CN116516076A - 一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体dna的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用；所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。本发明制备得到的引物通过设计改造和反应体系优化，极大提高了检测特异性，解决了非探针的嵌合染料实时荧光PCR技术的方法学缺陷问题。本发明检测保加利亚乳杆菌噬菌体的方法操作简便、快速，检测特异性强、灵敏度高，结果稳定可靠、成本低廉，适合于酸奶发酵工业中对各种原料奶、发酵中的产品和环境样品的检测，有利于快速检出噬菌体污染情况并采取有效及时的防治措施。

Description

一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物及其应用。

背景技术

酸奶是人们喜爱的一种营养饮料。酸奶生产的核心是利用乳酸菌发酵，通常采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行联合发酵。危害酸奶生产的一个重要因素是乳酸菌易感染噬菌体而导致发酵失败。一旦发酵失败轻则使品质下降、风味变差，重则使产酸终止、产品废弃，导致巨大经济损失。噬菌体（bacteriophage）是感染细菌的一种病毒，它分布广泛，各种乳酸菌都容易被其种属特异性的噬菌体感染。在乳制品生产企业，噬菌体不仅天然存在于生牛乳、乳清液等原料奶中，在车间的天棚和墙壁、设备表面、生奶储罐、奶槽车、水池、下水道，以及污垢与灰尘中均有分布。尽管车间消毒和轮换发酵菌是防止噬菌体污染的重要手段，但是在生产过程中对噬菌体进行监测并及时采取对策仍是必要措施。

检测噬菌体的传统方法是双层琼脂平板法，但该方法耗时长，敏感性差，在时效上不能满足发酵生产的要求。通过PCR和qPCR进行噬菌体DNA检测是快速灵敏特异的最佳方法。由于同一亚群不同毒株的噬菌体其基因组都变异很大，不仅同源区少，让引物设计困难，而且往往无法找到三段距离接近且合适的保守序列用来设计基于TaqMan探针法的荧光PCR检测引物和探针。因此，许多乳酸菌的相应噬菌体检测只能用一对正向和反向引物，建立基于电泳分析的常规PCR或基于嵌合染料的实时荧光PCR方法。可是，非探针法的嵌合染料实时荧光PCR与探针法相比存在方法学缺陷，即使引物设计的很特异，但是由于引物二聚体、发夹结构和非特异扩增非常容易发生，几乎无法避免，这种非目的片段的DNA双链也会嵌合大量染料分子，从而导致荧光信号增长并呈现出假阳性结果。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物。

本发明还提出一种具有上述引物的试剂盒。

本发明还提出上述引物和试剂盒的应用。

本发明还提出一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。

在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的5'端的第12、17位核苷酸为锁核酸。

在本发明的一些实施方式中，所述反向引物的5'端的第11、19位核苷酸为锁核酸。

在本发明的一些实施方式中，所述正向引物的5'端标记有淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ1和MGB中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述淬灭基团为Dabcyl。

根据本发明的第二方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒含有上述引物。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括荧光PCR反应混合液和DMSO。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光PCR反应混合液为SYBR Green Pro Taq HSPremix Ⅱ。

根据本发明的第三方面，提出了上述引物和试剂盒的应用，所述应用为在制备检测保加利亚乳杆菌噬菌体的试剂中的应用。

根据本发明的第四方面，提出了一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法，所述方法包括以下步骤：采用上述引物或试剂盒对待测样本进行检测。

在本发明的一些实施方式中，所述检测采用荧光定量PCR进行。

在本发明的一些实施方式中，所述引物在所述荧光定量PCR的反应体系中的终浓度约为0.25μM。

在本发明的一些实施方式中，所述DMSO在所述荧光定量PCR的反应体系中的终浓度约为2.5%。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR的扩增反应体系为：

荧光PCR反应混合液2×1×；

上下游引物0.25μM；

DMSO2.5%；

待检测样品2-4µL；

ddH₂O补足至20μL。

在本发明的一些实施方式中，所述荧光定量PCR的扩增程序为：95°C预变性2-5min；然后进入循环阶段：95℃变性3-8s，60℃复性和延伸20-40s，40个循环，60°C采集荧光数据。

在本发明的一些实施方式中，所述检测后，还包括对样本的Ct值进行统计，进行结果判读的步骤；所述结果判读为：

阳性：如果样本的Ct值≤35，则样本为阳性；

阴性：如果样品无荧光增幅现象，则样本为阴性；

如果样本的Ct值介于35和40之间，需要重新检测，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，则判为阳性。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明通过创造性设计筛选获得一对用于检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的高特异性引物，所述引物序列的设计通过将核苷酸选择性用锁核酸替换，以增加引物二聚体或发夹结构之间双链部位的互斥性，同时又能提高引物与模板互补配对的特异性和结合强度；并且正向引物5’端还标记有荧光淬灭基团Dabcyl，可以淬灭引物二聚体和发夹结构形成短双链而嵌合的荧光分子，进一步避免假荧光信号，实现双重保障；同时本发明还对检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的反应体系进行了优化，通过上述引物的设计改造和反应体系优化，极大提高了检测特异性，解决了非探针的嵌合染料实时荧光PCR技术的方法学缺陷问题。本发明检测保加利亚乳杆菌噬菌体的方法操作简便、快速，检测特异性强、灵敏度高，结果稳定可靠、成本低廉，适合于酸奶发酵工业中对各种原料奶、发酵中的产品和环境样品的检测，有利于快速检出噬菌体污染情况并采取有效及时的防治措施。本发明的方法在核酸检测领域具有通用性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的高特异性锁核酸引物的设计图；

图2为本发明实施例3中的实验组特异性评价的荧光PCR实验结果图；

图3为本发明实施例3中的对照组特异性评价的荧光PCR实验结果图，其中，最左侧的S形荧光增长曲线是阳性对照；右侧有13条荧光增长曲线分别来自空白对照和阴性对照的非特异性扩增；

图4为灵敏度分析的荧光PCR实验结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的检测引物的设计和确定

1、引物的设计及优化

（1）引物的设计和筛选

针对Ld3、Ld17、Ld25A、C5、LL-Ku、phiLdb、PMBT4等7株保加利亚乳杆菌噬菌体基因组（GenBank数据库中的检索号分别为NC_025421、NC_025420、NC_025415、NC_019449、NC_022989、NC_022762、MG913376），利用生物软件DNAMAN 6.0进行序列比对分析，定位它们的同源区域并进行选择，然后利用生物软件Oligo 7.60对选出的同源区域分析能否设计出合适的引物，结合2个软件的数据反复分析，筛选得到多对引物，然后通过实验测试再优选出扩增效率等各项性能最佳的引物对。最后筛选得到引物对的正向引物的序列是：CTATGATGGAGCAAAGACTCCT（SEQ ID NO:1）；反向引物的序列是：ACTGTAGCAGAGTTGAAAGAGTA（SEQ ID NO:2），引物所在的基因是"putative major tail protein"。

（2）锁核酸引物的构建

针对上述优选出的引物对，全面综合分析正向引物之间，反向引物之间，正向和反向引物之间的碱基互补配对形成二聚体的情况，以及正向引物和反向引物的自身形成发夹结构的碱基配对情况，避开已配对的碱基，在非配对的位置有针对性的选出2个核苷酸，用相应的锁核酸替换，其目的是增加引物二聚体之间或发夹结构中双链之间的互斥性，使其难以形成二聚体或发夹结构，同时锁核酸又能提高引物与其模板互补配对的特异性和结合强度，最终减少甚至避免非特异性PCR扩增的发生。设计过程如图1所示。其中将正向引物从5’端计数，第12位和第17位的核苷酸用相应的锁核酸替换；反向引物从5’端计数，第11位和第19位的核苷酸用相应的锁核酸替换。

（3）引物荧光淬灭基团Dabcyl的添加

针对步骤（2）构建得到的锁核酸引物，无论正向引物还是反向引物，均分别合成不标记的或5’端标记荧光淬灭基团Dabcyl的引物。Dabcyl的作用是可以淬灭短DNA双链的荧光，如引物二聚体结合的SYBR Green。

将上述不标记的或5’端标记荧光淬灭基团Dabcyl的引物组成4种引物组合，分别为组合1：5’端标记Dabcyl的锁核酸正向引物+非标记的锁核酸反向引物；组合2：非标记的锁核酸正向引物+5’端标记Dabcyl的锁核酸反向引物；组合3：5’端标记Dabcyl的锁核酸正向引物+5’端标记Dabcyl的锁核酸反向引物；组合4：非标记的锁核酸正向引物+非标记的锁核酸反向引物，将此4种引物组合进行SYBR Green荧光PCR平行测试比较，根据空白对照和阴性对照的实验结果来分析假阳性荧光信号的有或无，优选出最佳组合。测试评价的指标有：是否产生假阳性荧光信号、PCR扩增效率（不同模板浓度的Ct值大小、荧光增长曲线的形状和荧光强度）。

荧光PCR的反应体系：20μL的反应体系中，包含10μL荧光PCR反应混合液（2×SYBRGreen Pro Taq HS Premix Ⅱ），0.5μL的DMSO（终浓度2.5%），1μL的正向引物（分别为上述4中引物组合的正向引物，终浓度为250nM）、1μL反向引物（分别为上述4中引物组合的反向引物，终浓度为250nM）、DNA模板（阳性模板为保加利亚乳杆菌噬菌体DNA，模板浓度分别为10⁵PFU/mL、10⁴PFU/mL、10³PFU/mL，空白对照为ddH₂O，阴性对照为无关物种的核酸提取物，如大肠杆菌的基因组DNA）2.5μL，ddH₂O补足20μL。

荧光PCR反应程序为：95℃预变性3min；然后进入循环阶段：95℃变性5sec，60℃复性+延伸30sec，40个循环，60℃采集荧光数据。

实验统计分析结果如表1所示，从表1中可以看出，尽管组合4有最好的扩增效率，但会产生假阳性信号，而组合1相比组合4扩增效率虽然稍差，但该引物组合不会产生假阳性信号，证明正向引物5’端标记的Dabcyl能够淬灭非特异性荧光信号。因此，筛选得到的高特异性锁核酸引物的正向引物的序列是：5’-Dabcyl-CTATGATGGAGCAAAGACTCCT-3'（SEQ IDNO:3）；反向引物的序列是：5'-ACTGTAGCAGAGTTGAAAGAGTA-3'（SEQ ID NO:4），其中，下划线标记的核酸用相应的锁核酸替换。

表1. 四种引物组合的实验综合分析结果

实施例2 一种用于检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的试剂盒

本实施例制备了一种用于检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的试剂盒，组分包括，实施例1制备得到的保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的检测引物（序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4所示），荧光PCR反应混合液（购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，SYBR Green Pro TaqHS 预混型 qPCR 试剂盒 II（货号：AG11702））。

反应体系的优化

（1）配制反应体系：20μL的反应体系中，包含10μL荧光PCR反应混合液（2×SYBRGreen Pro Taq HS Premix Ⅱ），0.5μL的DMSO（终浓度分别为0、1.5%、2.5%和3.75%），1μL的正向引物、1μL反向引物（实施例1制备的正向引物和反向引物的终浓度相同，分别为125nM、250nM、375nM、500nM）、DNA模板（分别为阳性模板、阴性对照和空白对照，阳性模板为保加利亚乳杆菌噬菌体DNA，阴性对照为无关物种的核酸提取物，空白对照为ddH₂O）2.5μL，ddH₂O补足20μL。根据阳性样本的荧光PCR实验结果来综合评判PCR扩增效率，主要分析Ct值、荧光曲线形状、荧光增长强度；根据空白对照和阴性对照的实验结果来分析假阳性荧光信号的有或无。

（2）荧光定量PCR进行检测

荧光PCR反应循环参数为：95℃预变性3min；然后进入循环阶段：95℃变性5sec，60℃复性+延伸30sec，40个循环，60℃采集荧光数据。

阴性及阳性结果的判断：检测样品无荧光增幅现象，判为阴性；检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤35时，判为阳性，检测样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时重新实验。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性。

表2 引物浓度和DMSO浓度的优化实验结果

针对引物浓度和DMSO的浓度通过正交试验来优化分析，综合评判PCR扩增效率及是否产生假阳性荧光信号的检测结果如表2所示，从表中可以看出，DMSO终浓度2.5%和引物终浓度为250nM的效果最好。

因此优化得到的体系为：10μL的2×SYBR Green Pro Taq HS Premix Ⅱ、0.5μL的DMSO（终浓度为2.5%）、1μL的正向引物（终浓度为250nM）和1μL反向引物（终浓度为250nM）、DNA模板2.5μL，ddH₂O补足20μL。

实施例3特异性检测

由于PCR反应在使用常规引物时，几乎是不可避免的产生引物二聚体扩增，发夹扩增或非特异性扩增。由于SYBR Green等荧光染料是非特异性的结合任何的双链DNA分子，导致染料法的荧光PCR反应极易产生假阳性的荧光增长信号。

采用实施例2制备得到的用于检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的试剂盒、优化得到的体系和检测程序，进行大量重复性的无模板扩增实验和非阳性DNA样本的扩增试验，评价了本发明设计的高特异性引物及SYBR Green荧光PCR检测方法。

实验组采用实施例1制备得到的高特异性锁核酸引物，对照组是常规引物（序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示），即没有锁核酸且无标记的普通引物。

实验组和对照组的模板均为48管，两组添加的模板完全一致，这48管中，第1-16管是加了PBS的空白对照；第17-47管是加了各类生物物种DNA的阴性对照，DNA种类包括非保加利亚乳杆菌噬菌体DNA（如乳酸乳球菌噬菌体的936亚群、P335亚群、C2亚群，嗜热链球菌噬菌体的cos亚群），细菌DNA（如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌等），病毒的cDNA（如流感病毒、轮状病毒、腺病毒、星状病毒等），人类基因组DNA，牛的基因组DNA，羊的基因组DNA；第48管为阳性对照，添加了10⁶PFU/mL的保加利亚乳杆菌噬菌体DNA。

结果如图2-3和表1所示，没有1个反应管会出现非特异性的假阳性结果，从图2中可以看出，实验组的47管空白对照和阴性对照均没有出现假阳性的荧光扩增信号，特异性达100%；从图3中可以看出，对照组的空白对照出现了4管假阳性的荧光扩增信号，阴性对照出现了9管假阳性的荧光扩增信号，特异性仅72.34%（12+22/47）。

表3特异性试验统计结果

实施例4 灵敏度分析

取浓度为10⁹PFU/mL的保加利亚乳杆菌噬菌体储备液，用PBS进行梯度稀释，分别稀释成10⁸PFU/mL、10⁷PFU/mL、10⁶PFU/mL、10⁵PFU/mL、10⁴PFU/mL、10³PFU/mL、10²PFU/mL、10¹PFU/mL、10⁰PFU/mL的用于灵敏度分析的噬菌体样品，每个浓度取1mL，采用购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体DNA，未加噬菌体的PBS作为空白对照。采用实施例2制备的试剂盒和优化得到的体系和检测程序（SYBR Green荧光PCRS方法）对噬菌体梯度DNA样品进行检测，评价其灵敏度。

荧光PCR扩增结果图如图4所示，从图中可以看出，本发明建立的保加利亚乳杆菌噬菌体DNA检测方法灵敏度高，可检出浓度为10²PFU/mL的噬菌体。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种检测保加利亚乳杆菌噬菌体DNA的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述引物的核苷酸序列中至少存在一个锁核酸。

2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的5'端的第12、17位核苷酸为锁核酸。

3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述反向引物的5'端的第11、19位核苷酸为锁核酸。

4.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正向引物的5'端标记有淬灭基团。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1-4任一项所述的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括荧光PCR反应混合液和DMSO。

7.权利要求1-4任一项所述的引物和权利要求5-6任一项所述的试剂盒中的至少一种在制备检测保加利亚乳杆菌噬菌体的试剂中的应用。

8.一种保加利亚乳杆菌噬菌体的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：采用权利要求1-4任一项所述的引物或权利要求5-6任一项所述的试剂盒对待测样本进行检测。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测采用荧光定量PCR进行。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的扩增程序为：95°C预变性2-5min；然后进入循环阶段：95℃变性3-8s，60℃复性和延伸20-40s，40个循环，60°C采集荧光数据。