KR102284248B1 - 니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 바이러스의 검출방법 - Google Patents

니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브는 민감도가 우수하며, 니파 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 니파 바이러스의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 바이러스에 대한 효과적인 방역 대책 마련에 도움이 될 수 있다.

Description

니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 바이러스의 검출방법{PRIMERS AND PROBES FOR DETECTION OF NIPAH VIRUS AND DETECTING METHOD FOR NIPAH VIRUS USING THE SAME}
본 발명은 니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 니파 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
니파 바이러스(Nipah virus)는 1999년 말레이시아와 싱가포르에서 호흡기 증상을 보인 성인에서 분리되었으며, 최초 분리된 지역의 이름을 따서 니파로 명명되었다.
니파 바이러스는 18.2kb 크기의 negative-strand RNA를 유전자로 갖고 있고, 이 유전자는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N), 인단백질(phosphoprotein, P), 매트릭스(matrix, M), 융합 단백질(fusion, F), 부착 당단백질(attachment glycoprotein, G), 큰 중합효소(large polymerase, L)로 구성되어 있다. 상기 바이러스는 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하고 다른 파라믹소바이러스과에 속하는 바이러스와 같이 이 바이러스는 부착 단백질(G)과 융합 단백질(F)이 이 숙주 세포의 수용체에 부착됨으로써 감염되는데 특히 G 단백질은 세포의 에프린-B2, -B3(ephrin-B2, -B3) 수용체에 부착된다고 알려져 있다.
니파 바이러스는 고열, 두통, 현기증, 인후통, 기면증 등의 특징이 있다. 니파 바이러스는 인수공통 바이러스이며 동물에서 발생했을 경우 대부분의 감염동물이 정상으로 회복되지만, 사람의 경우에는 심각한 뇌염 유사증상을 유발하고 치사율이 매우 높다.
니파 바이러스 감염이 주로 발병하는 지역들은 열대 및 아열대 지역의 상대적으로 빈곤한 국가들이고, 선진국에서는 국가 내 발병보다는 상기 국가에서 감염된 후 입국하는 형태이기 때문에 니파 바이러스 진단법에 대한 연구가 미진하다.
외국의 경우, 지금까지 말레이시아에서는 환자 265명 중 105명 사망, 방글라데시에서는 환자 135명 중 97명 사망, 인도에서는 환자 19명 중 17명이 사망하여 높은 치명율을 보이고 있으나, 국내의 경우에는 현재까지 니파 바이러스 감염병이 발생한 적은 없다.
비록 현재까지 니파 바이러스의 국내 유입은 없으나, 조류독감(1997, 홍콩), SARS(2003, 중국), MERS(2015, 대한민국), 가장 최근에는 코로나19 바이러스와 같이, 전세계인 감염병으로 확산될 우려가 있고, 니파 바이러스는 매우 높은 치명율을 나타내므로, 아직 국내에서 발병이력이 없고 유입되지 않은 바이러스이지만, 반드시 선제 대응과 모니터링을 위한 검사 시스템 구축과 대유행 사태를 대비하기 위한 바이러스 검출법 개발이 필요하다.
이에, 니파 바이러스를 검출하기 위한 방법에 관련된 연구가 계속 되었고 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR) 등을 이용하여 니파 바이러스를 검출할 수 있는 방법, 검출용 조성물, 그리고 해당 조성물을 포함하는 키트 등이 개발되었다. 그러나 기존의 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 니파 바이러스를 검출하기 위한 방법들은 니파 바이러스에 대한 특이도나 민감도 등에서 한계가 존재하였다.
본 발명자들은 기존의 검출 방법보다 더 나은 효과를 가지는 니파 바이러스에 대한 새로운 검출 방법 개발에 착수하였고, 그 결과 니파 바이러스의 M 유전자를 표적으로 하여 니파 바이러스를 검출 및 확진할 수 있는 프라이머 및 프로브 세트를 제작하고, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 유전자증폭기법을 수행하면 신속하게 우수한 민감도로 니파 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 높은 치명율을 나타내는 니파 바이러스의 유입에 선제 대응 및 모니터링을 위한 검사 시스템 구축과 대유행 사태를 대비하기 위한 니파 바이러스의 검출법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트를 포함하는니파 바이러스를 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 검체를 주형으로 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 니파 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 니파 바이러스를 특이적으로 구분하여 검출할 수 있고, 공지된 프라이머 세트에 비하여 분석적 민감도 등 검출효율이 우수하므로, 니파 바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있고, 상기 바이러스에 대한 효과적인 방역 대책 마련에 도움이 될 수 있다.
도 1은 니파 바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 헨드라 바이러스와 유전자 다중 정렬을 수행함으로써, 니파 바이러스만이 검출되는 것을 확인한 도이다.
도 2는 기존의 실시간 중합효소연쇄반응 조건과 고속 실시간 중합효소연쇄반응 조건에 따라 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 니파 바이러스 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 2a는 기존의 실시간 중합효소연쇄반응 조건에서 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 니파 바이러스 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 2b는 고속 실시간 중합효소연쇄반응 조건에서 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 니파 바이러스 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 니파 바이러스 특이적 검출 시스템의 검출한계를 분석한 결과 그래프이다.
도 3a는 니파 바이러스 특이적 검출을 목적으로 하는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 증폭 곡선의 로그 그래프이다.
도 3b는 니파 바이러스 특이적 검출을 목적으로 하는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 표준 곡선(standard curve)의 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열을 포함하는 프라이머는 니파 바이러스 검출용 프라이머이다.
상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트이다. 또한, 상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍이다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열을 포함한다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 니파 바이러스 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프로브 세트를 제공한다.
상기 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로브는 니파 바이러스 검출용 프로브이다.
본 명세서에서 사용되는 용어“프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수 개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE (6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET (Tetrachloro-Fluorescein), TRITC (tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED (N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM이다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ1이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로브 세트를 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가진다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트이다. 또한, 상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역의 유전자에 상보적으로 결합 가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍이다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열을 포함한다.
상기 프로브 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가진다. 일례로, 상기 프로브 세트는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, 상기 소광자는 BHQ1이다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로브를 제작하였다.(도 1 및 표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 프라이머 및 프로브의 농도 및 실험 조건을 최적화시켰고(표 3, 4 및 5 참조), 고속 실시간 중합효소연쇄반응(Fast real-time PCR) 조건을 확립하였다(도 2, 표 6 및 7 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 니파 바이러스에 대한 검출한계가 1.0×102 copies/㎕ 이하임을 확인하였고, 구체적으로는 니파 바이러스의 M 유전자의 RNA를 1.0×101 copies/㎕ 까지 희석하는 경우에도 검출할 수 있음을 확인하였으며(도 3 및 표 8 참조), 상기 바이러스가 특이적으로 구별되어 검출됨을 확인하였다(표 9 참조).
따라서, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 니파 바이러스의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 니파 바이러스를 검출할 수 있는 검출용 조성물을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가진다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로브 세트를 포함한다. 상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 염기서열을 포함한다. 상기 프로브 세트는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, 상기 소광자는 BHQ1이다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하는 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 니파 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서 실시간 중합효소연쇄반응은 고속 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있다. 일례로, 기존의 실시간 중합효소연쇄반응의 반응 시간은 2시간 소모되는 반면, 고속 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 반응 조건에서 역전사(reverse transcription) 과정과 결합/신장(annealing/extension) 시간을 최소화하여 반응시간을 80분으로 단축시킬 수 있다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트 및 프로브 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가진다. 일례로, 상기 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역을 특이적으로 증폭한다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 20 내지 30개의 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍이다. 또한, 상기 프로브 세트는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM, 상기 소광자는 BHQ1이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 니파 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브 제작
미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 데이터베이스에서 니파 바이러스에 대한 유전자 염기서열을 검색한 후, 각 서열을 정리하여, 니파 바이러스 15개의 염기서열 데이터베이스를 확보하였다. 상기 바이러스에 대한 염기서열을 이용하여 정렬(alignment)을 진행하여, 보존 영역(conserved region) 내에서 프라이머 및 프로브를 디자인하여 제작하였다(도 1 및 표 2). 본 연구에서 디자인한 프로브들(서열번호 3)은 수집한 전체 데이터베이스를 대상으로 서열 정렬 시 니파 바이러스에 대해 100%의 검출율을 나타냈다.
니파 바이러스 15종의 염기서열 명칭 리스트
등록번호 서열 명칭
AF212302 Nipah virus, complete genome
AF376747 Nipah virus nucleocapsid protein (N), V protein (P/V/C), phosphoprotein (P/V/C), C protein (P/V/C), matrix protein (M), fusion protein (F), and glycoprotein (G) genes, complete cds
AJ564621 Nipah virus complete genome, isolate NV/MY/99/VRI-2794
AJ564622 Nipah virus complete genome, isolate NV/MY/99/VRI-1413
AJ564623 Nipah virus complete genome, isolate NV/MY/99/UM-0128
AJ627196 Nipah virus complete genome, isolate NV/MY/99/VRI-0626
AY029767 Nipah virus isolate UMMC1, complete genome
AY029768 Nipah virus isolate UMMC2, complete genome
AY988601 Nipah virus from Bangladesh, complete genome
FJ513078 Nipah virus isolate Ind-Nipah-07-FG from India, complete genome
FN869553 Nipah virus N gene, P gene, M gene, F gene, G gene and L gene, isolated from urine of Pteropus vampyrus, genomic RNA
JN808857 Nipah virus isolate NIVBGD2008MANIKGONJ, complete genome
JN808864 Nipah virus isolate NIVBGD2010FARIDPUR, partial genome
KY425646 Nipah virus isolate IRF0160, partial genome
KY425655 Nipah virus isolate IRF0158, partial genome
니파 바이러스를 타겟으로 하는 프라이머 및 프로브 염기서열
바이러스 프라이머 또는 프로브 a 서열 (5'→3') 표적 서열번호
니파
바이러스		 Nipah-M-F AGG ACA ATT GCT GCC TAC CCT M 유전자 1
Nipah-M-R ATT TTC TCA GTT GAT CCA GCT GTT CT 2
Nipah-M-Probe (FAM, BHQ1) ACT TTG AGG GAA CAG AGT TCC TCC AGA AGA TC 3
aF: 정방향(forward) 프라이머
R: 역방향(reverse) 프라이머
<실시예 2> 니파 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 농도 및 실험 조건 최적화
다양한 최적화 과정을 통해, 니파 바이러스 검출을 위한 실시간 중합효소연쇄반응의 프라이머 및 프로브의 사용농도 및 실험 조건을 최적화하여 확정하였다(표 3 및 표 4). 니파 바이러스 검출에 사용되는 프라이머와 프로브를 각각 사용농도가 되도록 희석한 후 희석된 프라이머/프로브 믹스, AgPath-ID™ One-Step RT-PCR Reagents 및 template를 희석하여 PCR 정제 키트를 제작한 후 qPCR을 수행하였다(표 5). 그리고, 실시간 중합효소연쇄반응의 기본 성능 평가는 제작된 양성시료(in vitro transcribed RNA)로 검증하였다. 또한, PCR 저해물 여부 및 분석결과의 품질관리(Quality Control, QC)를 위해서 IC를 포함시켜 분석 결과의 정확성을 향상시켰다.
실시간 PCR 반응 조건
온도(℃) 시간 사이클
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 45
60 1분
프라이머 및 프로브의 최종 농도
프라이머 또는 프로브a 사용농도(nM)
Nipah-M-F 500
Nipah-M-R 500
Nipah-M-Probe(FAM) 100
aF: 정방향(forward) 프라이머
R: 역방향(reverse) 프라이머
PCR 반응에 쓰이는 PCR 정제 키트의 제작 과정
구성요소 용량 (㎕)
Primer/probe mix 1
25x RT-PCR Enzyme Mix 0.8
2x RT-PCR Buffer 10
Nuclease-free Water 3.2
Template 5
니파 바이러스 검출을 위한 보다 효율적인 검사 시스템으로 활용되기 위해선 반응 시간을 최소화시키는 것이 바람직하다. 기존의 실시간 중합효소연쇄반응의 반응 시간은 2시간 소모되는 반면, 고속 실시간 중합효소연쇄반응은 기존의 반응 조건에서 역전사(reverse transcription) 과정과 결합/신장(annealing/extension) 시간을 최소화하여 반응시간을 80분으로 단축시킬 수 있다(표 6).
표준 실시간 PCR과 고속 실시간 PCR 조건
사이클 온도(℃) 표준 실시간 PCR 고속 실시간 PCR
역전사 (reverse transcription) 1 50 30분 10분
예열 (pre-heating) 1 95 10분 10분
변성 (Denaturation) 40 95 15초 15초
결합/신장 (annealing/extension) 60 1분 30초
총 소요시간 - - 120분 80분
그 결과, 기존의 실시간 중합효소연쇄반응 시스템과 고속 실시간 중합효소연쇄반응 시스템의 실험 결과(민감도, 특이도)에 큰 차이가 없음을 확인하였고(도 2 및 표 7), 결과적으로 고속 실시간 중합효소연쇄반응 시스템을 니파 바이러스 검출에 활용할 수 있다.
니파 바이러스 실시간 PCR 중 니파 바이러스 고속 실시간 PCR 검출 결과
주형의 농도
(copies/㎕)		 표준
(Ct값)		 고속
(Ct값)
1.0×106 18.9 19.1
1.0×105 22.1 22.4
1.0×104 25.4 25.7
1.0×103 29 29.1
1.0×102 32.1 32.5
1.0×101 34.9 35.3
1.0×100 38.5 (3/6) 37.5 (4/6)
<실시예 3> 니파 바이러스 검출을 목적으로 하는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 분석적 민감도 확인
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하여 니파 바이러스를 얼마나 민감하게 검출할 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 니파 바이러스의 각 RNA 시료는 표적 증폭산물(target amplicon) 전체를 올리고(oligo) 합성한 후 이를 주형으로 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통해 확보하였다. 상기 RNA 시료들을 이용하여 상기 표 4에 기재된 프라이머 및 프로브 농도, 상기 표 3에 기재된 반응 조건에 따라 실시간 PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (ThermoFisher))를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 검출 소프트웨어(7500 Software v2.3)를 사용하여 분석하였다(도 3 및 표 8).
상기 실시예 1에서 정제한 각 합성 DNA의 농도를 계산하여, 106, 105, 104, 103, 102, 101 또는 100 copies/㎕ 농도로 준비하여 중합효소연쇄반응을 수행한 것을 제외하고는 상기 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 최소검출한계는 육안으로 밴드가 관찰되는 최소 농도를 기준으로 평가하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 기술을 이용한 니파 바이러스 검출 시스템의 검출한계 분석
주형의 농도
(copies/㎕)		 니파 바이러스
(Ct값)
1.0×106 18.7
1.0×105 21.9
1.0×104 25.2
1.0×103 28.5
1.0×102 31.5
1.0×101 35.8
1.0×100 nd
그 결과, 도 3 및 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 니파 바이러스 M 유전자의 RNA를 1.0×101 copies/㎕ 까지 희석하는 경우에도 이를 검출할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 분석적 민감도가 우수함을 알 수 있었다.
<실시예 4> 니파 바이러스 검출을 목적으로 하는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 분석적 특이도 확인
본 발명의 프라이머 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 분석적 특이도의 우수성을 확인하고자, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 중합효소연쇄반응의 분석적 특이도를 니파 바이러스의 RNA 시료, 27종의 병원성 박테리아 및 사람을 포함한 동물 10종의 gDNA(genomic DNA) 시료(표 9)에 대한 검출 여부로 확인하였다. 니파 바이러스의 RNA 시료는 표적 증폭산물(target amplicon) 전체를 올리고(oligo) 합성한 후 이를 주형으로 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통해 확보하였다. 병원성 박테리아는 ATCC 또는 KCTC를 통해 구매하였고, 동물 10종의 gDNA는 해당 동물의 육류를 확보한 후 DNA를 추출하였다(human의 경우 Human Genomic DNA(G1521, Promega)를 구입하여 사용함).
구체적으로, 하기 표 9에 기재된 시료를 주형으로 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 기술을 이용한 니파 바이러스 검출 시스템의 분석적 특이도
번호 이름 참고 니파 바이러스
1 nipah virus in vitro transcribed RNA +
2 Hendra virus in vitro transcribed RNA -
3 Campylobacter jejuni subsp.jejuni ATCC 33560 -
4 Campylobacter coli ATCC 33559 -
5 Salmonella typhimurium ATCC 29629 -
6 Salmonella typhi NCCP 12241 -
7 Salmonella enterica subsp.enterica ATCC 14028 -
8 Shigella flexneri KCTC 2517 -
9 Shigella boydii KCTC 22528 -
10 Shigella sonnei KCTC 22530 -
11 Vibrio vunificus KCTC 2982 -
12 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 -
13 Yersinia enterocolitica KCCM 41657 -
14 E.coli O157 NCCP 11090 -
15 Staphylococcus aureus ATCC 10832 -
16 Listeria monocytogenes ATCC 19113 -
17 Listeria innocua KCTC 3586 -
18 Bacillus cereus ATCC 21366 -
19 Bacillus subtilis KCTC 2213 -
20 Bacillus thuringiensis KCTC1108 -
21 Clostridium perfringens ATCC 12916 -
22 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 -
23 Legionella pneumophila subsp. pneumophila KCTC 12009 -
24 Porcine genomic DNA -
25 Bovine genomic DNA -
26 Sheep genomic DNA -
27 Horse genomic DNA -
28 Goat genomic DNA -
29 Chicken genomic DNA -
30 Duck genomic DNA -
31 Donkey genomic DNA -
32 Thurkey genomic DNA -
33 Human genomic DNA -
34 Dengue 1 virus MBC055 -
35 Dengue 2 virus MBC056 -
36 Dengue 3 virus MBC057 -
37 Dengue 4 virus MBC058 -
38 Chikungunya virus MBC099 -
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에 의하여 표 9의 니파 바이러스는 모두 검출되었으나, 표 9의 병원성 박테리아 및 건강한 동물 시료에서는 증폭 반응이 검출되지 않았다. 이는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 니파 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 제시한다.
<110> KOGENEBIOTECH <120> PRIMERS AND PROBES FOR DETECTION OF NIPAH VIRUS AND DETECTING METHOD FOR NIPAH VIRUS USING THE SAME <130> 2020P-02-028 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nipah-M-F <400> 1 aggacaattg ctgcctaccc t 21 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nipah-M-R <400> 2 attttctcag ttgatccagc tgttct 26 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nipah-M-Probe <400> 3 actttgaggg aacagagttc ctccagaaga tc 32

Claims (17)

  1. 서열번호 1 및 2로 각각 기재되는 모든 염기서열을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 서열번호 3으로 각각 기재되는 염기서열을 포함하며 니파 바이러스의 M 유전자 영역을 표적으로 하는 프로브 세트를 포함하는 니파 바이러스 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 프라이머 세트는 니파 바이러스의 M 유전자 영역을 표적으로 하는, 니파 바이러스 검출용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는 니파 바이러스 검출용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는 니파 바이러스 검출용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 리포터가 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 니파 바이러스 검출용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 소광자가 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 니파 바이러스 검출용 조성물.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물의 검출한계는 100 내지 101 copies/㎕ 인 것을 특징으로 하는, 니파 바이러스 검출용 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 역전사 중합효소, DNA 중합효소, 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는, 니파 바이러스 검출용 조성물.
  12. 제1항의 조성물을 포함하는 니파 바이러스 검출용 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 검체를 주형으로 제1항의 프라이머 세트 및 제1항의 프로브 세트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 것을 포함하는 니파 바이러스를 검출할 수 있는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104774972A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 尼帕病毒m基因的荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途

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CN104774972A (zh) * 2015-04-21 2015-07-15 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 尼帕病毒m基因的荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途

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