or a combined kit for simultaneously detecting a plurality of pathogenic microorganisms. It is mainly composed of nucleic acid extraction reagents, nucleic acid amplification reagents, reference materials, standards, and the like. Among them: the nucleic acid extraction reagent includes nano magnetic beads, lysate, binding solution, rinsing liquid and eluent, wherein a group of lysing liquids is: 50 mmol/L Tris-HCl at pH 8.0, 10 mmol/L EDTA at pH 8.0.
  • nucleic acid amplification reagent consists of eal time PCR Premix 5 and DEPC water, Real time PCR Premix 5X contains LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers designed for pathogenic microbial genetic material and their corresponding Mark one or more of the markers;
  • the positive control in the control is non-infectious DNA or in vitro transcription of RA, the negative control is sterile double distilled water, and the strong positive control is non-infectious DNA or viral RNA;
  • the product is a gradient dilution containing a plasmid of the pathogenic microbial DNA/RNA sequence.
  • Real time PCR Premix 5X also includes 5mmol/L MgCl 2 , 0.6mg/ml BSA, pH 8.3 20mmol/L Tris-HCl, 75mmol/L KC1, 25mmol/L dNTP, HotStar Taq enzyme, PCR enhancer, protective agent. Reverse transcriptase and RNase inhibitors are also included in Real time PCR Premix 5X when detecting the presence of template RNA in the virus.
  • Hepatitis B virus HBV, hepatitis C virus HCV, HIV HIV-1, T-lymphocyte white in nucleic acid amplification reagents The sequences of LUX self-quenching single-labeled fluorescent primers and corresponding unlabeled primers designed by blood virion virus HTLV and syphilis spirulina TP were as follows:
  • Reverse primer GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG is recorded as SEQ.ID.NO.2
  • Reverse primer GCGGGTTGATCCAAGAAAGG is recorded as SEQ.ID.NO.4
  • T-lymphocytic leukemia virus HTLV T-lymphocytic leukemia virus
  • Reverse primer GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT is recorded as SEQ.ID.NO.10
  • HBV DNA Amplification of the conserved region of HBV DNA using fluorescently labeled LUX (Light Upon extension) primers and real-time PCR technology.
  • the detection limit is SxlO ⁇ xli ⁇ copies/mL.
  • This kit can quantitatively detect HBV from human plasma or serum samples. DNA, suitable for the diagnosis of HBV infection and the detection of anti-HBV drug treatment.
  • the solution ⁇ is a lysate: 50 mmol/L Tris-HCl at pH 8.0, 10 mmol/L EDTA at pH 8.0, 1% SDS, 4 mol/L guanidinium isothiocyanate, Carrier RA lg
  • solution B is a lysate: 0.5 mol/L KAC
  • solution C is a binding solution: 5 mol/L guanidinium isothiocyanate
  • solution D is a rinse solution: 20 mmol/L NaCK pH 7.5 2 mmol/L Tris-HCl, 80% ethanol
  • HBV Real time PCR Premix 5 includes MgCl 2 5 mmol/ L, 0.6 mg/ml BSA, pH 8.3 Tris-
  • BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector; IBA fluorescence PCR detector
  • Fluorescein was set to TAMARA; fluorescence signal collection was set at 72 °C.
  • the baseline should take 3-10 or 3-15 cycles of fluorescence signal.
  • the baseline is taken as 2-10 or 2-15 cycles of fluorescence signal.
  • the threshold can be adjusted according to the instrument noise.
  • the corresponding copy number can be reported according to the actual measured value, or the sample can be diluted with the normal human plasma to the linear range of the quantitative detection of the kit and then re-measured. .
  • the negative control HBV DNA was considered to be 0.0 copy/ml. [Quality Control Standard]
  • the negative control Ct should be higher than the standard 6 . Strong positive control 0 value ⁇ 25.0; strong positive control 0 value ⁇ critical positive control Ctfl ⁇ 30.0; otherwise the experiment is considered invalid. All experiments were reworked from sample processing.
  • HIV-1 human immunodeficiency virus
  • the conserved region of (cDNA) was amplified, and the detection limit was Sxlo SxlO ⁇ opies/mL.
  • the primers were optimized to have the same amplification efficiency for the major HIV-1 B and C subtypes in China.
  • This kit can quantitatively detect HIV-1R A in human plasma samples, and is suitable for the detection of HIV-1 infection and the detection of anti-HIV-1 drug treatment.
  • HIV-1 Real time PCR Premix 5x 300 ⁇ x 2 tube
  • Positive working standard 1 1> ⁇ 10 6 copies/ml 20 ⁇ ⁇ 1 ⁇
  • Positive working standard 2 1> ⁇ 10 5 copies/ml 20 ⁇ ⁇ 1 ⁇
  • Positive working standard 3 1> ⁇ 10 4 copies/ml 20 ⁇ ⁇ 1 ⁇
  • Positive working standard 4 1> ( 10 3 copies/ml 20 ⁇ ⁇ I ⁇
  • Positive working standard 5 1> ( 10 2 copies/ml 20 ⁇ ⁇ I ⁇
  • Positive working standard 6 1> ( 10 1 copies/ml 20 ⁇ ⁇ I ⁇
  • HIV-1 Real time PCR Premix 5x includes 5 mmol/L of MgCl 2 , 0.6 mg/ml of BSA, pH 8.3 of 20 mmol/L of Tns-HCl, and 75 mmol/L of KCl. 25mmol/L dNTP, HotStar Taq enzyme, PCR enhancer, protectant, reverse transcriptase and RA enzyme inhibitor, wherein: LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer and its corresponding unlabeled primer are SEQ.ID.N0. 5 and SEQ. ID. N0.6. [Applicable instrument]
  • BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector; IBA fluorescence PCR detector
  • RNA Since RNA is most susceptible to RNase degradation, it must be kept at 4 °C and used for PCR amplification within 12 hours.
  • the HIV-1 Real time PCR Premix (5x) standard was taken out of the kit, thawed at room temperature and vortexed, and centrifuged at 2000 rpm for 10 sec; Set the number of PCR reaction tubes to n, calculate the amount of each reagent, add it to a suitable volume centrifuge tube, mix well and centrifuge at 2000 rpm for 10 sec; The sample was dispensed into a PCR reaction tube (plate), and a sample (R A) was added.
  • the reaction system was prepared as shown in the following table. The cover film was centrifuged at 2000 rpm for 10 sec in a 96-well plate centrifuge, and then transferred to the detection zone. Place the reaction tubes in a fluorescent PCR detector and record the sample placement sequence.
  • the fluorescein setting was determined by the type of fluorescent label; the fluorescence signal was collected at 72 °C.
  • BIO-RAD iCycler instrument When using the BIO-RAD iCycler instrument, set the calibrator to "STD" and enter the copy number when the conditions are set before the start of amplification. Set the sample to be tested and the reference to "U KN", using PE Gene. The standard copy number can be set before or after the amplification of the Amp 5700 and 7700 real-time PCR detectors.
  • the baseline should take 3-0 or 3-15 cycles of fluorescence signal.
  • the baseline is taken as 2-10 or 2-15 cycles of fluorescence signal.
  • the threshold can be adjusted according to the instrument noise.
  • the HIV-1 cDNA in the test sample is ⁇ 5.0x10 6 copies/ml, and the corresponding copy number can be reported according to the actual measured value.
  • the sample can also be diluted with normal human plasma to the linear range of quantitative detection of the kit. After re-measurement.
  • Negative control HIV-1 gene copy number is considered to be 0.0 copy/ml.
  • Kit implementation case for combined detection of three viruses (hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus) using LUX fluorescence PCR
  • kits Simultaneous amplification of conserved regions of HBV DNA, HCV and B HIV-1 RNA (cDNA) using fluorescently labeled LUX (Light Upon extension) primers and real-time PCR technology,
  • This kit can be used for qualitative and quantitative detection of HBV DNA, HCV and HIV-1 in human plasma samples, especially for clinical blood tests and blood screening of a large number of samples in central blood stations.
  • Positive working standard 2 1 : ⁇ 10 5 copies/ml 20 ⁇ X l
  • Positive working standard 3 1 : ⁇ 10 4 copies/ml 20 ⁇ X 1 ⁇
  • Positive working standard 5 1 > ⁇ 10 2 copies/ml 20 ⁇ X 1 ⁇
  • Real time PC Premix 5x includes 5mmol/L MgCl 2 , 0.6mg/ml BSA, pH 8.3 20mmol/L Tris-HCl, 75mmol/L KC1, 25mmol/L dNTP, HotStar Taq enzyme, PCR enhancement Agent, protectant, reverse transcriptase and RNase inhibitor, wherein: LUX self-quenching single-labeled fluorescent primer and its corresponding unlabeled primer are: SEQ.ID.N0.1, SEQ.ID.NO.2; SEQ .ID.N0.3 SEQ.ID.NO.4; SEQ.ID.N0.5, SEQ.ID.N0.6.
  • BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector BIO-RAD iCycler fluorescence PCR detector; IBA fluorescence PCR detector
  • the baseline should take 3-10 or 3-15 cycles of fluorescence signal.
  • Negative control HBV or HCV or HIV-1 gene copy number is considered to be 0.0copy/ml.
  • This kit can also be used for qualitative and quantitative detection of other viruses or bacteria, such as T-lymphocytic leukemia virus HTLV, influenza virus, human papilloma virus, herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, syphilis TP, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, and Ureaplasma urealyticum.
  • viruses or bacteria such as T-lymphocytic leukemia virus HTLV, influenza virus, human papilloma virus, herpes simplex virus, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, syphilis TP, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, and Ureaplasma urealyticum.

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Description

定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物医学临床诊断领域， 提供了一种高灵敏度、 高特异性的利用 LUX (Light Upon eXtention)荧光引物实时 PCR (聚合酶链式反应）检测技术定性定量检测病原微生物遗 传物质的方法及其试剂盒。 可适用于临床血液检测和诊断， 从而判断病原微生物感染者的病 情， 监测和评价药物的疗效， 也可用于中心血站血液筛査以及流行病学调査。
背景技术
在我国多种流行性传染病的病原微生物， 如艾滋病， 病毒性肝炎， 结核， 梅毒等， 对人 类健康造成了巨大危害。 临床上主要应用免疫学和微生物学等方法对各种病原微生物进行检 测和诊断， 由于其灵敏性低和周期长等限制， 仍不能完全杜绝阳性病原体的漏检和不能及时 准确地诊断。 近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势， 相比较 免疫诊断技术具有灵敏度好、 特异性强和诊断快速等优点。 但这项技术在进行多种病原微生 物检测并且确定病原体载量时仍存在操作复杂， 灵敏性低和成本高等缺点， 检测技术需要改 进和提高。 需要解决的技术关键是进一步提高检测的特异性和灵敏度， 降低成本和方法的标 准化。
核酸分子检测技术中的荧光定量 PCR技术已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领 域。 这项技术不仅实现了对 DNA/RNA模板的定量， 而且具有灵敏度和特异性高、 能实现多 重反应、 自动化程度高、 无污染、 实时和准确等特点， 可以对人类免疫缺陷病毒、 肝炎病毒、 流感病毒、 人类乳头瘤病毒、 单纯疱疹病毒、 EB病毒、 巨细胞病毒、 梅毒螺旋菌、 结核分枝 杆菌、 淋球菌、 沙眼衣原体和解脲支原体等病原微生物进行定量测定。 目前， 常用的病原微 生物实时荧光定量 PCR技术包括探针类和染料类两种。
探针类是利用靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加， 荧光探针技术是基于标记 基团的 FRET原理而实现的， 已经开发出几种相关的技术，如， TaqMan TM探针、双杂交探针、 分子信标、 AmplisensOT等。 然而上述荧光探针技术增加了探针的识别步骤， 其精确度方面虽 然有了很大提高， 但仍存在着成本较高的问题。 如 TaqManTM技术是在一条 20多 bp的寡核 苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团 （R)和淬灭基团 （Q) ，在 PCR反应中设立标准品 模板系列和阴性对照。 在检测过程中， 其荧光探针和扩增引物是分开的， 而且荧光探针要求 连接上淬灭基团， 这样就在探针的合成中增加了设计复杂性和检测成本。 公开号为 CN101158634A的"乙型肝炎病毒 (HBV)荧光定量 PCR检测试剂盒"、公开号为 CN101250592A 的"丙型肝炎病毒 (HCV)—步荧光定量 RT-PCR 检测方法及其试剂盒"、 公告号为 CN100340673C的"人类免疫缺陷病毒 HIV-1核酸扩增-荧光定量检测试剂盒"等专利申请文件 中均采用了上述荧光探针技术。
染料类是利用与双链 DNA 小沟结合发光的理性特征指示扩增产物的增加。 如， SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链 DNA结合染料。 与双链 DNA结合后， 其荧光大大增强。 其通用性好， 且价格相对探针类较低， 但是由于其与所有的双链 DNA相结合， 因此由引物 二聚体、 单链二级结构以及错误的扩增产物弓 I起的假阳性会影响对扩增产物定量的精确性， 所以其使用过程中存在着检测精度不足的问题， 其灵敏性和精准度远不及荧光探针技术。
针对上述探针和荧光染料存在的问题， LUX引物应运而生， 这种 LUX引物是利用荧光 标记的引物实现定量的一项新技术，使引物同时起到荧光探针的作用。使用 LUX引物不需要 专门设计探针， 即节省了成本， 又给实验设计提供了宽松的条件。虽然其特异性较弱于探针， 但不受非特异性扩增影响， 所以其特异性强于荧光染料。 目前国内外应用这种新型技术的较 少，专利公开号为 CN1952174A的 "特异检测牛疱疹病毒 I型的 LUX荧光引物和核酸扩增方 法"就是利用了 LUX 引物实现实时 PCR技术。 但该专利仅仅检测的是牛疱疹病毒 I 型 (BHV-1 ), 未涉及任何一种人类病原微生物， 其应用面很有局限性。 另外， 其采集样品后利 用 QIAGEN DNA KIT技术提取核酸， 并且检测简单而不够精确。 目前虽已有 LUX荧光法检 测 HIV病毒的报道， 但目前为止仍没有利用 LUX荧光引物进行组合检测多种病原微生物以 及同一病原微生物内多种亚型的报道及专利技术， 公开号为 CN101363063A的 "三重荧光定 量 RT-PCR检测 A、 B和 H5 亚型流感病毒的引物、 探针、 试剂盒及方法" 以及公开号为 CN1940087A 的 "一种同步扩增检测肝炎及艾滋病毒核酸的方法及试剂盒"专利虽然都公开 了一种组合检测病原微生物的方法及其试剂盒， 但其原理均为探针法， 亦存在设计复杂、 成 本高的缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种可同时定性定量检测多种病原微生物遗传物质的方法及其 试剂盒， 从根本上解决现有荧光探针定量 PCR技术存在的设计复杂、成本高等问题， 其设计 的 LUX 自身淬灭单标荧光引物具有灵敏度高， 特异性强、 稳定性好的优点。 同时， 核酸 DNA/R A提取方法简单， 检测快速， 采用一步法完成反转录和实时 PCR检测过程， 既可用 于小规模检测，又适用于大规模高通量的临床检验和血液筛査；其 LUX自身淬灭单标荧光引 物设计简单， 技术容易操作， 成本较低， 便于普及应用， 特别适用于病原微生物精确的定量 检测。
本发明的技术方案是： 该定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 其技术要点是包括 采用纳米磁珠法提取样品中病原微生物总核酸作为标本模板，应用 LUX-荧光标记引物技术完 成对该标本模板实时 PCR或实时 RT-PCR检测过程， 其中： 通过专用软件， 根据分析比较病 原微生物目的 DNA/RNA信息，分别设计高保守性、特异性和高效性的 LUX自身淬灭单标荧 光引物和相对应未标记引物，所述 LUX自身淬灭单标荧光引物含有发卡结构并标记下列其中 一种不同颜色的荧光基团： FAM、 Alexa546、 JOE、 HEX、 TET， 所述 LUX自身淬灭单标荧 光引物的 PCR产物在 60-120个碱基对范围,在实时 PCR反应液中,加入一种所述 LUX自身淬 灭单标荧光引物或多种所述 LUX自身淬灭单标荧光引物，通过监测实时 PCR反应体系中不 同颜色的荧光信号的变化情况实现对样品中一种或多种病原微生物的定性定量检测。
所述实时 RT-PCR检测采用一步法完成对样品中提取的病原微生物总核酸中的 R A的反 转录和实时 PCR检测,即在实时 PCR反应体系中同时加入反转录酶和实时 PCR反应液。
所述纳米磁珠法提取样品中病原微生物总核酸的步骤为:首先， 取 400μ1样品溶化， 加入 200μ1裂解液重悬样品沉淀， 65 °C 水浴 10min， 加入 ΙΟΟμΙ的裂解液， 混匀冰浴 10分钟， 12000rpm离心 10min， 吸取上清； 然后， 加入 400μ1结合液混匀， 加入 25μ1磁珠， 置于磁力 架上吸附磁珠， 吸掉上清； 接下来， 加入 750μ1漂洗液于离心管中， 静置 lmin, 吸掉废液， 重复此步骤一次； 最后在离心管中加入 50μ1洗脱液， 室温放置 2min， 吸附磁珠， 吸取上清， 即为目的总核酸， 置于 4°C或一 20°C保存。 所述实时 PCR反应体系为:
Master Mix (5x) ΙΟμΙ,
一禾中 LUX标记 rimer 0.5μ1 或 多种 LUX标记 primer 各 0.5μ1
相对应未标记 rimer 0.5μ1 或 多种相对应未标记 primer 各 0.5μ1，
HotStar Taq酶 1.5 U
U G酶 0.4μ1
标本模板 (DNA/ NA) 25 μΐ
H20
其中， Master Mix (5 χ)组成为：
5mmol/L的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L Tris-HCl, 75mmol/L 的 KC1， 当所述标本模板为 R A或含有 R A时， 所述实时 PCR反应体系中加入反转录酶 2 U、 RNA酶抑制剂， 逆转录引物， 总体积不变仍为 50μ1。
所述样品包括人源或动物源的血液、 精液、 唾液。
所述病原微生物包括病毒、 细菌和其它病原微生物。
一种应用定性定量检测病原微生物遗传物质的方法的试剂盒， 包括核酸提取试剂、 核酸 扩增试剂、 对照品、 标准品， 其技术要点是： 所述核酸提取试剂中包括纳米磁珠、 裂解液、 结合液、 漂洗液、 洗脱液， 其中裂解液一组成为： ρΗ8.0 的 50mmol/L Tris-HCK pH8.0 的 10mmol/L EDTA、 1%SDS、 4mol/L异硫氰酸胍、 Carrier RNA 1μδ,裂解液二为 0.5mol/L KAC, 结合液组成为： 5mol/L异硫氰酸胍、 pH6.6的 20mmol/L Tris-HCl、 37.5%乙醇， 漂洗液组成 为： 20mmol/L NaCK pH7.5的 2mmol/L Tris-HCK 80%乙醇，洗脱液组成为： pH8.0的 10mmol/L Tris-HCK pH8.0的 lmmol/L EDTA; 所述核酸扩增试剂由 Real time PCR Premix 5X禾 tl DEPC 水组成， 所述 Real time PCR Premix 5X中包含针对病原微生物遗传物质而分别设计的 LUX 自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记引物中的一种或多种； 所述对照品中的阳性对照为非 感染性 DNA或病毒 RNA，阴性对照为无菌双蒸水，强阳性对照为非感染性 DNA或病毒 RNA; 所述标准品为含有病原微生物 DNA/ NA序列质粒的梯度稀释物。
所述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒 HBV、丙肝病毒 HCV、 艾滋病病毒 HIV-1、 T-淋巴细 胞白血病病毒 HTLV、 梅毒螺旋菌 TP分别设计的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相应未标记 引物的序列如下：
乙肝病毒 HBV
LUX primer (forward): CCCCTATCTTATCAACACTTCc (FAM)G
Reverse primer: GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
丙肝病毒 HCV
LUX primer (forward): GAGAGCCATAGTGGTCTGc (JOE)G
Reverse primer: GCGGGTTGATCCAAGAAAGG
艾滋病病毒 HIV-1
LUX primer (reverse): TAATTGTCTGGCCTGTACCGt (ALX546)C
Forward primer: GGAGCAGCAGGAAGCACTATGG
T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV LUX primer (forward): AAGGAACTGTAGAGCTGAGCc (ALX546)G
Reverse primer: GCCACCTGTCCAGAGCATCAG
梅毒螺旋菌 TP
LUX primer (forward):cggttCGTAGGTCTGTCTGGACAACc(JOE)G
Reverse primer:GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT
所述 Real time PCR Premix 5X中还包括 5mmol/L 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3 的 20mmol/L Tris-HCl, 75mmol/L 的 KC1, 25mmol/L 的 dNTP; HotStar Taq酶， PCR增强剂， 保护剂。
所述 Real time PCR Premix 5X中还包括反转录酶和 R A酶抑制剂。
所述试剂盒为检测一种病原微生物的单一试剂盒或是同时检测多种病原微生物的组合试 剂盒。
本发明的优点及所产生的积极的技术效果是：
1、 引物设计特异性强， 具有广谱交叉反应： 由于本定性定量检测病原微生物遗传物质的 方法应用 LUX-荧光标记引物技术完成对标本模板实时 PCR或实时 RT-PCR检测过程， 其通 过专用软件， 根据分析比较各种病原微生物的目的基因序列， 设计高保守性、 特异性和高效 性的 LUX自身淬灭单标荧光弓 I物和相对应未标记引物， 所设计的 LUX自身淬灭单标荧光弓 I 物含有发卡结构并标记下列其中一种不同颜色的荧光基团： FAM， Alexa546, JOE, HEX, TETo所列举的应用本检测方法的试剂盒中针对乙肝病毒 HBV、 丙肝病毒 HCV、 艾滋病病毒 HIV-1 , T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV分别设计的 LUX自身淬灭单标荧光引物， 具有高度保 守性， 可以覆盖其病原体不同的亚型或变种， 有利于应用和推广。 根据对引物进行不同颜色 的荧光标记， 也同时建立了对一种样品中同时检测多种病原微生物的方法， 包括同时检测乙 肝病毒， 丙肝病毒和艾滋病病毒等。
2、 检测技术灵敏性强， 特异和精确： 本项发明使用的 LUX自身淬灭单标荧光引物， 是 通过使用根据目的基因序列设计的特殊引物， 可提供灵敏、特异和精确的实时 PCR扩增和检 测。该检测技术使用了自主开发的 PCR反应体系并优化,对反应体系的各组分的浓度，检测退 火温度和时间等各种反应条件进行调整， 使检测灵敏度达到 50个拷贝 /ml, 达到 7个数量级 的动态范围， 提高了实时 PCR反应的效率、 特异性和稳定性。
3、 技术易操作， 检测快， 成本低， 便于应用： 使用顺磁纳米磁珠法提取样品中病原微生 物总核酸， 即提取病原体 DNA/RNA, 再采用一步法完成对样品中提取的病原微生物总核酸 中的 RNA的反转录和实时 PCR检测， 操作简便、 快速、 成本低廉， 并且降低了交叉污染的 可能性。 易于开发为自动化检测系统， 以便对大量样品的进行高通量筛检。 所以该反应体系 既可用于对 DNA病原微生物的实时 PCR检测，也可用于对 R A病原微生物的实时 RT-PCR 检测。另外，使用 LUX-荧光标记引物技术时，全部所需要的只是一条单一报告子染料标记的 荧光引物和一条相应的未标记引物。该 LUX自身淬灭单标荧光引物可以是正向的，也可以是 反向的， 因此与 TaqMan探针相比， 设计简便， 费用低廉。
4、 应用范围广泛： 本发明所检测的样品中包括人源或动物源的血液、 精液、 唾液， 病原 微生物包括病毒、 细菌以及其它微生物。 适合常规血液样品的检测， 也适合自动化和高通量 检测。 可以判断传染病的病情、 预后和传染性， 预测抗病毒治疗的效果， 监测和评价抗病毒 药物的疗效， 提高血液和血液制品的筛选质量和应用于流行病学调査领域， 为临床病原体载 量的监测和治疗方案以及药物的筛选提供了重要参考。 该发明所采用单标记的自身淬灭荧光 引物， 并且不需要探针， 因而设计简便并降低了检测成本， 且可以通过熔点曲线分析检测结 果， 有利于方法的推广和商业化试剂盒的开发。
本试剂盒与深圳匹基和上海科华生产的试剂盒平行检测 30份包括 HBV和 HIV-1在内的阳性 样品， 检测符合率为 100%， 灵敏性优于以上试剂盒， 最低检测限度为 50COpieS/ml。
附图说明
结合附图对本发明作进一步说明。
图 1是荧光实时 PCR检测 HBV病毒核酸的标准曲线；
图 2是荧光实时 RT-PCR检测 HCV病毒核酸的标准曲线；
图 3是荧光实时 RT-PCR检测 HIV-1病毒核酸的标准曲线；
图 4是荧光实时 RT-PCR组合检测 HBV,HCV,HIV病毒核酸的标准曲线。
具体实施方式
根据图 1-4对本发明作详细描述。 该定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 包括采 用顺磁纳米磁珠法提取样品中病原微生物总核酸作为标本模板，应用 LUX-荧光标记引物技术 完成对该标本模板实时 PCR或实时 RT-PCR检测过程。在实时 PCR反应液中，加入一种 LUX 自身淬灭单标荧光引物或多种不同颜色的 LUX 自身淬灭单标荧光引物， 通过监测实时 PCR 反应体系中不同颜色的荧光信号的变化情况实现对样品中一种或多种病原微生物的定性定量 检测。 通过专用软件， 根据分析比较病原微生物目的基因序列， 分别设计高保守性、 特异性 和高效性的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相对应未标记引物， LUX自身淬灭单标荧光引物 含有发卡结构并标记下列其中一种不同颜色的荧光基团： FAM、 Alexa546 JOE、 HEX, TET， LUX自身淬灭单标荧光引物的 PCR产物在 60-120个碱基对范围。 该检测方法可以检测的样 品包括人源或动物源的血液、 精液、 唾液。 其中的病原微生物包括病毒、 细菌等。
1、 本发明所涉及的主要材料， 仪器设备和样品来源如下：
( 1 )试剂:各种含有 HIV-1， HBV和 HCV序列的质粒由东北制药集团研究院保存； HotStarTaq 酶 ( Takara Taq™ Hot star version,商品号 DR007A) , M-MLV反转录酶（ Reverse Transcriptase M-MLV ， 商品号 D2640C) ， RNase抑制剂 （ Ribomiclease Inhibitor， 商品号 D2310C) ， Proteinase K (商品号 D9033 ) ， dUTP (商品号 R0133 ) ， UDG (商品号 EN0361 )等购自大 连宝生物工程有限公司； 普通 PCR引物， oligo等由上海生工生物工程有限公司合成， LUX 荧光标记引物由 Invitrogen公司合成。 Tris (商品号 TB0194) , MgCl2 (商品号 NB0328 )， BSA (商品号 A1653 )， 盐酸胍（商品号 50950)， 异硫氰酸胍（商品号 G0380)， NaOH (商 品号 M0173 )， HAC (商品号 20070723 )， SDS (商品号 SB0485 )， EDTA (商品号 1926B030) 等购自宝泰克生物科技公司； 纳米磁珠（商品号 S ML-015 )购自上海奥润微纳新材料科技有 限公司。
(2)主要仪器： 荧光定量 PCR仪 (BIO-RAD); 普通 PCR仪（BIO-RAD) ； 台式高速离心机 (SIGMA); 高压灭菌器 (SANGYO): 超纯水系统 (MILLIPORE); 生物超净台 （江苏医疗设备 厂）； 单道移液器 (EPPENDOF); 电泳仪（北京六一仪器厂）： 紫外核酸分析仪（BIO-RAD)； 恒温水浴 （江苏太仓） ， 恒温振荡器 （江苏太仓） 等。 (3 )样品： 含有乙肝病毒， 丙肝病毒和艾滋病病毒以及正常血液样品各 30份。
2、 LUX自身淬灭单标荧光引物的设计和荧光标记
通过专用软件， 根据分析比较病原微生物目的 DNA/RNA信息， 分别设计高保守性、 特 异性和高效性的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相对应未标记引物， LUX自身淬灭单标荧光 引物含有发卡结构并标记下列其中一种不同颜色的荧光基团： FAM、 Alexa546、 JOE、 HEX, TET， LU 自身淬灭单标荧光引物的 PCR产物在 60-120个碱基对范围。
( 1 )基因信息分析： 根据 GENBANK的乙肝病毒， 丙肝病毒和艾滋病病毒等的核酸信息， 分析比较病原体不同亚型的目的基因序列， 设计高保守性、 特异性和高效性的单标荧光引物 和相对应未标记引物。
(2) 引物设计和标记： 在单标荧光引物 3'端的第二位的核苷酸用荧光标记， 在 5'端涉及 4 个与 3'端相同的反向重复序列， 即形成 LUX自身淬灭单标荧光引物。 与荧光标记的 TaqMan 探针相比， LUX自身淬灭单标荧光引物设计荧光基团靠近 3'末端， 形成发夹结构。这种构型 本质上具有荧光淬灭的功能， 因而不再需要单独的淬灭基团。 当引物被合并到双链的 PCR产 物时，荧光基团去淬灭，导致荧光信号显著的增高，这种信号的增高是 LUX检测技术的基础。 荧光引物可以是正向的， 也可以是反向的。 这样 LUX-引物就同时起到了核酸探针和 PCR扩 增引物的双重作用。
(3 ) 引物合成和标记： 由 INVOTROGEN公司合成并进行荧光标记。 本发明所列举的 LUX 自身淬灭单标荧光引物及相对应未标记引物的序列如下：
乙肝病毒 HBV (GenBank中 Accession No EU 595031 保守序列）
LUX primer (forward): CCCCTATCTTATCAACACTTCc (FAM)G
Reverse primer: GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
丙肝病毒 HCV (GenBank中 Accession No AY 460204保守序列）
LUX primer (forward): GAGAGCCATAGTGGTCTGc (JOE)G
Reverse primer: GCGGGTTGATCCAAGAAAGG
艾滋病病毒 HIV-1 (GenBank中 Accession No AF 286226. 1 保守序列）
LUX primer (reverse): TAATTGTCTGGCCTGTACCGt (ALX546)C
Forward primer: GGAGCAGCAGGAAGCACTATGG
T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV ( GenBank中 Accession No AF 259264保守序列）
LUX primer (forward): AAGGAACTGTAGAGCTGAGCc (ALX546)G
Reverse primer: GCCACCTGTCCAGAGCATCAG
梅毒螺旋菌 TP (GenBank中 Accession No AE 008691 保守序列）
LUX primer (forward):cggttCGTAGGTCTGTCTGGACAACc(JOE)G
Reverse primer:GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT
可以根据需要设计更多的 LUX自身淬灭单标荧光引物， 均适用于本发明的检测方法。
3、 病原微生物总核酸的制备和纯化
釆用纳米磁珠法提取样品中病原微生物总核酸作为标本模板效果最佳， 详细提取过程如 下：
( 1 )取 400μ1样品溶化，加入 200μ1裂解液一（ρΗ8的 50mmol/L Tris-HCl, pH8.0的 lOmmolZL EDTA, 1%SDS， 4mol/L异硫氰酸胍， Carrier RNA ^g) 重悬沉淀， Tip吹打至彻底悬浮， 然后 65°C 水浴 10min。加入 ΙΟΟμΙ的裂解液二 KAC 0.5mol/L， 立即温和颠倒混匀 4-6次， 冰 浴 10min， 12000 rpm离心 10 min， 小心吸取上清。
(2)加入 400μ1 结合液 ( 5mol/L异硫氰酸胍， pH6.6的 20mmol/L Tris-HCl, 37.5%乙醇） 混 匀， 加入 25μ1磁珠混匀， 室温吸附 3min， 放到磁力架上吸附磁珠， 吸掉上清液。
(3 )加入 750μ1漂洗液 （20mmol/L NaCl, pH7.5的 2mmol/L Tris-HCl, 80%乙醇） 于离心管 中， 静置 lmin, 吸掉收集管中废液。 重复此步骤一次。
(4)在离心管中加入 50μ1洗脱液 （ρΗ8.0的 10mmol/L Tris-HCl, ρΗ8.0的 lmmol/L EDTA), 室温放置 2 min。 放到磁力架上吸附磁珠，吸取上清溶液，即为目的总核酸，置于 4°C或 -20°C 保存。 整个过程需要 30min。
若提取核酸为 RNA或含有 RNA时， 必须保存在 4°C并在 12小时内用于 PCR扩增， 因 为 R A极易受 R ase降解。
探针磁珠法及一般的核酸提取方法也适用于本发明的检测技术。
4、 标准曲线的建立
根据所检测病毒的核酸类型， 分别制备相应的标准品。
( 1 )病毒的核酸类型为 DNA。如乙肝病毒 HBV标准品的制备：用灭菌双蒸水将含 HBV 全序列的质粒用核酸蛋白测定仪进行定量并稀释至 106、 105、 104、 103、 102、 101、 lOVopies^L 病毒 DNA计算公式如下：
拷贝数 = (ng of dsDNA/ number of bps x 660) x 6.02 x 1014
(2)病毒的核酸类型为 RNA。 如 HCV和 HIV-1标准品的制备： 利用含 T7启动子序列 的引物， 分别以 HCV和 HIV-1全序列质粒为模板， 进行 PCR反应； 然后再以 PCR产物为模 板，利用体外转录系统进行转录反应；将 R A产物纯化后用核酸蛋白测定仪进行定量并稀释 至 106、 105、 104、 103、 102、 101、 10。copies^l。
病毒 RNA计算公式如下：
拷贝数 = (ng of RNA/ number of bps x 330) x 6.02 x 1014
以上述标准品制备为模板， 采用优化的反应体系， 加入相应的 LUX自身淬灭单标荧光引 物， 制备实时 PCR反应液， 然后进行实时 PCR检测， 绘制标准曲线如图 1， 2， 3所示； 组 合检测见图 4。本检测方法在 10Q-106 copies/反应数量级范围内具有良好的线性关系，相关系 数 R=0.99， 其灵敏度可达 10个拷贝。
5、 HIV, HBV, HCV的实时 PCR检测
PCR扩增时，荧光 PCR仪对每个反应管产生的荧光信号进行检测，信号强度超过检测器 阈值的报告为阳性，此时的 PCR扩增循环次数（称为 CT)与标本中模板含量有负对数的关系， 为仪器所自动纪录。实时荧光 PCR仪可实现标本模板扩增整个过程的荧光信号变化图， 可以 十分形象地判断标本的阴、 阳性并能区分其强弱。 由于设置了阳性对照的梯度， 其梯度曲线 的适合度就可以确定每次检测的可靠性， 被检测样品的病毒拷贝数就可由该曲线对照得出。 这样在同次检测中就可得到样品中有无病毒及病毒的拷贝数目。
实时 RT-PCR检测采用一步法完成对样品中提取的病原微生物总核酸中的 R A的反转录 和实时 PCR检测， 即在总反应体系中同时加入反转录酶和实时 PCR反应液。 [1] 反应体系制备：
模板为 DNA的， 如 HBV等， 反应体系为:
Master Mix (5x) 10 μΐ
未标记 primer 0.5μ1
LUX标记 primer 0.5μ1
HotStar Taq酶 1.5 U
U G酶 0.4μ1
样品模板 25 μΐ
H20 up to 50μ1
模板为 RNA的，如 HIV-l， HCV, HTLV等，实时 PCR反应液中加入反转录酶 2 U、 RNA 酶抑制剂， 逆转录引物， 总体积不变仍为 50μ1。
反应体系为：
Master Mix (5x) ΙΟμΙ
未标记 rimer 0.5μ1
LUX标记 rimer 0.5μ1
HotStar Taq 1.5 U
UNG酶 0.4μ1
M-MLV (逆转录酶） 0.4μ1
样品模板 25 μΐ
H20 up to 50μ1
其中， Master Mix (5 χ)组成为：
5mmol/L的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L 的 Tris-HCl, 75mmol/L 的 KC1, 25mmol/L 的 dNTP。
[2] 上机检测
在荧光 PCR仪上，按不同荧光类型及扩增程序设定反应参数：模板为 DNA的，如 HBV， 采用程序 1 ; 模板为 R A的， 如 HIV-l , HCV, HTLV, 采用程序 2。放入反应板或管， 开机 检测。 在反应过程中， 可通过电脑实时观察各样品荧光信号的变化情况。
PC 程序一 1
Stage 1 (1 cycle)
50 °C 2 min
Stage 2 (1 cycle)
95 °C lO min
Stage 3 (40 cycles)
95 °C 15 sec
60 °C 30 sec
72 °C 30sec real time
PCR程序一 2
Stage 1 (1 cycle) 42 °C 30 min
Stage 2 (1 cycle)
95 °C 5 min
Stage 3 (40 cycles)
95 °C 15 sec
60 °C 30 sec
72 °C 30sec real time
[3] 结果分析：
反应结束后， 可在定量分析的模式下， 查看各样品的扩增曲线、 Ct值和浓度， 阳性对照 应出现扩增曲线， Ct值在 25之前； 阴性对照的 Ct值应大于 40， 在 NTC之后。 阳性模板为 HBV, HCV或 HIV质粒定量标准品， 阴性模板为无菌双蒸水。 若 Ct值小于 40， 且呈现典型 的扩增曲线， 则判断为阳性结果； 若 Ct值大于 40或无扩增曲线， 则判定为阴性结果。 大于 1.0 l06copies/ml的检测样本可按实际测得值报告相应的拷贝数。检测结果呈阳性的样品， 根 据建立的定量标准曲线 （图 1， 图 2， 图 3 ) 计算样品内的病原微生物载量。
6、 HIV, HBV, HCV的实时 PCR组合检测
Π1 反应体系制备：
Master Mix (5 ) ΙΟμΙ
HBV,HCV,HIV-未标记 primer 各 0.5μ1
HBV,HCV,HIV- LUX标记 primer各 0.5μ1
HCV,HIV的逆转录引物 各 0.5μ1
HotStar Taq酶 1.5 U
U G 0.4μ1
M-MLV反转录酶 0.4μ1
样品 25 μΐ
H20 up to 50μ1
其中， Master Mix (5 χ)组成为：
5mmol/L的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L的 Tris-HCl， 75mmol/L的 KC1, 25mmol/L的 dNTP。
[2] 上机检测
在荧光 PCR仪上， 按不同荧光类型及扩增程序设定反应参数， 放入反应板或管， 开机检 测。 在反应过程中， 可通过电脑实时观察各样品荧光信号的变化情况。
PCR程序
Stage 1 (1 cycle)
42 °C 30 min
Stage 2 (1 cycle)
95 °C 5 min
Stage 3 (40 cycles)
95 °C 15 sec 60 °C 30 sec
72 °C 30sec real time
[3] 结果判定：
反应结束后， 可在定量分析的模式下， 査看各样品的扩增曲线、 Ct值和浓度， 阳性对照 应出现扩增曲线， 阴性对照的 Ct值最大， 在 NTC之后。
大于 1.0xl06 COpieS/ml的检测样本，可按实际测得值报告相应的拷贝数，亦可将该样本用 正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定。
7、 实际样品检测结果：
含有乙肝病毒血液样品 30份， 艾滋病病毒血液样品 30份； 正常血液样品 30份。
[1] 核酸制备： 同上；
[2] 反应体系： 同上；
[3] 上机检测： 同上；
[4] 结果： 反应结束后， 在定量分析的模式下， 査看各样品的扩增曲线、 Ct值和浓度， 阳性对照应出现扩增曲线， Ct值在 25之前； 阴性对照的 Ct值应大于 40， 在 NTC之后。 阳 性模板为 HBV， HCV或 HIV质粒定量标准品， 阴性模板为无菌双蒸水。 若 Ct值小于 40， 且呈现典型的扩增曲线， 则判断为阳性结果； 若 Ct值大于 40或无扩增曲线， 则判定为阴性 结果。大于 1.0xl06 COpieS/ml的检测样本可按实际测得值报告相应的拷贝数。检测结果呈阳性 的样品， 根据建立的定量标准曲线和样品稀释倍数计算样品内的病原微生物载量。
荧光实时 RT-PCR检测含有乙肝病毒 （HBV) 艾滋病病毒 （HIV) 血液样品的结果， 含 有病毒的血液样品检测效率为 100%， 其中， 乙肝病毒载量在 5xl03-106 copies/ml之间， 艾滋 病病毒载量在 3xl02-103copies/ml之间。
本发明特别设计了一种定性定量检测病原微生物遗传物质的试剂盒， 该试剂盒为检测一 种病原微生物的单一试剂盒或是同时检测多种病原微生物的组合试剂盒。 它主要是 由核酸提取试剂、 核酸扩增试剂、 对照品、 标准品等组成。 其中： 核酸提取试剂中包括纳米 磁珠、裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液，其中裂解液一组成为： pH8.0的 50mmol/L Tris-HCl、 pH8.0 的 10mmol/L EDTA、 1%SDS、 4mol/L异硫氰酸胍、 Carrier RNA l g， 裂解液二为 0.5mol/L KAC, 结合液组成为： 5mol/L异硫氰酸胍、 pH6.6的 20mmol/L Tris-HCl、 37.5%乙 醇，漂洗液组成为： 20mmol/L NaCl、 pH7.5的 2mmol/L Tris-HCl、 80%乙醇， 洗脱液组成为： pH8.0的 10mmol/L Tris-HCK H8.0的 lmmol/L EDTA;核酸扩增试剂由 eal time PCR Premix 5 和 DEPC水组成， Real time PCR Premix 5X中包含针对病原微生物遗传物质而分别设计的 LUX自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记弓 I物中的一种或多种； 对照品中的阳性对照为非 感染性 DNA或体外转录 R A， 阴性对照为无菌双蒸水， 强阳性对照为非感染性 DNA或病 毒 RNA; 标准品为含有病原微生物 DNA/RNA序列质粒的梯度稀释物。
Real time PCR Premix 5X中还包括 5mmol/L 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L的 Tris-HCl, 75mmol/L的 KC1, 25mmol/L 的 dNTP， HotStar Taq酶， PCR增强剂， 保护剂。当检测病毒中存在模板 RNA时， Real time PCR Premix 5X中还包括反转录酶和 RNA 酶抑制剂。
核酸扩增试剂中针对乙肝病毒 HBV、丙肝病毒 HCV、 艾滋病病毒 HIV-1、 T-淋巴细胞白 血病病毒 HTLV、 梅毒螺旋菌 TP分别设计的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相应未标记引物 的序列如下：
乙肝病毒 HBV
LUX primer (forward): CCCCTATCTTATCAACACTTCc (FAM)G 记为
SEQ.ID.NO.1
Reverse primer: GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG 记为 SEQ.ID.NO.2
丙肝病毒 HCV
LUX primer (forward): GAGAGCCATAGTGGTCTGc (JOE)G 记为 SEQ.ID.NO.3
Reverse primer: GCGGGTTGATCCAAGAAAGG 记为 SEQ.ID.NO.4
艾滋病病毒 HIV-1
LUX primer (reverse): TAATTGTCTGGCCTGTACCGt (ALX546)C 记为 SEQ.ID.NO.5 Forward primer: GGAGCAGCAGGAAGCACTATGG 记为 SEQ.ID.NO.6
T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV
LUX primer (forward): AAGGAACTGTAGAGCTGAGCc (ALX546)G 记 为
SEQ.ID.NO.7
Reverse primer: GCCACCTGTCCAGAGCATCAG 记为 SEQ.ID.NO.8
梅毒螺旋菌 TP
LUX primer (forward):cggttCGTAGGTCTGTCTGGACAACc(JOE)G 记为 SEQ.ID.NO.9
Reverse primer:GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT 记为 SEQ.ID.NO.10
实施例 1 :
应用 LUX荧光 PCR技术进行乙型肝炎病毒 (HBV)载量检测的试剂盒实施案例
利用荧光标记的 LUX (Light Upon extension)引物和实时 PCR技术实现对 HBV DNA的保 守区域进行扩增， 检测限度为 SxlO^xli^copies/mL 本试剂盒可以定量检测由人血浆或血清 样本中 HBV的 DNA, 适用于 HBV感染的辅助诊断和抗 HBV药物治疗效果的检测。
【试剂盒组成】
组成成分 （48 test) 规格
核酸提取试剂
溶液 A-裂解液 10 mi x 1瓶
溶液 B-裂解液 7.5 ml x 1瓶
溶液 C-结合液 20 mi x 1瓶
溶液 D-漂洗液 50 ml x 1瓶
溶液 E-洗脱液 5 ml x 1瓶 纳米磁珠 1 ml X 1管 核酸扩增试剂盒
HBV Real time PCR Premix 5x 300 μΐ x 2管
DEPC K 200 μΐ x 1管
Figure imgf000014_0001
阴性对照 20 μΐ 1管
阳性对照 20 μΐ 1管
强阳性对照 20 μΐ 1管
标准品
阳性工作标准品 1 : 1x 10 copies/ml 20 μΐ 1管
阳性工作标准品 2: 1x 10 copies/ml 20 μΐ 1管
阳性工作标准品 3 : lx lO4 copies/ml 20 μΐ 1管
阳性工作标准品 4: lx lO3 copies/ml 20 μΐ 1管
阳性工作标准品 5 : 1χ 102 copies/ml 20 μΐ 1管
阳性工作标准品 6: lx lO1 copies/ml 20 μΐ 1管
其中溶液 Α为裂解液： pH8.0的 50mmol/L Tris-HCl、 pH8.0的 10mmol/L EDTA、 1%SDS、 4mol/L异硫氰酸胍， Carrier R A l g, 溶液 B为裂解液： 0.5mol/L KAC， 溶液 C为结合液： 5mol/L异硫氰酸胍、 pH6.6的 20mmol/L Tris-HCl、 37.5%乙醇， 溶液 D为漂洗液： 20mmol/L NaCK pH7.5的 2mmol/L Tris-HCl、 80%乙醇，溶液 E为洗脱液： H8.0的 10mmol/L Tris-HCl、 pH8.0的 lmmol/L EDTA; HBV Real time PCR Premix 5 中包括 MgCl2 5mmol/L， 0.6mg/ml 的 BSA， pH8.3的 Tris-HC1 20mmol/L, KC1 75mmol/L, dNTP 25mmol/L， HotStar Taq酶， PCR 增强剂， 保护剂， LUX 自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记引物， S卩 SEQ.ID.N0.1 和 SEQ.ID.N0.2。
【适用仪器】
BIO-RAD iCycler荧光 PCR检测仪； IBA荧光 PCR检测仪
PE Gene Amp 5700/7700/7000/7300荧光 PCR检测仪
【操作步骤】
1. 样品总核酸的制备
a、取 400μ1血清溶化，加入 200μ1溶液 Α重悬沉淀， Tip吹打至彻底悬浮，然后 65°C 水 浴 10min。加入 ΙΟΟμΙ的溶液 B KAC 0.5mol/L,立即温和颠倒混匀 4-6次，冰浴 10min， 12000 rpm离心 10 min， 小心吸取上清。
b、 加入 400μ1溶液 C混匀， 加入 25μ1磁珠混匀， 室温吸附 3min， 放到磁力架上吸附磁 珠， 吸掉上清液。
c、 加入 750μ1溶液 D于离心管中， 静置 lrnin, 吸掉收集管中废液。 重复此步骤一次。 d、 在离心管中加入 50μ1溶液 E， 室温放置 2 min。 放到磁力架上吸附磁珠， 吸取上清 溶液， 即为目的 DNA, 置于 4°C或 -20°C保存。 整个过程需要 30min。
2. PCR前准备 从试剂盒中取出 HBV Real time PCR Premix ( 5x)和标准品，在室温下融化并振荡混匀后， 2000rpm离心 10sec。 设定所需的 PCR反应管管数为 n， 计算好各试剂的使用量， 加入到一适当 体积离心管中，充分混合均匀后 2000rpm离心 lOsec；。分装到 PCR反应板中，加入样品（DNA)， 反应体系配制如下表。 盖膜， 于 96孔板离心机上 2000rpm离心 10sec， 然后转移到检测区。 将 反应管排好放入荧光 PCR检测仪内， 记录样本摆放顺序。
5x Premix 10 μΐ
DNA.¾P¾ 2 .μ1....
H20 up to 50 μΐ
3. Real time PCR反应
•循环条件设置
Stage 1 (1 cycle)
50°C 2min
Stage 2 (1 cycle)
95。C lOmin
Stage 3 (40 cycles)
95 °C 15sec
60 °C 30sec
72 "C 30sec real time
•仪器检测通道选择
荧光素设定为 TAMARA; 荧光信号收集设在 72°C。
具体设置方法请参照各仪器使用说明书。
•标准品的设定
使用 BIO-RAD iCycler扩增仪，应在扩增开始前条件设定时， 将校准品设为 "STD" 并输入拷贝数，待检样本和对照品设定为" U KN",使用 PE Gene Amp 5700和 7700 荧光定量 PCR检测仪时在扩增开始前或扩增结束后均可设定标准品拷贝数。 【结果分析】
1. 使用 PE Gene Amp 5700/7700荧光 PCR检测仪进行结果分析时， 基线 （baseline)取 3-10 或 3-15个循环的荧光信号， 阈值（threshold)可根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈 值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 且 Ct值 =40.0为准。
2. 使用 Bio-Rad iCycler进行结果分析时， 基线取为 2-10或 2-15个循环的荧光信号， 阈值可 根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高 点， 且 Ct值 =0.0为准。
3. 检测样本中 HBV DNA S.OxlC^copies/ml, 报告相应的拷贝数。
4. 检测样本中 HBV DNA≥1.0xl06copies/ml， 可按实际测得值报告相应的拷贝数， 亦可将 该样本用正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定。
阴性对照 HBV DNA视为 0.0copy/ml。 【质控标准】
1.将标准品 2-6的拷贝浓度输入， 仪器将自动以标准品拷贝浓度的对数值为横坐标， 以其 实际测得的 Ct值为纵坐标给出标准曲线， 标准曲线的拟和度应≤-0.980， 否则视为定量结 果无效。
2. 阴性对照 Ct值应高于标准品 6。 强阳性对照 0值≤25.0； 强阳性对照 0值≤临界阳性对照 Ctfl<30.0; 否则实验视为无效。 所有实验从样本处理开始重做。
实施例 2:
应用 LUX荧光 PCR技术进行人类免疫缺陷性病毒 (HIV-1)载量检测的试剂盒实施案例
利用荧光标记的 LUX (Light Upon extension) 引物和实时 PCR技术实现对 HIV-1 RNA
(cDNA)的保守区域进行扩增， 检测限度为 Sxlo SxlO^opies/mL本试剂盒对引物进行了优 化， 使得对中国主要流行的 HIV-1 B和 C亚型有相同的扩增效率。 本试剂盒可以定量检测由人 血浆样本中的 HIV-1R A, 适用于 HIV-1感染的辅助诊断和抗 HIV-1药物治疗的效果的检测。
【试剂盒组成】
组成成分 （48 test) 规格
核酸提取试剂
溶液 A-裂解液 10 ml x 1瓶
溶液 B-裂解液 7.5 ml x 1瓶
溶液 C-结合液 20 ml x 1瓶
溶液 D-漂洗液 50 ml x 1瓶
溶液 E-洗脱液 5 ml x 1瓶
纳米磁珠 1 ml x 1管
核酸扩增试剂盒
HIV-1 Real time PCR Premix 5x 300 μΐ x 2管
DEPC水 200 μΐ x I w
对照品
阴性对照 20 μΐ x I
阳性对照 20 μΐ χ I Ή
强阳性对照 20 μΐ χ I Ή
标准品
阳性工作标准品 1 : 1> < 106 copies/ml 20 μΐ χ 1 Ή
阳性工作标准品 2: 1> < 105 copies/ml 20 μΐ χ 1 Ή
阳性工作标准品 3 : 1> < 104 copies/ml 20 μΐ χ 1 Ή
阳性工作标准品 4: 1> ( 103 copies/ml 20 μΐ χ I Ή
阳性工作标准品 5 : 1> ( 102 copies/ml 20 μΐ χ I Ή
阳性工作标准品 6: 1> ( 101 copies/ml 20 μΐ χ I Ή
其中溶 ¾ Α、 Β、 C、 D、 Ε与实施例 I中成分相同。 HIV- 1 Real time PCR Premix 5x包括 5mmol/L 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L的 Tns-HCl, 75mmol/L的 KCl, 25mmol/L的 dNTP， HotStar Taq酶， PCR增强剂， 保护剂， 反转录酶和 R A酶抑制剂， 其 中： LUX自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记引物为 SEQ.ID.N0.5和 SEQ.ID.N0.6。 【适用仪器】
BIO-RAD iCycler荧光 PCR检测仪； IBA荧光 PCR检测仪
PE Gene Amp 5700/7700/7000/7300荧光 PCR检测仪
【操作步骤】
1. 样品总 RNA的制备
a、取 400μ1血清溶化，加入 200μ1溶液 Α重悬沉淀， Tip吹打至彻底悬浮，然后 65°C 水 浴 10min。加入 ΙΟΟμΙ的溶液 B KAC 0.5mol/L,立即温和颠倒混匀 4-6次，冰浴 10min， 12000 rpm离心 10 min， 小心吸取上清。
b、 加入 400μ1溶液 C混匀， 加入 25μ1磁珠混匀， 室温吸附 3min， 放到磁力架上吸附磁 珠， 吸掉上清液。
c、 加入 750μ1溶液 D于离心管中， 静置 lmin, 吸掉收集管中废液。 重复此步骤一次。 d、 在离心管中加入 50μΙ溶液 Ε， 室温放置 2min。 放到磁力架上吸附磁珠， 吸取上清 溶液， 即为目的 RNA, 置于 4°C或 -20°C保存。 整个过程需要 30min。
由于 RNA最易受 RNase降解， 必须保持在 4 °C并在 12小时内用于 PCR扩增。
2. PCR前准备
从试剂盒中取出 HIV-1 Real time PCR Premix ( 5x ) 标准品，在室温下融化并振荡混匀后， 2000rpm离心 lOsec；。 设定所需的 PCR反应管管数为 n， 计算好各试剂的使用量， 加入到一适当 体积离心管中， 充分混合均匀后 2000rpm离心 lOsec；。 分装到 PCR反应管 （板） 中， 加入样品 (R A), 反应体系配制如下表。 盖膜， 于 96孔板离心机上 2000rpm离心 10sec， 然后转移到检 测区。 将反应管排好放入荧光 PCR检测仪内， 记录样本摆放顺序。
5x Premix 10 μΐ
A—样-品 25.μ1....
H20 up to 50 μΐ
3. Real time PCR反应
•循环条件设置
Stage 1 (1 cycle)
42 °C 30min
Stage 2 (1 cycle)
95 °C lOmin
Stage 3 (40 cycles)
95 °C 15sec
60 °C 30sec
72 °C 30sec real time
•仪器检测通道选择
荧光素设定依荧光标记种类而定； 荧光信号收集设在 72°C。
具体设置方法请参照各仪器使用说明书。 •标准品的设定
使用 BIO-RAD iCycler扩增仪，应在扩增开始前条件设定时， 将校准品设为 "STD" 并输入拷贝数，待检样本和对照品设定为" U KN"，使用 PE Gene Amp 5700和 7700 荧光定量 PCR检测仪时在扩增开始前或扩增结束后均可设定标准品拷贝数。
【结果分析】
1. 使用 PE Gene Amp 5700/7700荧光 PCR检测仪进行结果分析时， 基线 （baseline)取 3-0 或 3-15个循环的荧光信号， 阈值（threshold)可根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈 值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 且 Ct值 =40.0为准。
2. 使用 Bio-Rad iCycler进行结果分析时， 基线取为 2-10或 2-15个循环的荧光信号， 阈值可 根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高 点， 且 Ct值 =0.0为准。
3. 检测样本中 HIV-1 cDNA S.Ox li^copies/ml, 报告相应的拷贝数。
4. 检测样本中 HIV-1 cDNA≥5.0x l06copies/ml， 可按实际测得值报告相应的拷贝数， 亦可 将该样本用正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定。
5. 阴性对照 HIV-1 基因拷贝数视为 0.0copy/ml。
【质控标准】 同实施例 1
实施例 3:
应用 LUX荧光 PCR技术进行三种病毒（乙肝病毒， 丙肝病毒和人类免疫缺陷性病毒）组合检 测的试剂盒实施案例
利用荧光标记的 LUX (Light Upon extension)引物和实时 PCR技术实现同时对 HBV DNA, HCV禾 B HIV-1 RNA ( cDNA)的保守区域进行扩增，
Figure imgf000018_0001
本试 剂盒可以定性定量同时检测由人血浆样本中 HBV DNA, HCV和 HIV-1的 R A, 特别适用于临 床血液检测和中心血站大量样本的血液筛检。
【试剂盒组成】
组成成分 （48 test) 规格
核酸提取试剂
溶液 A-裂解液 10 ml x 1瓶
溶液 B-裂解液 7.5 ml x 1瓶
溶液 C-结合液 20 ml x 1瓶
溶液 D-漂洗液 50 ml x 1瓶
溶液 E-洗脱液 5 ml x 1瓶
纳米磁珠 1 ml x 1管
核酸扩增试剂盒
Real time PCR Premix 5x 300 μΐ x 2管
DEPC水 200 μΐ x 1管
对照品 阴性对照 20 μΐ X 1管 阳性对照 20 μΐ X 1管
强阳性对照 20 μΐ X 1管
标准品
阳性工作标准品 1 : 1 ) < 106 copies/ml 20 μΐ X 1管
阳性工作标准品 2: 1 : < 105 copies/ml 20 μΐ X l
阳性工作标准品 3 : 1 : < 104 copies/ml 20 μΐ X 1 Ή
阳性工作标准品 4: 1 > ( 103 copies/ml 20 μΐ X 1 Ή
阳性工作标准品 5 : 1 > < 102 copies/ml 20 μΐ X 1 Ή
阳性工作标准品 6: 1 > < 10L copies/ml 20 μΐ X 1 Ή
其中溶液 A、 B、 C、 D、 E与实施例 1中成分相同。 Real time PC Premix 5x包括 5mmol/L 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L 的 Tris-HCl, 75mmol/L的 KC1, 25mmol/L 的 dNTP， HotStar Taq酶， PCR增强剂， 保护剂， 反转录酶和 RNA酶抑制剂， 其中： LUX 自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记引物为： SEQ.ID.N0.1、 SEQ.ID.NO .2； SEQ.ID.N0.3 SEQ.ID.NO.4; SEQ.ID.N0.5、 SEQ.ID.N0.6。
【适用仪器】
BIO-RAD iCycler荧光 PCR检测仪； IBA荧光 PCR检测仪
PE Gene Amp 5700/7700/7000/7300荧光 PCR检测仪
【操作步骤】
1 . 样品总核酸的制备
同实施例 2。
2. PCR前准备
从试剂盒中取出 Real time PCR Premix ( 5x)、 标准品， 在室温下融化并振荡混匀后， 2000rpm离心 lOsec；。 设定所需的 PCR反应管管数为 n， 计算好各试剂的使用量， 加入到一适当 体积离心管中， 充分混合均匀后 2000rpm离心 lOsec；。 分装到 PCR反应管 （板） 中， 加入样品， 反应体系配制如下表。 盖膜， 于 96孔板离心机上 2000rpm离心 10sec， 然后转移到检测区。 将 反应管排好放入荧光 PCR检测仪内， 记录样本摆放顺序。
5x Premix ΙΟμΙ
S.品 ..L总核酸.) 25.μ.1
H20 up to 50 μΐ
3. Real time PCR反应
同实施例 2。
【结果分析】
1. 使用 PE Gene Amp 5700/7700荧光 PCR检测仪进行结果分析时， 基线 （baseline)取 3-10 或 3-15个循环的荧光信号， 阈值（threshold)可根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈 值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 且 Ct值 =40.0为准。
2. 使用 Bio-Rad iCycler进行结果分析时， 基线取为 2-10或 2-15个循环的荧光信号， 阈值可 根据仪器噪音情况调整， 设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高 点， 且 Ct值 =0.0为准。
3. 检测样本中 HBV或 HCV或 HIV-1 cDNA>5.0x l01copies/ml, 报告相应的拷贝数。
4. 检测样本中 HBV或 HCV或 HIV-1 cDNA>5.0x l06copies/ml, 可按实际测得值报告相应的 拷贝数， 亦可将该样本用正常人血浆按稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测 定。
5. 阴性对照 HBV或 HCV或 HIV-1 基因拷贝数视为 0.0copy/ml。
【质控标准】
同实施例 1。
实施例 4:
本试剂盒也可用于对其他病毒或细菌进行定性、 定量检测， 如 T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV、流感病毒、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、 EB病毒， 巨细胞病毒， 梅毒螺旋菌 TP、 结核分枝杆菌、 淋球菌、 沙眼衣原体和解脲支原体等。
Figure imgf000021_0001
Q S..NO. GCCEIDAATTCCCCCCCTAAAT
ggQ() S..NO.9: ccGGEIDttTAGCGCGGCCCJ〇GTTTTAAAE
Q S..NO.8: GCCCCEIDATGCCGGCCGTAAATA
Q) ( SE.ID.NP7: AAGGAACTGTAGAGCTGAGCcALX546G
GGAGCAGCAGGAAGCACTATGG
Q () S..N0.5:GEID TAATTTCGGCCGCCG5CTTTAtALX46
Q S ..N〇. : GCG〇GGEID4TT〇CG〇GATAAAAA
Q ()..N0.3: GGGCCEIDAAGGGCGcJOGATATTTE
Q ∞ ..N〇. : OGCGGGEID2AGGCCCGGATTTTTTTA Q ()..NO. CCCCCIDTATCCCCcGTTATAAATTFAM

Claims

权利 要求
1、 一种定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 其特征在于： 包括采用纳米磁珠法提 取样品中病原微生物总核酸作为标本模板，应用 LUX-荧光标记引物技术完成对该标本模板实 时 PCR或实时 RT-PCR检测过程， 其中： 通过专用软件， 根据分析比较病原微生物目的基因 序列，分别设计高保守性、特异性和高效性的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相对应未标记引 物， 所述 LUX 自身淬灭单标荧光引物含有发卡结构并标记下列其中一种不同颜色的荧光基 团： FAM、 Alexa546、 JOE、 HEX、 TET， 所述 LUX 自身淬灭单标荧光引物的 PCR产物在 60-120个碱基对范围， 在实时 PCR反应液中， 加入一种所述 LUX自身淬灭单标荧光引物或 多种所述 LUX自身淬灭单标荧光引物， 通过监测实时 PCR反应体系中不同颜色的荧光信号 的变化情况实现对样品中一种或多种病原微生物的定性定量检测。
2、根据权利要求 1所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 其特征在于： 所述 实时 RT-PCR检测采用一步法完成对样品中提取的病原微生物总核酸中的 R A的反转录和实 时 PCR检测， 即在实时 PCR反应体系中同时加入反转录酶和实时 PCR反应液。
3、根据权利要求 1所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 其特征在于： 所述 纳米磁珠法提取样品中病原微生物总核酸的步骤为：首先，取 400μ1样品溶化，加入 200μ1裂 解液重悬样品沉淀， 65 °C 水浴 10min， 加入 ΙΟΟμΙ的裂解液， 混匀冰浴 10min， 12000rpm离 心 10min， 吸取上清； 然后， 加入 400μ1结合液混匀， 加入 25μΙ磁珠， 置于磁力架上吸附磁 珠， 吸掉上清； 接下来， 加入 750μ1漂洗液于离心管中， 静置 lmin, 吸掉废液， 重复此步骤 一次； 最后在离心管中加入 50μ1洗脱液， 室温放置 2min， 吸附磁珠， 吸取上清， 即为目的 总核酸， 置于 4°C或 -20°C保存。
4、 根据权利要求 1或 2所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的方法， 其特征在于： 所述实时 PCR反应体系为：
Master Mix (5x) 10 μΐ,
一种 LUX标记 primer 0.5μ1 或 多种 LUX标记 primer 各 0.5μ1
相对应未标记 rimer 0.5μ1 或 多种相对应未标记 rimer 各 0.5μ1
HotStar Taq酶 1.5 U
U G酶 0.4μ1
样品 （DNA/R A) 25μ1
H20 up to 50μ1
其中， Master Mix (5 χ)组成为：
5mmol/L 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L的 Tris-HCl， 75mmol/L 的 KC1, 当所述标本模板为 RNA或含有 RNA时，所述实时 PCR反应体系中加入反转录酶 2 U、 反转录引物， RNA酶抑制剂， 总体积不变仍为 50μ1。
5、根据权利要求 1或 2或 3所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的方法，其特征在 于： 所述样品包括人源或动物源的血液、 精液、 唾液， 所述病原微生物包括病毒、 细菌和其 它病原微生物。
6、一种应用如权利要求 1所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的方法的试剂盒，包 括核酸提取试剂、 核酸扩增试剂、 对照品、 标准品， 其特征在于： 所述核酸提取试剂中包括 纳米磁珠、 裂解液、 结合液、 漂洗液、 洗脱液， 其中裂解液一组成为： pH8.0 的 50mmol/L Tris-HCl、 pH8.0的 10mmol/L EDTA、 1%SDS、 4mol/L异硫氰酸胍、 Carrier RNA l g, 裂解 液二为 0.5mol/L KAC,结合液组成为： 5mol/L异硫氰酸胍、 pH6.6的 20mmol/L Tris-HCl pH6.6 的 37.5%乙醇， 漂洗液组成为： 20mmol/L NaCl、 pH7.5的 2mmol/L Tris-HCl、 80%乙醇， 洗 脱液组成为： pH8.0的 10mmol/L Tris-HCK pH8.0的 lmmol/L EDTA; 所述核酸扩增试剂由 Real time PC Premix 5X禾卩 DEPC水组成， 所述 Real time PC Premix 5 中包含针对病原微 生物遗传物质而分别设计的 LUX 自身淬灭单标荧光引物及其相应未标记引物中的一种或多 种； 所述对照品中的阳性对照为非感染性 DNA或病毒 RNA， 阴性对照为无菌双蒸水， 强阳 性对照为非感染性 DNA或病毒 RNA; 所述标准品为含有病原微生物 DNA/RNA序列质粒的 梯度稀释物。
7、 根据权利要求 6所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的试剂盒， 其特征在于:所 述核酸扩增试剂中针对乙肝病毒 HBV、 丙肝病毒 HCV、艾滋病病毒 HIV-1、 T-淋巴细胞白血 病病毒 HTLV、 梅毒螺旋菌 TP分别设计的 LUX自身淬灭单标荧光引物和相应未标记引物的 序列如下：
乙肝病毒 HBV
LUX primer (forward): CCCCTATCTTATCAACACTTCc (FAM)G
Reverse primer: GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGG
丙肝病毒 HCV
LUX primer (forward): GAGAGCCATAGTGGTCTGc (JOE)G
Reverse primer: GCGGGTTGATCCAAGAAAGG
艾滋病病毒 HIV-1
LUX primer (reverse): TAATTGTCTGGCCTGTACCGt (ALX546)C
Forward primer: GGAGCAGCAGGAAGCACTATGG
T-淋巴细胞白血病病毒 HTLV
LUX primer (forward): AAGGAACTGTAGAGCTGAGCc (ALX546)G
Reverse primer: GCCACCTGTCCAGAGCATCAG
梅毒螺旋菌 TP
LUX primer (forward):cggttCGTAGGTCTGTCTGGACAACc(JOE)G
Reverse primer:GCAATCTCCCTCAAACCCTCCT
8、 根据权利要求 6所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的试剂盒， 其特征在于： 所 述 Real time PCR Premix 5X中还包括 5mmolZL 的 MgCl2， 0.6mg/ml的 BSA， pH8.3的 20mmol/L Tris-HCl, 75mmol/L 的 KC1， 25 mmol/L 的 dNTP， HotStar Taq酶， PCR增强剂， 保护剂。
9、 根据权利要求 6所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的试剂盒， 其特征在于： 所 述 Real time PCR Premix 5X中还包括反转录酶和 R A酶抑制剂。
10、 根据权利要求 6所述的定性定量检测病原微生物遗传物质的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒为检测一种病原微生物的单一试剂盒或是同时检测多种病原微生物的组合试剂 。
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