KR102421844B1

KR102421844B1 - 신규한 사스 코로나 바이러스 2 감염 진단 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102421844B1
Application number: KR1020210049865A
Authority: KR
Inventors: 윤선우; 정대균
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2021-04-16
Filing date: 2021-04-16
Publication date: 2022-07-15

Abstract

본 발명은 신규한 사스 코로나 바이러스 2 진단 마커 및 이의 용도에 관한 것이다. 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 검출용 조성물은 membrane을 타겟으로 하여 현재 유행중인 COVID-19(SARS-CoV-2)의 신속하고 정확한 검증이 가능하다. 특히, 소량의 시료에서도 한 번의 반응으로 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스의 범용적 검출이 가능하며, 다중 프라이머 세트를 사용하지 않아 특이도와 민감도를 크게 개선하였다는 점에 우수한 효과를 가진다.

Description

신규한 사스 코로나 바이러스 2 감염 진단 마커 및 이의 용도 {Novel Marker for diagnosis of Sars coronavirus2 infection and use thereof}

본 발명은 신종 코로나 바이러스 감염증(coronavirus disease 2019, COVID-19)을 일으키는, 사스 코로나 바이러스 2 진단 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 현재 유행하고 있는 코로나 19(SARS-CoV-2) 및 이를 포함한 SARS-코로나 바이러스 및 유사 바이러스의 동시 진단이 가능한 범용 마커에 관한 것이다.

중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome; SARS), 중동 호흡기 증후군(Middle East Respiratory Syndrome; MERS) 및 코로나바이러스감염증-19(Corona Virus Disease 19; COVID-19)를 유발하는 코로나바이러스(corona virus; CoV)의 출현은 공중 보건에 심각한 위협을 미치고 있다.

사스(SARS)는 2002년 11월 중국 남부 광동성에서 발생하여 홍콩을 거쳐 세계로 확산된 전염병으로, 갑작스런 발열, 기침 및 호흡곤란이 주 증상이며, 심한 경우 폐렴으로 진행돼 죽음에 이를 수도 있는 질환이다. 전파되는 경로는 아직 완전히 밝혀지지 않았지만 대기 중에 떠다니는 고체나 액체의 미세한 입자에 의해 전파되는 것으로 추측되고 있다. 사스는 2003년 7월까지 유행하였으며, 약 7개월 동안 32개국에서 총 8,096명의 감염자가 발생하고 그 가운데 774명이 사망한 것으로 알려졌다.

메르스(MERS)는 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견되었고, 고열, 기침 및 호흡곤란 등 심한 호흡기 증상을 나타내며, 심한 경우 합병증이 동반되면서 사망에 이르기도 하는 질환이다. 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 감염될 가능성이 크고, 사람 간 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되었다. 주로 중동 지역에서 환자가 집중적으로 발생하였다가 한국에서 2015년 5월부터 2015년 12월 말까지 우리나라 전역에서 186명이 감염됐으며, 이 중 38명이 사망한 것으로 알려졌다.

코로나19는 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된, 새로운 유형의 코로나 바이러스(SARS-CoV-2)에 의한 호흡기 감염질환이다. 코로나19는 감염자의 비말이 호흡기나 눈.코.입의 점막으로 침투될 때 전염되어, 약 2~14일의 잠복기를 거친 뒤 발열 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 나오고 있다. 코로나19가 발생한 이후 전 세계에서 확진자가 속출하자 WHO는 2020년 03월 11일 홍콩독감(1968), 신종플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 코로나19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포하였으며, 현재까지 치료제가 마련되지 못해 매일 전 세계에서 엄청난 수의 확진자가 속출하고 있다.

사스, 메르스 및 코로나19는 모두 베타 코로나바이러스(β-coronavirus) 속에 속하는 변종 코로나바이러스가 원인이 되는 것으로 알려졌다. 또한, 이들은 다양한 코로나바이러스의 1차적 보유 숙주인 박쥐로부터 유래한 것으로 판단되며, 그 정확한 감염 경로에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않았다.

이처럼, 지속적으로 코로나바이러스 관련 변종 바이러스가 발생하고 있어, 이들의 신속한 검출이 팬데믹을 막는데 중요한 요소로 작용하고 있으나, upE 영역 기반의 실시간 RT-PCR 방법은 그 검출한계가 매우 낮아 정밀한 검출이 어려운 문제가 발생하였고, 동시 검출용 RT-PCR의 경우는 2종 이상의 프라이머 및 프로브를 사용함에 따른 비특이적 증폭 산물이 증가하여 검출한계 및 검출 특이성이 낮아지는 문제가 지속적으로 대두되고 있다.

또한, 현재 신종코로나바이러스 감염증 진단 방법은 사스코로나바이러스-2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-2)의 외피(Envelop) 단백질, 뉴클레오캡시드 (Nucleocapsid) 및 RNA-의존 RNA 폴리머라아제 (RNA-dependent RNA polymeras) 3종류 단백질의 보존적 염기서열을 기반으로 프라이머/프로브 세트를 사용하는 것이 알려져 있는데, 통상 검증을 위해 2종의 유전자 사용하여야 하는 문제가 존재한다.

이에, 소량의 시료, 간단한 방법으로 신종 코로나 바이러스 및 이를 포함한 SARS-코로나바이러스 및 SARS-관련 코로나바이러스를 확진하고, 이들을 동시 검출할 수 있는 신규 방법의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 국내외에서 발생되고 있는 신종 코로나바이러스 및 박쥐유래의 다양한 코로나바이러스의 염기서열 분석하고 특이적 염기서열을 확보하여 검출용 프라이머/프로브를 디자인하여 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1916899호 중국공개특허 제 CN 111549175호

본 발명자들은 국내외에서 발생한 코로나바이러스의 염기서열을 분석하고 membrane 유전자의 코로나바이러스 간 상동성과 특이적 유전자를 분석하여, single gene target의 분자진단 기법을 개발함으로써 기존의 진단 타깃과의 차별성을 고려하였다. 그 결과, 코로나바이러스의 막 (membrane) 단백질의 특이적인 염기서열을 이용하여 하나의 프라이머 세트와 SARS-CoV-2 및 범(pan)-SARS-like(유사) 바이러스 특이적인 프로브를 제작하여, 다중 프라이머 세트 사용에 따른 특이도와 민감도의 문제를 개선함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은

(a) 막(membrane) 유전자의 일부를 표적으로 하여 이를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및

(b) 서열번호 3의 제1프로브 및 서열번호 4의 제2프로브;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 막(membrane) 유전자의 일부를 표적으로 하여 이를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및

(b) 서열번호 3의 제1프로브 및 서열번호 4의 제2프로브;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 특이적으로 검출하는 방법, 및 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 이의 유사 바이러스를 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(b) 서열번호 3의 제1프로브 및 서열번호 4의 제2프로브;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 프로브는 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(5-hexachloro-fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 제1프로브와 제2프로브는 상이한 리포터를 가지는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 프로브는, 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와 블랙(Iowa black)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 프라이머 쌍은 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 쌍인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스는, 익수목(박쥐류), 천산갑, 뱀목, 너구리, 오소리, 사향삵과, 사슴, 돼지, 소, 설치목 및 조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로부터 유래된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 중증급성호흡기증후군 바이러스 검출용 조성물은, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 검출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 (a) 막(membrane) 유전자의 일부를 표적으로 하여 이를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및

(b) 서열번호 3의 제1프로브 및 서열번호 4의 제2프로브;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트는, 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여, 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 특이적으로 검출하는 방법 및 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 이의 유사 바이러스를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 검출용 조성물은 membrane을 타깃으로 하여 현재 유행중인 COVID-19(SARS-CoV-2)의 신속하고 정확한 검증이 가능하다. 특히, 소량의 시료에서도 한 번의 반응으로 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스의 범용적 검출이 가능하며, 다중 프라이머 세트를 사용하지 않아 특이도와 민감도를 크게 개선하였다는 점에 우수한 효과를 가진다.

도 1은 본 발명 프라이머 쌍의 코로나바이러스 내 타깃 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명 프라이머 쌍 및 프로브들을 이용하여 민감도 분석을 수행하여 Sars-Cov2에 대한 검출능이 우수함을 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에서, 용어 "중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스"란, 일 예로 익수목(박쥐류), 천산갑, 뱀목, 너구리, 오소리, 사향삵과, 사슴, 돼지, 소, 설치목 및 조류로부터 유래된 것으로, 급성 호흡기증후군을 유발할 수 있는 원인 바이러스를 의미한다.

이들 바이러스가 사람에게 발생한 대표적 예로 사스(SARS) 및 코로나19(COVID-19)를 들 수 있다.

특히, 코로나 바이러스는 지속적으로 발생하고 그 변이형이 매우 다양하며, 사람에게 치명적으로 작용하고 있어, 이의 전염을 조기에 막는 것이 매우 중요하다. 따라서, 빠른 진단을 통한 격리 등의 조치를 취할 수 있도록 이들을 동시에 검출할 수 있는 진단 기법의 개발이 필수적이다.

이에, 본 발명에 따른 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 또는 이의 유사 바이러스 검출용 조성물은 범용-SARS-관련(pan-SARS-like)(서열번호 3, GAA GTA GCT RAG CCA CAT CAA GCC), 및 SARS-CoV-2(서열번호 4, CAC CGG TGG AAT TGC TAT CGC) 각각에 대한 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, R은 A 또는 G이다.

프라이머 세트는 국내외 발생된 코로나바이러스의 염기서열을 기반으로 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성하였다. 구체적으로, 멤브레인 유전자를 타깃으로 한 정방향 프라이머의 염기서열은 5'-GTG CTT GCT GCT GTY TAC AG-3'(서열번호 1)로, 역방향 프라이머의 염기서열은 5'-GTT TCT GGR TTG AAT GAC CAC A -3'(서열번호 2)로 구성하였다.

여기서, Y는 C 또는 T이며, R은 A 또는 G이다.

상기 프라이머 쌍에 대한 프로브들은 각각 범용-SARS-관련(pan-SARS-like)(서열번호 3) 정보와 SARS-CoV-2(서열번호 4)에 관한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명에 구체적인 실시양태에 따르면, SARS-CoV-2(서열번호 4)프로브를 이용하여 SARS-COV-2의 유무에 관한 정보를 제공할 수 있다. 또한, 범용-SARS-관련(pan-SARS-like)(서열번호 3)를 이용하여 SARS-COV와 SARS-COV2의 유무를 포함하여 타종, 예를 들어, 박쥐 유래의 코로나 바이러스, 예를 들어 Bat SARS-related coronavirus (B18-83)에 관한 정보를 제공할 수 있다.

특히, 본 발명에 따르면, 하나의 프라이머 쌍을 사용함으로써 다중 프라이머 쌍의 사용에 따른 신호 겹칩이나 노이즈를 최소화하고, 민감도 및 특이도를 크게 증진시켰다.

본 발명에서, 용어 "마커"란 코로나19, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스를 구분하여 진단할 수 있는 특정 염기서열을 의미한다. 본 발명에 따른 검출용 조성물은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3과 서열번호 4의 프로브의 구성에 따라 코로나 19와 함께 유사 바이러스를 높은 민감도와 특이도로 정확하게 확인할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3말단 수화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 작용하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머 세트"는 목적하는 유전자를 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭시키기 위하여 사용되는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 세트를 의미하며, 용어 "프라이머 쌍"과 호환된다.

상기 프라이머는 DNA 합성의 시발점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징이 혼입될 수 있다. 또한, 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역 화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(알칼린포스파타아제), 방사선 동위원소(예. ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예. 바이오틴) 등이 있다.

본 발명에서, 용어 "프로브"는, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

상기 프로브는 해당 염기서열의 5'와 3' 말단에 각각 검출에 이용되는 표지가 더 접합된 것일 수 있으며, 구체적으로 리포터 또는 소광자(quencher)가 각각 5'와 3' 말단에 접합될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 리포터와 소광자가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 따라 발광이 억제되고, 중합효소연쇄반응을 통하여 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 리포터와 소광자 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 이와 같은 반응으로 시료로부터 코로나19, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스의 존재 유무를 검출하고, 이의 감염을 진단할 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 프로브는 바람직하게 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것이 좋다. 이때, 상기 리포터는, 일 예로 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(5-hexachloro-fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명에 있어, 상기 프로브는 바람직하게 3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것이 좋다. 이때, 상기 소광자는, 일 예로 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와 블랙(Iowa black)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

이처럼 형광물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하면 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있어, DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하고, 전기영동이 필요 없어, 신속하고 간편하며 정확한 검출이 가능한 이점이 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머는 바람직하게 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것이 좋다.

상기 프라이머 또는 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가적인 특징의 혼입이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 코로나19, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스의 동시 검출이 가능한 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 올리고뉴클레오타이드 서열을 변형할 수 있으며, 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 가능하다. 또한, 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩티드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화 금속 등의 킬레이트화제 및 망칼리화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 서열번호 3의 프로브는 리포터로 HEX과 소광자로 BHQ1을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시양태에 따르면, 서열번호 4의 프로브는 리포터로 FAM과 소광자로 BHQ1을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 코로나19 또는 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스의 특이적 검출은 물론 이들의 동시 검출이 가능함을 특징으로 한다. 특히, 상기 조성물은 바이러스의 Membrane 유전자에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 검출용 조성물을 사용하여 코로나19 바이러스를 특이적으로 검출하고, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 검출용 조성물을 이용함으로써 현재 전 세계적으로 유행하고 있는 COVID-19 바이러스뿐만 아니라, SARS 바이러스, 박쥐 또는 SARS 유사 바이러스를 동시에 검출할 수 있음을 확인한 것이다.

본 발명은 또한, (a) 막(membrane) 유전자의 일부를 표적으로 하여 이를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 핵산서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및

본 발명에 있어, 상기 키트는, 실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분으로서 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 키트는 역전사 반응 및 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다.

증폭 수단은 역전사중합효소연쇄반응을 수행하기 위한 통상의 수단일 수 있으며, 일 예로 역전사중합효소연쇄반응기를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있는 반응혼합액(mixture)을 포함할 수 있다.

상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.

또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명에 따른 키트는 상술한 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하므로, 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 중복성을 피하기 위하여 그 기재를 생략하는 바이다.

한편, 본 발명은 상기한 본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 검출 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 이의 유사 바이러스 동시 검출 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 방법은 시료로부터 핵산을 추출하여 이를 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 증폭시키는 단계는 40℃ 내지 50℃, 바람직하게는 43℃ 내지 47℃, 더욱 바람직하게는 45℃에서 10 내지 20분, 바람직하게는 13 내지 17분, 더욱 바람직하게는 15분 및 90℃ 내지 100℃ 바람직하게는 93℃ 내지 97℃ 더욱 바람직하게는 95℃에서 1 내지 5분, 바람직하게는 1 내지 3분, 더욱 바람직하게는 분 동안 1회 사이클링하는 1차 단계; 및 90℃ 내지 100℃, 바람직하게는 95℃에서 5초, 50℃ 내지 60℃, 바람직하게는 58℃에서 10 내지 30초, 바람직하게는 20초 동안 35 내지 40회, 바람직하게는 40회 사이클링하는 2차 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 1차 단계는 역전사 과정이며 2차 단계는 유전자 증폭 과정으로서, 유전자 증폭 과정은 해리-결합-연장 단계로 이루어진다.

상기 시료는 SARS 또는 이의 유사 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료일 수 있으며, 상기 동물은 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 시료는 임상시료 또는 환경시료일 수 있고, 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득된 것일 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 이에 제한되지는 않으나, 원스텝(One step) 실시간 역전사중합효소연쇄반응인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어, RT-PCR 수행 시 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 진단 방법은 유전자의 증폭을 실시간으로 정량화하는 단계를 포함할 수 있는데, 예컨대 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real time RT-PCR)을 통해 유전자 증폭 시, 실시간으로 모니터링하여 얻게 되는 증폭 곡선으로부터 Ct 값(Cycle threshold)를 산출하고 이를 이용하여 유전자 증폭 산물 내에 목표하는 유전자의 존재 유무나 증폭 산물을 정량화하는 단계로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, Bioline Reagents 사의 Bioline One-Step RT-PCR Kit를 사용하고 프로브의 5' 말단에 리포터, 3' 말단에 소광자를 부착하여 증폭된 핵산과 프로브와의 혼성화 반응 유무를 통해 코로나19, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스의 존재 유무를 검출하고, 이의 감염 여부를 진단하였다.

본 발명에 따른 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 검출 방법은, 기존 방법보다 간단한 단계만으로 효율적인 코로나19, 중증급성호흡기증후군 바이러스 및 중증급성호흡기증후군 유사 바이러스의 검출이 가능하다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명에 따른 검출용 조성물의 제작

국내외에서 발생한 코로나바이러스의 염기서열을 분석하고 특이적 염기서열을 확보하여 검출용 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 먼저, 코로나바이러스를 포함한 SARS 및 박쥐 유래 코로나바이러스 Membrane 유전자 염기서열을 확보하였다. 이후. 확보된 염기서열을 정렬(alignment)하였고, 이를 기반으로 SARS-CoV-2(COVID-19) 검출용 정방향/역방향 프라이머 및 프로브를 제작하였다.

구체적으로, 신종 코로나 바이러스를 포함한 SARS 및 박쥐 유래 코로나바이러스 염기서열을 alignment하였고, 이를 기반으로 SARS-CoV-2 바이러스 및 범(pan)-SARS-like 바이러스 진단을 위한 단일 프라이머를 제작하였다. 그리고 나서, 각각의 바이러스에 특이적으로 진단할 수 있는 probe를 제작하였다. 프로브 제작에는 FAM (5-Carboxyfluorescein)와 HEX (5-hexachloro-fluorescein)의 형광염료가 포함되도록 제작하였다.

상기 제작된 서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

SARS-CoV-2 및 pan-SARS 검출용 프라이머와 프로브

상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 프라이머 세트로 서열번호 1(Forward primer) 및 서열번호 2(Reverse primer)를 구성하였으며, 서열번호 3의 범용 프로브(Pan-Sars-like probe)와 서열번호 4의 Sars-Cov2 프로브(Sars-Cov-2 probe)를 구성하였다.

실험예 1. 프라이머/프로브 특이도 검증

본 연구진이 확보하고 있는 다양한 바이러스를 이용하여 상기 개발된 SARS-CoV-2*(* 질병관리본부 국립보건원 산하 국가병원체자원은행으로부터 최근 국내에서 분리된 COVID-19 (BetaCoV/South Korea/KUMC01/2020) 바이러스를 분양받았음.) 및 pan-SARS-like 바이러스 검출용 프라이머/프로브에 대한 특이도 분석을 진행하였다. 특이도 검증을 위해 인체를 포함한 다양한 바이러스 배양액을 이용하였으며, 하기와 같이 11종의 바이러스를 사용하였다: Dengue type 1 (Korea/DenKor-07), Dengue type 2 (Korea/DENV-2/KBPV-VR-29), Influenza A (Korea/37/2012, H3N2), Influenza A (California-04/09, H1N1), Bat-SARS-related coronavirus (B18-83), Bat-SARS-related coronavirus (B18-92), Parainfluenza virus 1 (Korea/KUMC-44), Human respiratory syncytial virus (HRSV-A/IC688/12), Adenovirus type 5 (KUMC-62), MERS-Cov(Korea/KNIH/002_5_2015), Coronavirus-NL63 (Korea/CN0601/14), SARS-CoV-2 (BetaCoV/South Korea/KUMC01/2020)

프라이머 및 프로브의 특이도 검증을 위하여, 실시간 정량적 RT-PCR (real-time reverse transcription quantitative PCR, rRT-qPCR)을 수행하였다.

실시간 정량적 RT-PCR (real-time reverse transcription quantitative PCR, rRT-qPCR)을 수행하기 위해 Bioline One-Step RT-PCR Kit (Bioline Reagents Ltd., London, UK)을 사용하였다. 각 20㎕의 반응물은 10 ㎕의 실시간 RT-PCR 완충용액, 5 ㎕의 RNA 주형, 2 ㎕의 프라이머 (0.5 pM), 3 ㎕의 5 μM 혼합 프로브 (SARS-1, SARS-2 및 범(pan)-SARS-like(유사) 바이러스 프로브 포함), 0.6 ㎕의 효소 혼합액 구성된다. 실시간 RT-qPCR은 45℃에서 15분 후 95℃에서 2분 동안 역전사, 95℃에서 5초, 58℃에서 20초간 40회 사이클을 반복 수행하였다. 열순환(Thermocycling)은 LightCycler 96 System (Roche, USA)을 사용하여 수행하였으며, 양성 결과가 40주기 내에서 각 프로브 유래의 형광 곡선의 분석에 따라 추정되었다.

상기 실험 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

배양된 바이러스를 이용한 SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like 특이도 검증

표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, SARS-CoV-2 및 SARS-COV 바이러스는 제작된 SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like 프로브에 대해 특이적으로 형광이 검출됐지만, 다른 바이러스에서는 형광이 검출되지 않음을 확인하였다.

이러한 결과는 M 유전자 타깃으로 제작된 프라이머/프로브를 사용하면 현재 전 세계적으로 유행하고 있는 SARS-CoV-2 바이러스뿐만 아니라, 박쥐 또는 SARS 유사 바이러스를 동시에 검출할 수 있음을 보여주는 결과를 나타낸다.

실험예 2. 프라이머/프로브 민감도 검증

민감도 분석을 위해 상기 SARS-CoV-2 바이러스를 인산완충식염수 (Phosphate Buffered Saline, PBS, pH 7.4)로 10배씩 희석하고, Bioline One-Step RT-PCR Kit (Bioline Reagents Ltd., London, UK)을 사용하여 RT-qPCR을 진행하였다.

각 20㎕의 반응물은 10 ㎕의 실시간 RT-PCR 완충용액, 5 ㎕의 RNA 주형, 2 ㎕의 프라이머 (0.5 pM), 3 ㎕의 5 μM 혼합 프로브 (SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like 바이러스 프로브 포함), 0.6 ㎕의 효소 혼합액 구성된다.

실시간 RT-qPCR은 45℃에서 15분 후 95℃에서 2분 동안 역전사, 95℃에서 5초, 58℃에서 20초간 40회 사이클을 반복 수행하였다.

열순환(Thermocycling)은 LightCycler 96 System (Roche, USA)을 사용하여 수행하였으며, 양성 결과가 40주기 내에서 각 프로브 유래의 형광 곡선의 분석에 따라 추정되었다.

상기 실험 결과를 도 2에 나타내었다.

RT-qPCR이 진행되는 동안 가수분해된 프로브로부터 (FAM 및 HEX) 방출되는 형광의 강도는 매 사이클 측정되고, 측정된 증폭 곡선에 기반하여, 정량 사이클 값(quantification cycle value, Cq 값)으로 결과를 나타냈다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 희석된 바이러스 RNA 주형으로부터 얻어진 Cq 값은 각각의 RNA 주형에 대해 R2 값이 모두 1.0으로, 각 RNA 주형의 복제 수와 유의한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 한편, 음성 대조군(인산완충식염수, PBS)는 어떠한 증폭 곡선도 나타내지 않았다.

상기 결과를 통해서, 본 발명에 따른 2종의 프로브를 모두 이용하여도 민감도를 우수하게 유지하며 반응을 수행할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 임상시료를 이용한 프라이머/프로브 민감도 검증

민감도 분석을 위해 코로나-19 감염증 확진 환자의 타액(saliva) 16개 및 면봉(swab) 시료 13개를 확보하였고, RNA를 추출 및 Bioline One-Step RT-PCR Kit (Bioline Reagents Ltd., London, UK)을 사용하여 RT-qPCR을 진행하였다.

각 20㎕의 반응물은 10 ㎕의 실시간 RT-PCR 완충용액, 5 ㎕의 RNA 주형, 2 ㎕의 프라이머 (0.5 pM), 3 ㎕의 5 μM 혼합 프로브 (SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like 바이러스 프로브 포함), 0.6 ㎕의 효소 혼합액 구성된다. 실시간 RT-qPCR은 45℃에서 15분 후 95℃에서 2분 동안 역전사, 95℃에서 5초, 58℃에서 20초간 40회 사이클을 반복 수행하였다. 열순환(Thermocycling)은 LightCycler 96 System (Roche, USA)을 사용하여 수행하였으며, 양성 결과가 40주기 내에서 각 프로브 유래의 형광 곡선의 분석에 따라 추정되었다.

그 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

임상검체를 이용한 SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like 효능검증

표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 감염 환자 면봉 및 객담 시료에서 SARS-CoV-2 및 pan-SARS-like의 정량 사이클 값(quantification cycle value, Cq 값)이 확인되었고, 이러한 결과는 M 유전자 타깃으로 제작된 프라이머/프로프를 사용하면 현재 전 세계적으로 유행하고 있는 SARS-CoV-2 바이러스뿐만 아니라, 박쥐 또는 SARS 유사 바이러스를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.

이러한 결과는 현재 WHO(세계보건기구)에서 제시하고 있는 SARS-CoV-2 진단용 프라이머/프로브와 대비하여 동등하거나 더욱 높은 민감도를 나타내는 것으로 확인되었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel Marker for diagnosis of Sars coronavirus2 infection and use thereof <130> 196P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (M)[Y:C/T] <400> 1 gtgcttgctg ctgtytacag 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (M)[R:A/G] <400> 2 gtttctggrt tgaatgacca ca 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pan-SARS-like probe [R: A/G] <400> 3 gaagtagctr agccacatca agcc 24 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 probe <400> 4 caccggtgga attgctatcg c 21

Claims

(a) Membrane 유전자의 일부를 표적으로 하여 이를 특이적으로 증폭하기 위한 서열번호 1 및 2의 핵산 서열을 포함하는 프라이머 쌍; 및
(b) 서열번호 3의 제1프로브 및 서열번호 4의 제2프로브;를 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프로브는,
5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 리포터는,
FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(5-hexachloro-fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1프로브와 제2프로브는 상이한 리포터를 가지는 것인, 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프로브는,
3' 말단에 소광자(quencher)가 추가로 더 접합된 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 소광자는,
TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ (nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ (Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher) 및 아이오와 블랙(Iowa black)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 쌍은,
실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 는, 익수목(박쥐류), 천산갑, 뱀목, 너구리, 오소리, 사향삵과, 사슴, 돼지, 소, 설치목 및 조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중증급성호흡기증후군 바이러스는,
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 조성물.
제1항 또는 제9항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 키트.
제10항에 있어서,
상기 키트는,
실시간 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출용 키트.
제1항 또는 제9항 중 선택되는 어느 한 항에 따른 조성물을 이용한 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나 바이러스 동시 검출 방법.
제1항에 있어서,
상기 박쥐 유래 코로나바이러스는,
Bat-SARS-related coronavirus (B18-92) 또는 Bat-SARS-related coronavirus (B18-83)인 것을 특징으로 하는 중증급성호흡기증후군 (Severe acute respiratory syndrome; SARS) 바이러스 및 박쥐 유래 코로나바이러스 동시 검출용 조성물.