KR102149367B1 - 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법 - Google Patents

크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 크리미언콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 7종 아형을 특이적으로 동시에 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법{PRIMERS AND PROBES FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF SUBTYPES OF CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS AND DETECTING METHOD FOR CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS USING THE SAME}
본 발명은 크리미언콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
크리미언콩고 출혈열 바이러스는 버냐바이러스과(Bunyaviridae), 나이로바이러스속(Nairovirus)에 속하는 출혈열 바이러스로, 단일가닥의 음성 RNA 바이러스이며, 직경은 85~105 nm이고, 5~7 nm의 지질 이중막으로 된 외피(envelop)를 가진다. 크리미언콩고 출혈열 바이러스는 1944년 크리미아에서 첫 발생이 보고된 이후, 1969년에 콩고에서 발생이 보고되었으며, 주로 아프리카, 발칸 지역, 중동, 아시아 지역 등에서 발생하고 있다. 크리미언콩고 출혈열 바이러스는 최초로 발생하여 전염된 지역에 따라 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 7가지 아형으로 분류되나, 현재는 하나 이상의 아형이 다수의 지역에서 보고되고 있다.
크리미언콩고 출혈열 바이러스는 바이러스에 감염된 진드기에 물려 전파되거나, 감염된 환자의 혈액 및 분비물, 감염된 동물의 도살 과정 중 발생한 감염성 물질, 또는 감염된 설치류의 배설물에 대한 피부접촉이나 공기접촉으로 전파된다. 크리미언콩고 출혈열 바이러스에 감염되면 감염 초기에는 갑작스런 발열, 오한, 두통, 손발과 허리의 심한 통증, 구토, 복통, 설사 등이 나타나며, 약 4일 후에는 안구, 잇몸, 코, 폐, 자궁, 장 등에서 출혈이 나타난다. 크리미언콩고 출혈열 바이러스에 감염된 환자는 일반적으로 출혈, 신경계 합병증, 폐출혈 등으로 인한 쇼크로 사망하며 치사율은 30~50%이고, 생존자는 감염 15~20일 후 회복되나 쇠약, 약한 맥박, 탈모, 다발성 신경염, 발한, 두통, 현기증, 메스꺼움, 식욕저하, 시력저하, 청력저하, 기억력 저하 등의 후유증이 나타나기도 한다.
크리미언콩고 출혈열 바이러스는 혈소판, 신선동결혈장(fresh frozen plasma), 알부민, 응고인자(coagulation factor), 리바비린(ribavirin), 회복기 환자의 혈장(convalescent plasma) 등으로 치료하고 있으나, 현재까지 안전하고 효과적인 백신이 없다. 이러한 고위험 바이러스가 생물테러로 사용될 경우 진단과 치료에 있어 치명적이며, 확산을 방지하기 어려워 국민보건에 심각한 영향을 끼칠 우려가 있어 이에 대한 대응책 마련이 시급하다. 그러나 생물테러 사건현장에서 주로 이용되는 면역크로마토그래피 시험법으로는 검출 가능한 생물작용제가 한정되어 있어 검출 가능한 생물작용제의 확대가 요구되고 있다. 또한 면역크로마토그래피 시험법의 경우, 민감도 개선 필요성이 제기됨에 따라 이를 보완할 수 있는 실시간 유전자중폭장비(real-time PCR)기기에서 운용될 수 있는 현장진단(Point of Care Testing, POCT) 검사법의 도입이 요구되고 있다.
현장진단은 체외진단 중 하나로, 피검자 및 환자와 가까운 위치에서 원심분리 등 샘플 사전가공을 거치지 않고, 신속하게 시행해 진료 및 치료에 활용할 수 있는 임상병리 검사방식이다. 최근까지는 개인의 자가혈당측정 용도로 많이 사용되었으나 수년 전부터 점차 다양한 질환의 진단 목적으로 사용 및 개발되고 있고, 서유럽에서 다른 진단 제품들이 가지고 있는 비용문제, 규제문제를 해결할 수 있는 분야로 각광받고 있으며, 저비용의 장점으로 개발도상국가에서도 수요가 증가하고 있다.
Hoogstraal H., 1979, Journal of Medical Entomology, 15(4): 307-417
본 발명의 목적은 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3를 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 7종 아형(Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3)을 특이적으로 동시에 검출할 수 있고, 민감도가 우수하므로, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 제작하기 위해 수집한 크리미언콩고 출혈열 바이러스 균주(strain)의 염기서열을 정렬(alignment)한 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 검출한계를 확인한 도이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 크리미언콩고 출혈열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 3은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 간섭물질에 의한 간섭반응 여부를 확인한 도이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 간섭물질이 첨가되거나 첨가되지 않은 크리미언콩고 출혈열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 4는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 검출 재현성을 확인한 도이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 크리미언콩고 출혈열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
도 5는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 보관 안정성을 확인한 도이다
(녹색: 내부 양성 대조군(ITC); 빨간색: 크리미언콩고 출혈열 바이러스 시료; 파란선: 음성 대조군).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3일 수 있다.
상기 프라이머는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 보다 구체적으로는 S분절 유전자 단편을 특이적으로 증폭하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개, 구체적으로는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 크리미언콩고 출혈열 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
상기 프라이머는 현장진단(Point of Care Testing, POCT)을 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물을 제공한다.
상기 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
상기 조성물은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 크리미언콩고 출혈열 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein)일 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA, BHQ(black hole quencher) 1, BHQ2, BHQ3, NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(deep dark quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 소광자는 BHQ(black hole quencher) 1일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 및 프로브 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E.coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 제작하고(표 1 및 2, 도 1 참조), 이를 이용하여 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time reverse transcrption-polymerase chain reaction, 실시간 RT-PCR)을 수행시 최소검출한계가 21.37 copies/reaction이고(표 3 및 4, 도 2 참조), 크리미언콩고 출혈열 바이러스만이 특이적으로 검출되며(표 5 및 6 참조), 간섭물질에 의한 간섭반응이 없고(표 7, 도 3 참조), 재현성이 있음을(표 8, 도 4 참조) 확인하였다. 아울러, 상기 프라이머 및 프로브 세트가 365일 동안 안정성이 유지됨을 확인하였다(표 9, 도 5 참조).
따라서, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브는 크리미언콩고 출혈열 바이러스를 검출 및 진단하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트를 제공한다.
상기 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3일 수 있다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가, 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합된 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 특정 영역에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase 억제제, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법을 제공한다.
상기 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3일 수 있다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형인 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있고, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 또는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 S 분절(S segment) 유전자를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 제작
현재까지 출현한 크리미언콩고 출혈열 바이러스 균주(strain)를 조사하여 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 각 균주의 염기서열을 수집하였다(표 1). 수집된 염기서열을 정렬(alignment)한 뒤 각 균주의 S 분절 유전자 부위를 표적으로 7종(Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3)의 크리미언콩고 출혈열 바이러스 아형을 한번에 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였으며, 각 프라이머 및 프로브의 서열은 하기 표 2와 같다. 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)를 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher) 1을 결합시켰다.
균주명(strain) 발생지역 년도 바이러스원(source)
UG3010 DRC 1956 사람
Semunya Uganda 1958 사람
Drosdov Russia 1967 사람
Kashmanov Russia 1967 사람
Matin Pakistan 1976 사람
Baghdad-12 Iraq 1979 사람
SPU4/81 South Africa 1981 사람
SPU415/85 South Africa 1985 사람
SPU97/85 South Africa 1985 사람
SPU103/87 South Africa 1987 사람
TADJ/HU8966 Tajikistan 1990 사람
Oman Oman 1997 사람
Kosova Hoti Kosovo 2001 사람
Turkey 200310849 Turkey 2003 사람
ROS/HUVLV-100 Russia 2003 사람
Turkey-Kelkit06 Turkey 2006 사람
SudanAl-Fulah3-2008 Sudan 2008 사람
Sudan AB1-2009 Sudan 2009 사람
Afg09-2990 Afghanistan 2009 사람
NIV 112143 India 2011 사람
프라이머 또는
프로브a 		서열(5'→3') 서열번호 길이 (bp) GC함량
(%)		 Tmb
(℃)		 Notec
CCHFV-S1-F(+) GCCGTTCrGGAATAGCACTTGT 1 22 52 65 164bp
CCHFV-S1-R(-) TGTTATCATGCTGTCrGCACT 2 21 45 64
CCHFV-S1-P(-) CAACAGGCCTTGCCAAGCTTGCAGAGAC 3 28 57 76
a: F;forward, R;reverse, P;probe
b: 융해온도(melting temperature)
c: PCR 증폭산물의 크기
실험예 1. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 민감도 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 민감도를 최소검출한계(limit of detection, LoD)를 측정하여 확인하였다. 실험은 식품의약품안전처의 '체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인'에 따라 수행하였고, 최소검출한계는 가이드라인의 정의대로 '표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도'로 계산하였다.
구체적으로, 표 1에 기재된 크리미언콩고 출혈열 바이러스 균주의 공통 영역을 타겟(target)으로 설정한 후, 정제된 DNA를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription(T7))를 진행하여 RNA 유전자를 합성하였다. 300, 150, 75, 37.5, 18.75 및 9.375 copies/reaction 농도의 합성한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 RNA 유전자 3 ㎕, 2x 마스터 믹스(Master mix) 5 ㎕, 프라이머 프로브 믹스(primer probe mix) 1 ㎕ 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ㎕을 혼합한 후, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다(UltraFast LabChip real-time PCR G2-4). 동일한 조건으로 30회 반복실험을 수행하여 측정한 Ct(cycle threshold)값의 평균(average), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV), 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다.
구분 온도(℃) 시간 싸이클 수
역전사(reverse transcription) 50 5분 1
1차 변성(denaturation) 95 8초 1
2차 변성(denaturation) 95 13초 45
어닐링(annealing) 54 13초
총 소요시간 34분 40초*
(*기계 상에서 결과값을 읽는 시간까지 포함된 총 소요시간)
그 결과, 하기 표 4 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 최소검출한계는 21.37 copies/reaction으로 측정되었다.
Figure 112019135809022-pat00001
(Target: 실험예 1의 합성된 타겟 RNA 유전자; IPC: 내부 양성 대조군(internal positive control); Average: 평균; S.D.: 표준편차; CV: 평균 대비 표준편차의 비율(coefficient of variation)).
실험예 2. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 특이도 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 특이도를 다른 균주에 의한 교차반응 여부 및 간섭물질에 의한 간섭반응 여부로 확인하였다.
2-1. 다른 균주에 의한 교차반응 여부 확인
총 88주의 병원체 유전자(표 5 및 6에서 '굵게' 표시) 및 질병관리본부에서 제공받은 전사체(transcript, 표 5 및 6에서 '밑줄'로 표시)를 사용하여 다른 균주에 의한 교차반응 여부를 확인하였다. 구체적으로, 사용한 균주들 중 바이러스는 104 copies/㎕의 농도로 적용하였고, 나머지 균주들은 1 ng/㎕의 농도로 적용하였다. 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자 대신 동량의 상기 병원체 유전자 및 전사체를 사용한 것을 제외하고는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
번호 균주명 번호 균주명 Target Ct
1 Acinetobacter baumanii N/A 23 Enterococcus faecalis N/A
2 Aeromonas hydrophila N/A 24 Escherichia hermannii N/A
3 Bacillus cereus N/A 25 EHEC N/A
4 Bacillus subtilis N/A 26 Francisella philomiragia N/A
5 Brucella abortus N/A 27 Francisella tularensis subsp. Holartica N/A
6 Brucella melitensis N/A 28 Klebsiella pneumoniae N/A
7 Brucella suis N/A 29 Listeria monocytogenes N/A
8 Brucella canis N/A 30 Micrococcus luteus N/A
9 Burkholderia cepacia N/A 31 Proteus vulgaris N/A
10 Candida albicans N/A 32 Pseudomonas aeruginosa N/A
11 Candida tropicalis N/A 33 Plasmodium falciparum N/A
12 Candida glabrata N/A 34 Rhodococcus equi N/A
13 Citrobacter freundii N/A 35 Ricinis communis N/A
14 Clostridium botulinum A N/A 36 Rickettsia powazekii N/A
15 Clostridium botulinum B N/A 37 Rickettsia typhi N/A
16 Clostridium botulinum E N/A 38 Rickettsia japonica N/A
17 Clostridium botulinum F N/A 39 Salmonella typhi N/A
18 Clostridium difficile N/A 40 Salmonella paratyphi N/A
19 Clostridium perfringens N/A 41 Salmonella enteritidis N/A
20 Coxiella burnetii N/A 42 Salmonella enterica N/A
21 Enterobacter aerogenes N/A 43 Stapylococcus aureus N/A
22 Enterobacter cloacae N/A 44 Stapylococcus epidermidis N/A
번호 균주명 Target Ct 번호 균주명 Target Ct
45 Streptococcus pneumoniae N/A 67 Coronavirus Mers N/A
46 Streptococcus pyogenes N/A 68 Dengue virus type1 N/A
47 Yersinia enterocolitica N/A 69 Dengue virus type2 N/A
48 Yersinia pseudotuberculosis N/A 70 Dengue virus type3 N/A
49 Human gDNA N/A 71 Dengue virus type4 N/A
50 Aspergillus fumigatus N/A 72 Hantaan virus N/A
51 Aspergillus oryzae N/A 73 Influenza virus A. H1 N/A
52 Aspergillus terreus N/A 74 Influenza virus B N/A
53 Bordetella pertussis N/A 75 Influenza A virus subtype H3 N/A
54 Campylobacter jejuni N/A 76 Japanese encephalitis virus N/A
55 Campylobacter coli N/A 77 Para influenza virus 1 N/A
56 Haemophilus influenzae N/A 78 Para influenza virus 2 N/A
57 Pseudomonas aeruginosa N/A 79 Para influenza virus 3 N/A
58 Shigella spp. N/A 80 Para influenza virus 4 N/A
59 Vibrio parahaemolyticus N/A 81 Respiratory syncytial virus A N/A
60 Legionella pneumophila N/A 82 Respiratory syncytial virus B N/A
61 E. coli KCTC2441 N/A 83 Rhinovirus N/A
62 Mycoplasma pneumoniae N/A 84 SARS N/A
63 Adenovirus C-2 N/A 85 Seoul virus N/A
64 Adenovirus B-3 N/A 86 TBEV N/A
65 Coronavirus 229E N/A 87 West nile virus N/A
66 Coronavirus NL63 N/A 88 Yellow fever virus N/A
그 결과, 표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트는 상기 병원체 유전자 및 전사체는 증폭시키지 않았다. 이로부터, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 크리미언콩고 출혈열 바이러스 외의 다른 균주에 의해 교차반응을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
2-2. 간섭물질(inhibitor)에 대한 간섭반응 여부 확인
'CLSI 가이드라인'의 'EP7-A2'를 참고하여 선정한 5종의 간섭물질을 사용하여, 검체 내에 포함되어 실험적으로 영향을 미칠 수 있는 물질에 의한 간섭반응 여부를 확인하였다.
구체적으로, 간섭물질을 포함하지 않은 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자와, 1 mg/㎖의 헤모글로빈(hemoglobin), 12.5 ㎍/㎖의 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 0.1 mg/㎖의 헤파린(heparin), 4 mM의 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 또는 20 mM의 시트르산나트륨(Na-citrate)이 첨가된 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자를, 실험예 1에서 도출한 최소검출한계(21.37 copies/reaction)의 25배 또는 100배의 농도로 준비하고, 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 각 시료의 Ct값과 양성대조군의 Ct값의 차이를 계산하여 비교하였다.
그 결과, 하기 표 7 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 5종의 간섭물질에 따른 Ct 값의 차이는 미미하므로 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트는 5종의 간섭물질에 의해 간섭반응을 나타내지 않았다.
100×(2137 copies/reaction) 25×(534.25 copies/reaction)
Ct값 대조군과의 Ct값 차이 Ct값 대조군과의 Ct값 차이
대조군a 26.92 - 29.46 -
헤모글로빈 27.13 -0.21 30.24 -0.78
IgG 27.02 -0.1 30.16 -0.7
헤파린 27.03 -0.11 29.75 -0.29
EDTA 27.08 -0.16 30.09 -0.63
시트르산나트륨 26.20 0.12 29.26 0.2
a: 간섭물질을 포함하지 않은 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자
실험예 3. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 재현성 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR의 분석적 재현성을 반복실험을 통해 확인하였다.
구체적으로, 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자를 실험예 1에서 도출한 최소검출한계(21.37 copies/reaction)의 5배, 25배 또는 100배의 농도로 반응시킨 것을 제외하고는 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 5일 동안 1일 2회씩 총 10번의 반복실험을 수행하였으며, 각 회당 2회씩 측정하였고, 측정한 Ct값의 평균, 표준편차 및 변동계수를 계산하여 비교하였다. 음성 대조군은 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 합성 RNA를 포함하지 않은 시료이다.
그 결과, 하기 표 8 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 합성 RNA를 포함하지 않은 음성 대조군 시료의 경우 반복실험 모두에서 전혀 검출되지 않았으며, 10번의 반복실험에 따른 변동계수(CV) 값이 0.03% 이하로 나타나, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 RT-PCR은 재현성이 있었다.
농도(copies/reaction) 100×(2137) 25×(534.25) 5×(106.85)
1일 1차 28.03 28.14 30.39 30.18 32.36 32.49
2차 26.23 26.17 28.48 28.60 30.96 30.94
2일 1차 26.44 26.45 28.80 28.41 30.78 30.99
2차 26.44 26.36 28.83 28.63 30.93 31.20
3일 1차 27.01 27.18 29.22 29.53 32.66 32.06
2차 26.76 27.04 28.99 29.26 32.00 31.48
4일 1차 26.77 26.73 28.63 26.73 32.08 31.41
2차 26.82 26.75 29.12 29.07 32.38 31.56
5일 1차 26.98 27.01 29.16 28.95 31.38 31.48
2차 26.83 26.93 29.28 28.62 31.41 32.51
평균 26.85 28.94 31.65
표준편차 0.51 0.73 0.61
변동계수(%) 0.02 0.03 0.02
실험예 4. 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 분석적 보관안정성 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트의 분석적 보관안정성을 가속노화실험을 통해 평가하였다. 실험은 '식품의약품안전처 고시 제2014-178호'에 제시된 의료기기의 안정성 시험기준에 따라 수행하였다.
구체적으로, 하기 계산식을 이용하여 가속노화계수(accelerated aging factor, AAF) 및 가속노화시간(accelerated aging time, AAT)을 산출한 뒤, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 산출된 조건에 따라 45℃에서 4일 동안 보관하였다. 이후, 0, 1, 2, 3 및 4일째에 가속노화시킨 프라이머 및 프로브를 이용하여 각각 2회씩 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 사용된 크리미언콩고 출혈열 바이러스 유전자는 실험예 1에서 도출한 최소검출한계(21.37 copies/reaction)의 5배, 25배 또는 100배의 농도로, 역전사효소의 변성을 방지하기 위해 가속노화반응을 시키지 않고 첨가하였다. 각 시료의 평균 Ct값과 0일째 Ct값의 차이를 계산하여 비교하였다. 양성 대조군으로는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 특정 서열로 이루어진 플라스미드 DNA를 이용하였고, 음성 대조군으로는 크리미언콩고 출혈열 바이러스 합성 RNA가 포함되지 않은 시료를 이용하였다.
[계산식]
AAF = Q10 ｜(TAA-TRT)/10｜= 90.51
AAT = 설정된 유효기간 / AAF = 4.03
(Q10(온도 10℃ 상승 또는 감소 시 노화계수) = 2, TAA(accelerated aging temperature, 가속노화온도) = 45℃, TRT(ambient temperature, 제품 보관온도) = -20℃, 설정된 유효기간 = 365일)
그 결과, 하기 표 9 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트는 ±1 이내의 Ct 값을 나타냈으며, 통상적으로 대조군과의 Ct값 차이가 ±2범위 내에 있는 경우 안정한 것으로 판단하므로, 365일의 안정성을 보였다.
농도(copies/reaction) PC 100×(2137) 25×(534.25) 5×(106.85)
0일
(대조군)		 1차 21.06 27.49 29.75 31.90
2차 21.20 27.77 29.76 31.55
평균 21.13 27.63 29.76 31.73
1일
(3개월)a 		1차 21.26 27.16 29.63 32.47
2차 21.35 27.23 29.50 32.13
평균 21.31 27.20 29.57 32.30
대조군과의 Ct값 차이 -0.18 0.43 0.19 -0.57
2일
(6개월)a 		1차 20.96 28.10 30.24 32.07
2차 21.36 27.93 30.46 32.99
평균 21.16 28.02 30.35 32.53
대조군과의 Ct값 차이 -0.03 -0.39 -0.59 -0.81
3일
(9개월)a 		1차 20.62 27.56 29.89 32.58
2차 20.80 27.85 29.86 32.85
평균 20.71 27.71 29.88 32.72
대조군과의 Ct값 차이 0.42 -0.07 -0.12 -0.99
4일
(12개월)a 		1차 21.14 26.98 29.43 32.13
2차 21.26 26.95 28.91 32.08
평균 21.20 26.97 29.17 32.11
대조군과의 Ct값 차이 -0.07 0.66 0.59 -0.38
a: 단축된 시간으로 재현된 실제노화기간
<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention MICOBIOMED CO., LTD. <120> PRIMERS AND PROBES FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF SUBTYPES OF CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS AND DETECTING METHOD FOR CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS USING THE SAME <130> 2018P-07-005 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCHFV-S1-F(+) <400> 1 gccgttcrgg aatagcactt gt 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCHFV-S1-R(-) <400> 2 tgttatcatg ctgtcrgcac t 21 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCHFV-S1-P(-) <400> 3 caacaggcct tgccaagctt gcagagac 28

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머;
    서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머; 및
    서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 프로브로 이루어진 크리미언콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 접합된 것인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단에 소광자가 추가로 접합된 것인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물.
  7. 제1항의 조성물을 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 검출용 키트.
  9. 1) 검체로부터 핵산을 분리하는 단계;
    2) 상기 검체로부터 분리한 핵산을 주형으로 제1항의 조성물을 이용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 증폭산물을 형광측정을 통해 검출하는 단계; 를 포함하는 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아형은 Asia1, Asia2, Europe1, Europe2, Africa1, Africa2 및 Africa3인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득 되는, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법은 20 내지 30 copies/reaction의 최소검출한계를 나타내는 것인, 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출할 수 있는 방법.
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