KR102189576B1

KR102189576B1 - 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법

Info

Publication number: KR102189576B1
Application number: KR1020190178580A
Authority: KR
Inventors: 이주연; 이원자; 류정상; 최우영; 양정선; 임희영; 김성우; 유창훈; 유채화; 허민경
Original assignee: 대한민국(질병관리청장); 주식회사 미코바이오메드
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-12-11
Also published as: KR20200056346A

Abstract

본 발명은 에볼라 바이러스(Ebola virus)의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 에볼라 바이러스의 3종 아형(분디부교형, 수단형 및 자이르형)을 특이적으로 동시에 검출할 수 있고, 민감도 및 보관 안정성이 우수하며, 이를 이용한 실시간 RT-PCR 수행 시 재현성 있는 결과를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 에볼라 바이러스의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법{Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Ebola virus and detecting method for ebola virus using the same}

본 발명은 에볼라 바이러스(Ebola virus)의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.

에볼라 바이러스는 필로바이러스과(Filoviridae) 에볼라바이러스속(ebolavirus)에 속하는 중증 출혈열 바이러스로, 긴막대기형, 고리형, 원형 등의 다양한 형태로 존재하는 단일가닥의 음성 RNA 바이러스이며, 뉴클레오캡시드에 바이러스성 RNA가 핵 단백질(Nucleoprotein, NP), VP(virion protein)35, VP30 및 L(RNA-의존성 RNA 중합효소)을 포함하고 있다. 에볼라 바이러스는 유전체 염기서열의 계통분류학적 유사성에 따라 자이르형(Zaire), 수단형(Sudan), 레스턴형(Reston), 코트디브아르형(Cote d'Ivoire 또는 Tai Forest) 및 분디부교형(Bundibugyo)의 5가지 아형으로 분류되고 있다(M. Coeijenbier et al., The Netherlands Journal of Medicine, 72(9):442-448, 2014). 이 중 자이르형, 수단형 및 분디부교형 에볼라 바이러스는 아프리카 지역에서 출혈열을 일으켰으며, 병원성이 강해 치사율이 25 내지 90%로 매우 높은 반면, 코트디브아르형 및 레스턴형 에볼라 바이러스는 사람에게 감염을 일으킨 예는 있지만, 사망한 사례는 현재까지 보고된 바가 없다.

에볼라 바이러스는 주로 바이러스에 감염된 사람의 혈액 또는 분비물의 직접적인 접촉이나 바이러스를 포함한 분비물에 오염되어 있는 기구를 통한 간접적인 접촉으로 인해 전파되므로 병원 내 감염이 흔히 발생한다. 최근에는 에볼라 바이러스가 직접적인 접촉 없이도 다른 종 간에 공기를 통해 전염될 수도 있는 것으로 보고되고 있다. 에볼라 바이러스의 초기 증상은 비특이적이나, 발열, 식욕부진, 무력감 또는 허약감이 가장 일반적이고, 갑작스러운 고열, 전신 쇠약감, 근육통, 두통 또는 인후통 등 비전형적인 증상 이후에 오심, 구토, 설사 또는 발진이 동반되고 체내외 출혈이 나타날 수 있다.

에볼라 바이러스는 현재까지 효과적인 백신 및 치료법이 없고 치사율이 매우 높으므로, 바이러스 발생 시 급속한 확산의 방지 및 효율적인 검역 및 방역을 위해 에볼라 바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 현장진단(Point of care technology, POCT) 검사법의 개발이 요구되고 있다.

현장진단은 체외진단 중 하나로, 피검자 및 환자와 가까운 위치에서 원심분리 등 샘플 사전가공을 거치지 않고, 신속하게 시행해 진료 및 치료에 활용할 수 있는 임상병리 검사방식을 말한다. 최근까지는 개인의 자가혈당측정 용도로 많이 사용되어 왔지만 수년 전부터 점차 다양한 질환의 진단 목적으로 사용 및 개발되고 있고, 서유럽에서 다른 진단 제품들이 가지고 있는 비용문제, 규제문제를 해결할 수 있는 분야로 각광받고 있으며, 저비용의 장점으로 개발도상국가에서도 수요가 증가하고 있다.

본 발명의 목적은 에볼라 바이러스(Ebola virus)의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 에볼라 바이러스의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 에볼라 바이러스의 3종 아형(분디부교형, 수단형 및 자이르형)을 특이적으로 동시에 검출할 수 있고, 민감도 및 보관 안정성이 우수하며, 이를 이용한 실시간 RT-PCR 수행 시 재현성 있는 결과를 얻을 수 있으므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 에볼라 바이러스의 검출 및 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 3종(분디부교형, 수단형 및 자이르형) 에볼라 바이러스를 모두 검출할 수 있음을 확인한 유전자 정렬(alignment) 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 최소검출한계를 분석한 실시간 RT-PCR 결과 그래프이(녹색: 내부양성대조물질; 빨간색: 에볼라 바이러스 시료; 및 파란색: 음성 대조군).
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 간섭반응 여부를 확인한 실시간 RT-PCR 결과 그래프이다(녹색: 내부양성대조물질; 빨간색: 간섭물질이 첨가되거나 첨가되지 않은 에볼라 바이러스 시료; 및 파란색: 음성 대조군).
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 검출 재현성을 측정한 실시간 RT-PCR 결과 그래프이다(녹색: 내부양성대조물질; 빨간색: 에볼라 바이러스 시료; 및 파란색: 음성 대조군).
도 5는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 가속노화실험을 통하여 보관 안정성을 분석한 실시간 RT-PCR 결과 그래프이다(녹색: 내부양성대조물질; 빨간색: 에볼라 바이러스 시료; 및 파란색: 음성 대조군).

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머; 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머; 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머; 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.

상기 에볼라 바이러스의 아형은 분디부교형, 수단형 및 자이르형일 수 있다.

상기 프라이머 세트는 에볼라 바이러스의 아형인 분디부교형, 수단형 및 자이르형의 핵 단백질 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 핵 단백질 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.

상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 에볼라 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.

상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 에볼라 바이러스의 아형인 분디부교형, 수단형 및 자이르형의 핵 단백질 영역을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트는 상기 핵 단백질 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머 쌍일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 것일 수 있다.

상기 조성물은 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 에볼라 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM일 수 있다.

상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ1일 수 있다.

상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머, 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 제작하고(표 1, 표 2 및 도 1 참조), 이를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time reverse transcrption-polymerase chain reaction, 실시간 RT-PCR)의 민감도를 분석한 결과, 최소검출한계가 23.76 copies/reaction임을 확인하였다(표 3, 표 4 및 도 2 참조). 또한, 상기 프라이머 및 프로브가 에볼라 바이러스만을 특이적으로 검출하고, 간섭물질에 대한 간섭반응이 없음을 확인하였다(표 5 내지 7, 및 도 3 참조). 아울러, 상기 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR의 재현성이 있음을 확인하였고(표 8 및 도 4 참조), 상기 프라이머 및 프로브가 12개월 동안 안정성이 유지됨을 확인하였다(표 9 및 도 5 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 포함하는 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머로 이루어진 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 5의 염기서열로 기재되는 프로브 및 서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.

상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 에볼라 바이러스의 아형인 분디부교형, 수단형 및 자이르형의 핵 단백질 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.

상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

에볼라 바이러스의 핵 단백질 유전자를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 제작

현재까지 출현한 에볼라 바이러스 균주(strain)를 조사하여 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 각 균주의 염기서열을 수집하였다(표 1). 수집된 염기서열을 이용하여 유전자를 정렬(alignment)하였고, 각 균주의 핵 단백질 부위를 표적 유전자로 하여 3종(분디부교형, 수단형 및 자이르형) 에볼라 바이러스를 한번에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다(표 2 및 도 1). 프로브의 5' 말단에는 리포터로 FAM을 결합시켰고, 3' 말단에는 소광자로 BHQ1을 결합시켰다.

분류	번호	균주명	분류	번호	균주명
분디부교형 에볼라 바이러스	1	UGA/2007	자이르형 에볼라 바이러스	11	CHE/2014/Makona-GE1
	2	EboBund-14 2012		12	COD/2014/Lomela-Lokolia19
	3	EboBund-112 2012		13	COD/2014/Lomela-Lokolia16
	4	EboBund-120 2012		14	LBR/2014/Makona-L2014_ZsG
	5	EboBund-122 2012		15	LBR/2014/Makona-L2014
수단형 에볼라 바이러스	1	SSD/1976/Nzara-Boneface		16	MLI/2014/Makona-Mali-DPR4
	2	SSD/1979/Maleo		17	MLI/2014/Makona-Mali-DPR1
	3	UGA/2000/Gulu-808892		18	SLE/2014/Makona-G3707
	4	SDN/2000/Gulu-200011676		19	SLE/2014/Makona-NM042.1
	5	EBOV-S-2004		20	SLE/2014/Makona-G3845
	6	EboSud-682 2012		21	SLE/2014/Makona-G3819
	7	EboSud-609 2012		22	SLE/2014/Makona-G3764
	8	EboSud-603 2012		23	SLE/2014/Makona-EM113
	9	EboSud-602 2012		24	USA/2014/Makona-201403305
자이르형 에볼라 바이러스	1	OD/1976/Yambuku-Mayinga -eGFP-LLOV_GP		25	USA/2014/Makona-201403293
	2	COD/1976/Yambuku-Ecran		26	DML24854/SLe/Kono/20150206
	3	COD/1976/Yambuku-Mayinga		27	DML25103/SLe/Kono/20150219
	4	GAB/1996/1Ikot		28	DML12268/SLe/WesternUrban/ 20150310
	5	COD/1995/Kikwit-9510622		29	DML12116/SLe/WesternUrban/ 20150226
	6	COD/1995/Kikwit-9510632		30	GBR/2015/Makona-UK3
	7	COD/1995/Kikwit-9510627		31	LBR/2015/Makona-Liberia -DQE6
	8	COD/1995/Kikwit-9510631		32	LBR/2015/Makona-Liberia -DQE5
	9	GAB/1996/1Oba		33	LBR/2015/Makona-Liberia -DQE3
	10	GAB/1996/1Eko

프라이머 또는 프로브^a	서열(5'→3')	서열번호	길이 (bp)	GC함량 (%)	Tm^b (℃)	증폭산물 크기
ZSBEOV-S2-F1(+)^c	GTGCACCGTCTGGATGAA	1	18	55	61	110bp
ZSBEOV-S2-F2(+)	GTCAAGCGCCTKGAGGAA	2	18	55	61
ZSBEOV-S2-R1(-)^c	AATTGTCCAGCATTTGCTTC	3	20	40	59
ZSBEOV-S2-R2(-)	AACTGACCRGCATTAGCTTC	4	20	40	59
ZSBEOV-S2-P1(-)	TCCGGCATGGCAGCAAGTGTTCTC	5	24	58	71
ZSBEOV-S2-P2(-)	TCRGGCATWGCAGCCAATGTTCTC	6	24	58	71

^aF: 정방향(forward) 프라이머R: 역방향(reverse) 프라이머

P: 프로브

^b융해온도(melting temperature)

^c(+): 표적 서열에 5'에서 3' 방향으로 붙음

(-): 표적 서열에 3'에서 5' 방향으로 붙음

실험예 1. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 민감도 확인

상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR 방법의 분석적 민감도를 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 측정하여 확인하였다. 최소검출한계는 식품의약품안전처의 <체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인>에서 제시한 정의대로 '표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도'로 계산하였다.

구체적으로, 표 1에 기재된 3종 에볼라 바이러스 균주들의 공통되는 유전자 서열 부위에 따라 에볼라 바이러스 RNA를 합성하고, 합성된 RNA를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다(UltraFast LabChip real-time PCR G2-4). RT-PCR 반응은 2×마스터 믹스(Master mix), 프라이머 및 프로브 혼합액, 및 내부양성대조물질(internal positive control, IPC)을 각각 5, 1 및 1 ㎕씩 혼합하고, RNA 시료 3 ㎕를 추가하여 총 10 ㎕의 혼합 용액을 만든 후, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 수행하였다. 동일한 조건으로 30회 반복실험을 수행하여 Ct(cycle threshold)값 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다.

온도(℃)	시간	사이클 수
50	5분	1
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95	13초	45
54	13초	45
총 소요시간	34분 40초^*

^*기계 상에서 결과값을 읽는 시간까지 포함된 총 소요시간

분석 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 23.76 copies/reaction의 최소검출한계를 나타냈다(표 4 및 도 2).

농도 (copies/ reaction)	에볼라 바이러스				IPC^b
	Ct값			검출률(%)	Ct값
	평균	표준편차	변동계수^a (%)	검출률(%)	평균	표준편차	변동계수 (%)
300	30.74	0.88	2.86	100	20.27	0.36	1.76
150	31.44	0.90	2.85	100	20.44	0.35	1.70
75	32.14	0.99	3.07	100	20.63	0.38	1.82
37.5	33.38	0.93	2.78	100	20.71	0.47	2.29
18.75	34.24	1.03	3.00	87	20.29	0.36	1.76
9.375	33.93	1.47	4.34	77	20.45	0.37	1.82

^aCV(coefficient of variation): 평균 대비 표준편차의 비율^bIPC: 내부양성대조물질로, PCR 반응이 제대로 수행되었는지를 확인하는 용도

실험예 2. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 특이도 확인

상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR 방법의 분석적 특이도를 다른 균주에 대한 교차반응 여부 및 간섭반응 여부로 확인하였다.

2-1. 교차반응 여부 확인

총 88주의 병원체 유전자(표 5 및 6에서 '굵게' 표시) 및 질병관리본부에서 제공받은 전사체(transcript)(표 5 및 6에서 '밑줄'로 표시)를 사용하여 교차반응 여부를 확인하였다. 사용한 균주들 중 바이러스는 10⁴ copies/㎕의 농도로 적용하였고, 나머지 균주들은 1 ng/㎕의 농도로 적용하였다. 에볼라 바이러스 유전자 대신 동량의 상기 병원체 유전자 및 전사체를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.

번호	균주명	번호	균주명
1	Acinetobacter baumanii	23	Enterococcus faecalis
2	Aeromonas hydrophila	24	Escherichia hermannii
3	Bacillus cereus	25	EHEC
4	Bacillus subtilis	26	Francisella philomiragia
5	Brucella abortus	27	Francisella tularensis subsp. Holartica
6	Brucella melitensis	28	Klebsiella pneumoniae
7	Brucella suis	29	Listeria monocytogenes
8	Brucella canis	30	Micrococcus luteus
9	Burkholderia cepacia	31	Proteus vulgaris
10	Candida albicans	32	Pseudomonas aeruginosa
11	Candida tropicalis	33	Plasmodium falciparum
12	Candida glabrata	34	Rhodococcus equi
13	Citrobacter freundii	35	Ricinis communis
14	Clostridium botulinum A	36	Rickettsia powazekii
15	Clostridium botulinum B	37	Rickettsia typhi
16	Clostridium botulinum E	38	Rickettsia japonica
17	Clostridium botulinum F	39	Salmonella typhi
18	Clostridium difficile	40	Salmonella paratyphi
19	Clostridium perfringens	41	Salmonella enteritidis
20	Coxiella burnetii	42	Salmonella enterica
21	Enterobacter aerogenes	43	Stapylococcus aureus
22	Enterobacter cloacae	44	Stapylococcus epidermidis

번호	균주명	번호	균주명
45	Streptococcus pneumoniae	67	Coronavirus Mers
46	Streptococcus pyogenes	68	Dengue virus type1
47	Yersinia enterocolitica	69	Dengue virus type2
48	Yersinia pseudotuberculosis	70	Dengue virus type3
49	Human gDNA	71	Dengue virus type4
50	Aspergillus fumigatus	72	Hantaan virus
51	Aspergillus oryzae	73	Influenza virus A. H1
52	Aspergillus terreus	74	Influenza virus B
53	Bordetella pertussis	75	Influenza A virus subtype H3
54	Campylobacter jejuni	76	Japanese encephalitis virus
55	Campylobacter coli	77	Para influenza virus 1
56	Haemophilus influenzae	78	Para influenza virus 2
57	Pseudomonas aeruginosa	79	Para influenza virus 3
58	Shigella spp.	80	Para influenza virus 4
59	Vibrio parahaemolyticus	81	Respiratory syncytial virus A
60	Legionella pneumophila	82	Respiratory syncytial virus B
61	E. coli KCTC2441	83	Rhinovirus
62	Mycoplasma pneumoniae	84	SARS
63	Adenovirus C-2	85	Seoul virus
64	Adenovirus B-3	86	TBEV
65	Coronavirus 229E	87	West nile virus
66	Coronavirus NL63	88	Yellow fever virus

그 결과, 상기 병원체 유전자 및 전사체에서는 RT-PCR 증폭이 나타나지 않았으며, 이는 대조 병원체에서 교차반응이 나타나지 않음을 제시한다.

2-2. 간섭반응 여부 확인

검체 내에 포함되어 실험적으로 영향을 미칠 수 있는 간섭반응 여부를 확인하기 위하여, <CLSI 가이드라인>의 'EP7-A2'를 참고하여 선정한 5종의 간섭물질을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, 간섭물질을 포함하지 않은 에볼라 바이러스 유전자와, 1 mg/㎖의 헤모글로빈(hemoglobin), 12.5 ㎍/㎖의 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 0.1 mg/㎖의 헤파린(heparin), 4 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 20 mM의 시트르산나트륨(Na-citrate)이 첨가된 에볼라 바이러스 유전자를 상기 실험예 1에서 도출한 최소검출한계(23.76 copies/reaction)의 25배 또는 100배의 농도로 준비하였다. 상기 시료들을 이용하여 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 각 시료의 Ct값을 측정하여 간섭물질이 첨가되지 않은 대조군에 대한 Ct값의 차이를 계산하여 비교하였다.

	100×(2376 copies/reaction)		25×(594 copies/reaction)
	Ct값	대조군과의 Ct값 차이	Ct값	대조군과의 Ct값 차이
대조군^a	25.72	-	28.67	-
헤모글로빈	26.08	-0.36	29.51	-0.84
IgG	26.2	-0.48	28.07	0.6
헤파린	25.59	0.13	27.85	0.82
EDTA	25.97	-0.25	29.12	-0.45
시트르산나트륨	26.08	-0.36	28.54	0.13

^a간섭물질이 첨가되지 않은 에볼라 바이러스 유전자 시료

그 결과, 실험에 사용한 5종의 간섭물질 첨가 여부에 따른 Ct값의 차이는 1 사이클 미만으로 나타났으며, 이는 간섭반응이 없는 것으로 해석된다(표 7 및 도 3).

실험예 3. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 재현성 확인

상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR 방법의 분석적 재현성을 반복실험을 통해 확인하였다.

구체적으로, 에볼라 바이러스 유전자를 상기 실험예 1에서 도출한 최소검출한계(23.76 copies/reaction)의 5배, 25배 또는 100배의 농도로 반응시킨 것을 제외하고는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 5일 동안 1일 2회씩 총 10번의 반복실험을 수행하였으며, 각 회당 2회씩 측정하였고, 측정한 Ct값의 평균, 표준편차 및 변동계수를 계산하여 비교하였다.

		100×(2376 copies/reaction)		25×(594 copies/reaction)		5×(118.8 copies/reaction)
1일	1차	25.07	25.35	27.27	27.24	29.53	28.57
1일	2차	25.17	24.90	27.47	27.30	30.04	30.09
2일	1차	24.93	24.83	27.40	27.22	29.63	29.36
2일	2차	24.51	24.53	27.36	27.17	29.63	29.13
3일	1차	26.67	26.97	28.97	28.95	31.46	31.43
3일	2차	25.78	26.13	28.06	28.33	30.71	30.46
4일	1차	25.07	25.35	27.27	27.24	29.53	28.57
4일	2차	25.71	25.88	27.85	28.26	30.25	30.48
5일	1차	25.42	25.44	28.24	27.90	30.35	29.60
5일	2차	25.81	25.61	28.12	28.37	30.39	30.49
평균		25.46		27.80		29.99
표준편차		0.64		0.59		0.79
변동계수^a (%)		0.03		0.02		0.03

^aCV(coefficient of variation): 평균 대비 표준편차의 비율

그 결과, 에볼라 바이러스의 합성 RNA를 포함하지 않은 음성 대조군(negative control, NC) 시료의 경우 반복실험 모두에서 전혀 검출되지 않았으며, 10번의 반복실험 결과의 변동계수가 0.02 내지 0.03%로 나타나, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR 방법의 재현성이 있음을 확인하였다(표 8 및 도 4).

실험예 4. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 분석적 보관안정성 확인

상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트의 분석적 보관안정성을 <식품의약품안전처 고시 제2014-178호>에 제시된 의료기기의 안정성 시험기준에 따른 가속노화실험을 통하여 조사하였다.

구체적으로, 하기 계산식 1을 이용하여 가속노화계수(AAF)를 산출하고, 계산식 2를 이용하여 가속노화시간(AAT)을 산출하였다.

[계산식 1]

AAF = Q₁₀ ^{｜(TAA-TRT)/10｜}

Q₁₀: 온도 10℃ 상승 또는 감소 시 노화계수, 2

TAA: 가속노화온도, 45℃

TRT: 제품 보관온도, -20℃

[계산식 2]

AAT = 설정된 유효기간 / AAF

설정된 유효기간: 365일

AAF: 90.51 (계산식 1로부터 도출된 가속노화계수)

산출된 조건에 따라 4일간 45℃에서 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 보관하고, 0, 1, 2, 3 및 4일째에 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 측정된 Ct값을 하기 표 9에 나타냈다.

농도 (copies/reaction)		PC^b	2376 (100×)	594 (25×)	118.8 (5×)
0일 (대조군)	1	21.48	27.69	29.72	31.73
	2	21.51	27.85	29.9	31.05
	평균	21.50	27.77	29.81	31.39
1일 (3개월)^a	1	21.95	26.95	28.77	31.23
	2	22.01	26.90	28.84	30.76
	평균	21.98	26.93	28.81	31.00
	대조군과의 Ct값 차이	-0.48	0.85	1.01	0.40
2일 (6개월)^a	1	22.2	28.44	30.48	32.36
	2	21.83	28.11	30.29	33.29
	평균	22.02	28.28	30.39	32.83
	대조군과의 Ct값 차이	-0.52	-0.50	-0.57	-1.44
3일 (9개월)^a	1	21.69	26.36	28.28	30.28
	2	21.56	26.29	28.27	30.25
	평균	21.63	26.33	28.28	30.27
	대조군과의 Ct값 차이	-0.13	1.45	1.54	1.13
4일 (12개월)^a	1	21.15	26.77	29.22	31.61
	2	21.19	26.77	28.89	31.35
	평균	21.17	26.77	29.06	31.48
	대조군과의 Ct값 차이	0.32	1.00	0.75	-0.09

^a각 가속노화기간에 대응되는 실제 기간^bPC: 양성 대조군(positive control)으로, 에볼라 바이러스의 특정 서열로 이루어진 플라스미드 DNA

그 결과, 음성 대조군 시료의 경우 전혀 검출되지 않았으며, 양성 대조군 시료의 안정성은 0일차 대조군에 비하여 Ct값 차이가 ± 0.6 범위 내로 나타났고, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 경우 0일차 대조군에 비하여 Ct값 차이가 ± 1.6 범위 내로 나타났다. 통상적으로 대조군과의 Ct값 차이가 ± 2.0 범위 내에 있는 경우 안정한 것으로 판단하므로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 12개월의 안정성을 갖는 것으로 판단된다(표 9 및 도 5).

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention MiCo Bio Med Co., Ltd. <120> Primers and probes for simultaneous detection of subtypes of Ebola virus and detecting method for ebola virus using the same <130> 2018P-07-003 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-F1(+) <400> 1 gtgcaccgtc tggatgaa 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-F2(+) <400> 2 gtcaagcgcc tkgaggaa 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-R1(-) <400> 3 aattgtccag catttgcttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-R2(-) <400> 4 aactgaccrg cattagcttc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-P1(-) <400> 5 tccggcatgg cagcaagtgt tctc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZSBEOV-S2-P2(-) <400> 6 tcrggcatwg cagccaatgt tctc 24

Claims

서열번호 1의 염기서열로 기재되는 제1 정방향 프라이머;
서열번호 2의 염기서열로 기재되는 제2 정방향 프라이머;
서열번호 3의 염기서열로 기재되는 제1 역방향 프라이머;
서열번호 4의 염기서열로 기재되는 제2 역방향 프라이머;
서열번호 5의 염기서열로 기재되는 프로브; 및
서열번호 6의 염기서열로 기재되는 프로브로 이루어진 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 접합된 것인, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자가 추가로 접합된 것인, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트.
삭제
1) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제1항의 조성물을 이용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 증폭 산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계; 를 포함하는 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
삭제
제9항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득 되는, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
제9항에 있어서, 상기 에볼라 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법은 20 내지 30 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내는 것인, 에볼라 바이러스의 분디부교형(Bundibugyo), 수단형(Sudan) 및 자이르형(zaire) 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.