CN1952174A - 特异检测牛疱疹病毒ⅰ型的lux荧光引物和核酸扩增方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了牛疱疹病毒I型(BHV－1)特异的LUX(Light Upon Extension)荧光PCR引物序列和实时荧光PCR检测方法。本发明以BHV－1病毒的gpC基因为目标基因，设计和筛选BHV－1特异的单标记自身淬灭LUX荧光引物和对应的配对引物。采用BLAST软件对引物序列的分析结果表明，两条引物序列与数据库中的所有BHV－1病毒对应序列完全吻合，与其他动物病毒序列无明显相关性。本发明对实时荧光扩增反应退火温度和时间、镁离子浓度、引物浓度进行优化，采用优化的反应条件和熔解曲线结果判定方法，进行了特异性和敏感性试验，证实方法特异、敏感。可在2小时内准确检测到拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、精液、体外细胞培养物等样品中的BHV－1病毒，检测敏感性比常规凝胶PCR方法可提高达10⁴。目前国内外应用的BHV－1感染检测技术耗时长、敏感性、特异性不理想。本发明提供了一种新的快速准确的BHV－1检测技术。

Description

特异检测牛疱疹病毒I型的LUX荧光引物和核酸扩增方法

一、技术领域

本发明提供牛疱疹病毒I型(BHV-1)病毒特异的荧光核酸扩增引物并建立一种快速、准确检测BHV-1病毒的新型实时荧光核酸扩增方法，适用于进出口动物检疫、动物传染病疫情防控、诊断和流行病学调查领域对BHV-1病毒感染引起的传染病的快速检测、监控和防治。

二、背景技术

牛疱疹病毒I型(BHV-1)可感染牛引起牛传染性鼻气管炎(Infectious bovinerhinotracheitis，IBR)和牛传染性脓疱性外阴阴道炎(Infectious pustularvulvovaginitis，IPV)，是一种急性、接触性病毒性传染病，在临床上表现为鼻气管炎、、角膜结膜炎等症状，引起牛生长发育不良、产乳量和生殖力下降、流产、死亡率和淘汰率增高，给养牛业造成严重的经济损失。IBR/IPV被国际动物组织(OIE)列为B类疫病，被我国列为二类动物检疫疫病。在活牛和牛遗传物质(精液、胚胎)的国际贸易和我国的进出口检疫中，均要求对IBR/IPV进行严格检疫，我国进口活牛的主要输出国澳大利亚和新西兰均是IBR/IPV高发区。该病在国内的传播感染范围也较广，对我国养牛业生产、活牛和牛产品贸易造成较严重威胁。

在本发明方法之前，国内外在进出口动物检疫和疾病监控中采用的检测BHV-1感染的方法。长期以来，由于缺乏快速、有效的检测方法，OIE在国际动物和动物产品贸易中推荐采用血清中和试验和病毒分离进行IBR诊断。这两种方法前者检测的是抗体，后者检测病毒，均需要进行细胞培养，操作繁琐，耗时长，需要1-2周时间，且敏感性不理想，其中，牛精液和胚胎的检验只能采用病毒分离方法。除这两种方法外，国内外还采用酶联免疫吸附试验方法(ELISA)检测抗体，由于致病因子感染动物后产生抗体需要1-2周时间，抗体检测方法不利于IBR病毒(BHV-1)急性感染或早期感染情况的诊断，并且ELISA方法特异性不理想。国内外还报道了检测IBR病毒的常规核酸扩增(Polymerase chain reaction，PCR)方法，这种方法检测的是病毒核酸，比上述方法的特异性和敏感性均有显著提高，但常规PCR方法需要通过凝胶电泳判定结果，费时费力，且易造成PCR产物污染环境引起假阳性反应，不利于方法推广应用，目前这种方法主要应用于实验室研究或少量样品的检测。

本发明采用LUX(Light Upon Extension)新型实时荧光核酸扩增技术原理，设计筛选了BHV-1特异的LUX荧光PCR引物，建立了快速准确检测BHV-1的LUX荧光PCR方法，该方法可通过电脑实时监控检测结果，不需要对反应产物进行凝胶电泳等操作，操作简便快速，适合推广应用。LUX技术的原理是通过构建一个单标记的具有自身淬灭荧光性能的引物-LUX荧光引物，即在PCR的一个引物上引入发夹结构，并标记上荧光基团，在PCR反应过程中，引物与靶序列配对后，其荧光就会恢复产生可检测的光信号，从而达到实时监测反应过程的目的。

LUX荧光PCR技术的关键是特异引物的设计，对于不同的检测目标基因，需要设计不同的特异LUX引物和根据引物的核苷酸组成性质设置不同的反应条件。

目前常用的实时荧光核酸扩增技术主要有采用双标记的寡核苷酸探针和采用双链DNA结合染料两种，前者成本高，后者易产生假阳性反应。LUX荧光PCR技术的特异性和敏感性与双标记探针技术相当，但由于采用的是单标记的自身淬灭荧光引物，可显著降低检测成本，有利于方法的推广应用和商业化试剂盒开发。

实时荧光核酸扩增技术已广泛应用于人和动植物病原体的快速检测研究和临床诊断，禽流感、口蹄疫等传染病的实时荧光PCR试剂盒已实现商业化，但均为采用双标记寡核苷酸探针技术或核酸染料技术，未见采用LUX荧光PCR技术。另一方面，由于国内养牛业和乳业生产近年来呈持续快速增长的势头，近几年均从国外大量引进优质种牛，对IBR等相关传染病的快速检测技术需求迫切。因此，本发明所建立的方法有开发商业化检测试剂盒的价值。迄今，除本发明外，国内外均未有报道BHV-1特异的LUX荧光PCR检测方法。

三、发明内容

本发明提供了BHV-1特异的LUX荧光引物并建立了一种能快速、准确检测BHV-1病毒的分子生物学方法-LUX实时荧光PCR方法。内容包括：

1、通过专用软件设计BHV-1特异的LUX自身淬灭荧光引物和对应的配对引物。

引物的靶序列来源于BHV-1 gpC基因序列。通过专业软件针对gpC基因的保守区设计引物，选取软件生成的多对引物序列，应用blast软件进行分析，从中筛选出特异性和检测范围满足要求的一对LUX自身淬灭荧光引物和配对引物序列，其中反向引物为LUX荧光引物，含有发夹结构并标记FAM荧光基团。应用blast软件进行核酸序列同源性分析表明，所选取的两条引物序列均与公开数据库中所有BHV-1 gpC基因的对应序列完全相符合，未发现与其它动物病毒的核酸序列有相关性，分析结果证实所设计的引物为BHV-1特异。引物的核酸序列见序列表。

2、对LUX实时荧光PCR退火温度和时间、引物浓度、镁离子浓度进行优化，建立了适合LightCycler(Roche)荧光核酸扩增仪的优化反应条件，包括反应液体系和循环反应条件。

为取得最佳的检测效果，本发明进行一系列试验，对不同的实时荧光PCR退火温度和时间、引物浓度、镁离子浓度进行检测效果测试，最终将在LightCycler(Roche)荧光核酸扩增仪上的反应条件优化为65℃退火20秒、采用0.5μM引物浓度和4mM镁离子浓度。

反应液体系，采用20μl反应体积，组成如下：

Quantitative PCR SuperMix-UDG    10μl

50mM MgCl₂                       0.4μl

荧光标记引物(10μM)            1μl

配对引物(10μM)                1μl

牛血清白蛋白(5mg/mL)           1μl

Taq DNA Polymerase(5U/μl)     0.5μl

灭菌双蒸水                     4.1μl

模板核酸                       2μl

扩增循环条件，在荧光PCR仪上设定：

荧光：F1

程序选择：扩增

分析模式：定量

UDG处理：50℃ 2min；

变性：95℃ 2min；

循环(40次)：94℃ 5s，65℃ 20s(采集信号)。

3、建立了熔解曲线结果判定方法，比常规采用Ct值及扩增曲线的判定标准更为准确和敏感。以在熔解曲线上90-93℃出现明显吸收峰定为阳性反应。

对于实时荧光PCR反应的结果判定，可采用在定量分析模式下出现S型扩增曲线和有效Ct值作为阳性结果的判定依据；也可采用熔解曲线判定方法，即以在熔解曲线的特定温度区域是否出现吸收峰作为阳性结果的判定依据。本发明比较了两种判定模式，发现采用熔解曲线判定模式可提高检测的敏感性和特异性。

熔解曲线分析条件，在荧光PCR仪上设定：

程序选择：熔解曲线

分析模式：熔解曲线

温度条件(在扩增反应结束后进行)：

95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。

4、将LUX实时荧光PCR方法与常规凝胶PCR方法进行比较试验，表明可显著提高检测敏感性。

将浓度为11800μg/ml的BHV-1病毒核酸样品进行10倍倍比系列稀释，分别用LUX实时荧光PCR方法和常规凝胶PCR方法进行检测试验，结果前者的检测敏感性为10⁸稀释度，后者仅能检测到10⁴稀释度，表明LUX实时荧光PCR方法的检测敏感性比常规凝胶电泳PCR方法可提高达10⁴。

5、本发明方法的具体步骤：

(1)设计合成引物。

(2)、采集样品，提取核酸。本发明可检测体外细胞培养病毒样品、动物活体采集的样品如血液、唾液、呼吸道分泌物、精液、阴道拭子等，以及通过剖检采集的组织样品，如呼吸道粘膜、神经组织等。采用QIAGEN DNA KIT技术从上述样品中提取核酸。

(3)、加样。按上述反应液体系，在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号。

(4)、上机检测。在荧光PCR仪上，按上述扩增循环条件和熔解曲线分析条件设定反应参数，放入反应管，开机检测。

(5)、分析、判定结果。在定量分析模式和熔解曲线模式下分别分析反应结果，根据熔解曲线最终判定结果。

全过程可在2小时内结束。

6、本发明特点。

单标记的荧光引物特异性强，成本低，操作简便，检测结果监控和分析自动化，适合大批量样品的检测。检测敏感性和特异性比现有方法显著提高，检测结果可靠，适合推广应用。

7、检测试验。

(1)、对BHV-1疫苗株和分离株的检测结果。

将BHV-1疫苗株Barta/Nu和分离株4027分别接种MDBK细胞，产生细胞病变后，分别取样提取核酸进行LUX实时荧光PCR检测，取正常MDBK细胞提取核酸作为阴性对照，并以灭菌双蒸水作为模板设空白对照，同时进行检测。结果如附图1，Barta/Nu疫苗株和4027分离株样品的熔解曲线均在90-93℃出现吸收峰，MDBK细胞阴性对照和空白对照均未形成吸收峰。

(2)、对BHV-1病毒精液样品的检测试验。

取BHV-1疫苗株Barta/Nu的细胞病毒液5μl、10μl、20μl、50μl分别与195μl、190μl、180μl、150μl阴性精液样品混合制备一组体积为200μl的病毒精液样品，分别提取核酸后进行LUX实时荧光PCR检测，取阴性精液样品200μl提取核酸同时进行检测，结果如附图2。四个混合了病毒液的精液样品对应的熔解曲线均出现特征吸收峰，阴性精液样品未出现吸收峰。

(3)、特异性试验。

将BHV-1病毒核酸和其它四种常见的牛病毒(牛病毒性腹泻-粘膜病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、牛白血病病毒)核酸样品同时进行LUX实时荧光PCR检测，结果见附图3。仅BHV-1病毒核酸样品对应的熔解曲线出现特征吸收峰。

(4)、敏感性试验。

取接种MDBK细胞增殖产生的BHV-1病毒液(毒价为10^-7.5TCID₅₀/ml)200μl提取核酸，然后用灭菌双蒸水进行10倍系列倍比稀释，取10^-1到10^-7样品同时进行LUX实时荧光PCR检测。结果如附图4，10^-1到10^-6样品对应的熔解曲线均出现特征吸收峰，检测敏感性可达10^-6稀释度，10^-7稀释度和灭菌双蒸水对照样品没有出现特征吸收峰。

附图1、对BHV-1病毒疫苗株和分离株的检测试验。

1：BHV-1疫苗株Barta/Nu； 2：BHV-1分离株4027；

3：MDBK细胞阴性对照；4：灭菌双蒸水空白对照。

附图2、对BHV-1病毒精液样品的检测试验。

1-4：分别为含50、20、10和5μl病毒液的精液样品

5：阴性精液样品对照。

附图3、BHV-1 LUX实时荧光PCR检测特异性试验。

1：BHV-1病毒核酸；2-5：其他四种牛病毒核酸。

附图4、BHV-1 LUX实时荧光PCR检测敏感性试验。

1-6：分别为10^-1-10^-6稀释度的病毒核酸样品；

7-8：分别为10^-7稀释度病毒核酸样品和灭菌双蒸水对照样品。

四、具体实施方式。

1、引物设计：在Genebank中下载BHV-1目标基因gpC序列，采用在线LUX荧光引物设计软件(http://www.invitrogen.com/lux)设计BHV-1病毒特异的LUX荧光引物和配对引物，采用Blast软件分析引物序列的特异性。采用权力要求书中的引物。引物序列见序列表。

2、检测样品：采集牛鼻腔或生殖道拭子、呼吸道、眼分泌物、血液、牛精液、唾液、体外细胞培养物等样品。拭子样品应悬浮在PBS缓冲液中。

3、核酸提取：采用QIAGEN DNA KIT提取核酸。步骤简要如下：

(1)、在1.5ML离心管中加入20μl QIAGEN蛋白酶或蛋白酶K，加入200μl样品，若样品体积不足200μl，则加PBS补足体积。

(2)、加200μl AL缓冲液，用涡旋振荡器混匀15s。

(3)、在56℃温浴10min。

(4)、加入200μl无水乙醇，用涡旋振荡器混匀15s。

(5)、把所有液体移入QIAamp离心柱，套入收集管，盖上盖子，放入台式微量离心机，6000×g离心1min。

(6)、把离心柱放入新的收集管，加入500μl AW1洗涤液，盖上盖子，6000×g离心1min。

(7)、把离心柱放入新的收集管，加入500μl AW2洗涤液，盖上盖子，用最高转速(16,000-20,000×g)离心3min。

(8)、把离心柱放入新的1.5ML灭菌离心管，加入100μlAE洗脱液，室温(15-25℃)静置1分钟，6000×g离心1min。

(9)、所提取的核酸样品可直接进行LUX实时荧光PCR检测，也可置-20℃冻存备用。

4、LUX实时荧光PCR检测反应：

(1)、仪器：LightCycler(Roche)

(2)、加样：试剂除引物外，可从invitrogen公司购买。采用20μl反应体积，1个样品的反应液体系如下：

Quantitative PCR SuperMix-UDG    10μl

50mM MgCl₂                       0.4μl

荧光标记引物(10μM)              1μl

配对引物(10μM)                  1μl

牛血清白蛋白(5mg/mL)             1μl

Taq DNA Polymerase(5U/μl)       0.5μl

灭菌双蒸水                       4.1μl

总体积                           18μl

进行多个样品检测时，将上述各试剂的量乘以样品数。每次检测均设至少1管阳性对照和1管阴性对照。

在灭菌反应管中依序按比例加入上述试剂，用微量移液器混匀，注意避免产生气泡，按18μl/管分装加入LightCycler(Roche)毛细管。

在毛细管中每管加入2μl核酸样品，记录样品和反应管编号，盖好，700×g离心10秒，把毛细管小心放到LightCycler(Roche)仪器中。

(4)、上机检测：

在LightCycler(Roche)仪器的反应界面，按以下参数设定扩增反应和结果分析条件：

扩增循环条件：

荧光：设F1；程序选择：扩增；分析模式：定量。

UDG处理：50℃ 2min；变性：95℃ 2min；循环(40次)：94℃ 5s，65℃ 20s(采集信号)。

熔解曲线制备条件：

程序选择：熔解曲线；分析模式：熔解曲线

温度条件(在扩增反应结束后进行)：95℃ 0s，72℃ 20s，95℃ 0s(0.1℃/s)。

条件设定好后，对样品进行编辑，按仪器指示储存检测程序和试验数据文件，开机开始检测反应。

(5)、在反应过程中，可通过电脑实时观察各样品荧光信号的变化情况。

5、结果判定：

反应结束后，可在定量分析模式下，察看各样品的扩增曲线和Ct值，阳性对照应出现典型s型扩增曲线，Ct值应小于35，阴性对照的扩增曲线应平坦，应无Ct值。

检测结果的最终判定在熔解曲线模式下进行，阳性对照应在90-93℃出现明显吸收峰，阴性对照应在相应区域不出现吸收峰。在对照成立的条件下，样品在90-93℃出现吸收峰的判为阳性，与阴性对照一致不出现上述特征吸收峰的判为阴性。

                                 BHV-1序列表

<110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>特异检测牛疱疹病毒I型的LUX荧光引物和核酸扩增方法

<160>2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>该序列含有可形成发夹结构的核苷酸

<400>1

cacgaggtaa cgggcgggtc gtg               23

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

cgacgctacg ccagagga                     18

Claims (1)

1、牛疱疹病毒I型(BHV-1)病毒特异的LUX荧光核酸扩增引物和配对引物。

两条引物根据BHV-1病毒gpC基因序列，应用专业软件设计和筛选得到，用于建立LUX实时荧光PCR方法快速、准确检测BHV-1病毒。其中，反向引物为LUX荧光引物，除gpC基因序列外，还含有能形成发夹结构的核苷酸序列，并标记FAM荧光基团。

两条引物的序列如下：

正向引物：5’CGACGCTACGCCAGAGGA 3’

反向引物：5’CACGAGGTAACGGGCGGGTCGTG 3’。

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