WO2021225221A1 - 코로나바이러스-19 감염 진단을 위한 rt-lamp용 키트 및 방법 - Google Patents

코로나바이러스-19 감염 진단을 위한 rt-lamp용 키트 및 방법 Download PDF

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WO2021225221A1
WO2021225221A1 PCT/KR2020/009287 KR2020009287W WO2021225221A1 WO 2021225221 A1 WO2021225221 A1 WO 2021225221A1 KR 2020009287 W KR2020009287 W KR 2020009287W WO 2021225221 A1 WO2021225221 A1 WO 2021225221A1
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WO
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coronavirus
primer
isothermal amplification
mediated isothermal
lamp
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PCT/KR2020/009287
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Inventor
노경태
이원식
최지은
Original Assignee
대한민국(국군의무사령부 사령관)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the present invention relates to a kit and method for RT-LAMP (Reverse Transcriptional Loop-mediated isothermal amplification) for diagnosing coronavirus-19 infection.
  • RT-LAMP Reverse Transcriptional Loop-mediated isothermal amplification
  • Coronavirus-19 is a strain of human coronavirus first discovered in December 2019 in Wuhan City, Hubei province, China. It has been called the Wuhan virus or 2019-novel coronavirus (2019-nCoV), etc., but on February 13, 2020, the International Committee for Classification of Viruses officially announced the virus name as SARS-CoV-2.
  • the Korea Centers for Disease Control and Prevention has named the Korean version of COVID-19 as Corona Virus-19 (abbreviated Corona 19).
  • Coronavirus is an RNA virus that causes respiratory diseases such as colds. It infects a variety of animals, including humans.
  • coronaviruses There are a total of seven types of coronaviruses that have been identified so far, including HCoV 229E, HCoV NL63, HCoV OC43, HCoV HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2.
  • the main symptoms are fever and respiratory symptoms (cough, sore throat, shortness of breath). Depending on the patient, symptoms such as headache, muscle pain, chills, chest pain, and diarrhea may appear. There is no vaccine or treatment for the infection, so only symptomatic treatment is possible depending on the patient's symptoms.
  • the incubation period like other coronaviruses, is estimated to be 2 to 14 days. Healthy adults are more likely to recover over time, but the infection can be fatal for people with low immunity, such as the elderly or those with underlying medical conditions. In some cases, the infection progresses to acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute lung injury, septic shock, acute kidney injury, etc. In severe cases, it can lead to death.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • RT-PCR genetic test
  • lung CT lung CT
  • antibody test blood test
  • RT-PCR diagnostic test There are two protocols for the RT-PCR diagnostic test.
  • a screening test that tests the E gene by PCR and a confirmatory test on the RdRP region of the orf1b gene by PCR
  • Antibody testing is a method of testing whether antibodies are formed instead of testing the virus itself.
  • Korea Patent No. 2018079 discloses 'a primer set for detecting MERS coronavirus and its use'
  • Korean Patent No. 1100436 discloses 'a primer for detecting SARS coronavirus, a method for detecting SARS coronavirus using the same, and 'Kit' is disclosed, but there is no description of the kit and method for RT-LAMP for diagnosing coronavirus-19 infection of the present invention.
  • the present invention is derived by the request as described above, the present inventors have then analyzed a mutation of the N-gene encoding the nucleocapsid protein from coronavirus -19 449 clinical specimens, mutant-specific non-generating area of the N gene
  • a primer set for ring-mediated isothermal amplification was prepared. After that, using the primer set, loop-mediated isothermal amplification was performed on the synthetic RNA or synthetic virus particles of the coronavirus-19 infection sample, and as a result, the nucleic acid of coronavirus-19 in the sample was By confirming that it can be accurately detected without a non-specific reaction, the present invention was completed.
  • the present invention is a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT) consisting of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 1 to 6 specific for the non-mutagenic N gene region of coronavirus-19.
  • -LAMP primer sets
  • a reagent for performing a reverse cycle-mediated isothermal amplification reaction provides a kit for RT-LAMP for detecting coronavirus-19 (SARS-CoV-2), including.
  • the present invention comprises the steps of isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of being infected with COVID-19; Using the isolated total RNA as a template and using a primer set for reverse thought cycle-mediated isothermal amplification consisting of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 1 to 6, the target sequence was obtained by a Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification reaction. amplifying; and detecting the product of the amplification step; provides a method for detecting coronavirus-19 comprising.
  • the present invention is a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (Reverse transcriptional Loop-mediated) for detecting coronavirus-19 including the oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 1 to 6 specific to the non-mutated N gene region of coronavirus-19 A primer set for isothermal amplification is provided.
  • the present invention provides a composition for detecting COVID-19 comprising the primer set for the reverse cycle mediated isothermal amplification.
  • the primer set for RT-LAMP of the present invention and the coronavirus-19 detection method using the same can check the molecular diagnostic test results within 1 hour on the spot only with a real-time isothermal amplifier, and target the non-mutated region of the N gene. Since accurate test results can be presented, it will be useful for diagnosis of COVID-19.
  • N gene sequence (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs) of coronavirus-19 (SARS-CoV-2) isolated from 449 clinical samples. /) and the reference sequence (GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, N gene of the complete genome; SEQ ID NO: 7) is the result of analyzing the mutation location. Red marked bases: mutations.
  • Figure 2 shows the location of the primer set for RT-LAMP of the present invention designed to target the non-mutagenic site of the N gene of coronavirus-19.
  • 3 is a RT-LAMP result using a COVID-19 clinical sample collected by a nasal swab method.
  • LOD 4 is a result of analyzing the limit of detection (LOD) using synthetic RNA.
  • 5 is a result of LOD analysis using synthetic coronavirus-19 particles.
  • the invention coronavirus -19 (SARS-CoV-2) oligonucleotide of the mutant non-occurrence N gene specific region in SEQ ID NO: 1 to 6 of the RT-loop mediated isothermal amplification primer consisting of nucleotides ( primer sets for reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP); and a reagent for performing a reverse cycle-mediated isothermal amplification reaction; provides a kit for RT-LAMP for detecting coronavirus-19, including.
  • SARS-CoV-2 oligonucleotide of the mutant non-occurrence N gene specific region in SEQ ID NO: 1 to 6 of the RT-loop mediated isothermal amplification primer consisting of nucleotides ( primer sets for reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP); and a reagent for performing a reverse cycle-mediated isothermal amplification reaction
  • the kit for detecting coronavirus-19 (SARS-CoV-2) according to the present invention is GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan -Hu-1, the gene encoding the nucleocapsid protein from the complete genome-specific, SEQ ID NO: in the 201 to 500th nucleotide sequence of mutant non-generating area of the (N gene, SEQ ID NO: 7) It includes a primer set for reverse cycle-mediated isothermal amplification consisting of 1 to 6 oligonucleotides.
  • kit for detecting COVID-19 may further include a fluorescently-labeled probe capable of binding to a product amplified by the primer set for reverse cycle-mediated isothermal amplification, but is not limited thereto. .
  • the kit for detecting COVID-19 of the present invention may preferably be a kit for reverse cycle mediated isothermal amplification (RT-LAMP) or a kit for Direct RT-LAMP, but is not limited thereto.
  • the kit for Direct LAMP can perform the LAMP reaction immediately after mixing the sample (sample) with the lysis buffer included in the kit.
  • the kit of the present invention when the kit of the present invention is for Direct RT-LAMP, the kit further includes a lysis buffer, wherein the lysis buffer preferably contains 0.1 to 1.5% (v/v) of Triton X-100, pH 6.0 It may be 30-500 mM Tris of ⁇ 7.0, more preferably 300-500 mM Tris of pH 6.5, containing 0.8-1.2% (v/v) of Triton X-100, even more preferably may be 400 mM Tris, pH 6.5, containing 1% (v/v) Triton X-100, but is not limited thereto.
  • the lysis buffer preferably contains 0.1 to 1.5% (v/v) of Triton X-100, pH 6.0 It may be 30-500 mM Tris of ⁇ 7.0, more preferably 300-500 mM Tris of pH 6.5, containing 0.8-1.2% (v/v) of Triton X-100, even more preferably may be 400 mM Tris, pH
  • the reagent for performing the reverse cycle-mediated isothermal amplification reaction may include a reverse transcriptase, a DNA polymerase, dNTPs and a buffer.
  • DNA polymerase according to an embodiment of the present invention may be a Bst polymerase, but is not limited thereto, and is mainly used in the existing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for reverse cycle-mediated isothermal amplification (RT-LAMP).
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • RT-LAMP reverse cycle-mediated isothermal amplification
  • GspSSD DNA polymerase having a faster amplification ability and strong reverse transcriptase ability may be used instead of the Bst polymerase, but is not limited thereto.
  • kit of the present invention may further include a user's guide describing optimal conditions for performing the reaction.
  • a handbook is a printout that explains how to use the kit, eg, how to prepare buffers, and suggested reaction conditions.
  • Instructions include a brochure in the form of a pamphlet or leaflet, a label affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the guide includes information published or provided through electronic media such as the Internet.
  • the present invention also relates to the present invention.
  • RNA isolating total RNA from a biological sample isolated from a patient suspected of being infected with COVID-19;
  • the target sequence was obtained by a Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification reaction. amplifying;
  • It provides a method of detecting coronavirus-19 (SARS-CoV-2) comprising; detecting the product of the amplification step.
  • SARS-CoV-2 coronavirus-19
  • the biological sample may be, for example, a collected human specimen (nasal swab method), but is not limited thereto, and the coronavirus-19 infection is suspected. If it is a biological sample isolated from a patient, it can be used without limitation.
  • a method for isolating total RNA from the sample may use any method known in the art, for example, a phenol extraction method may be used.
  • the reverse cycle mediated isothermal amplification reaction is performed at 48 to 52 ° C. for 3 to 7 minutes, and then at 65 ° C. to 70 ° C. for 20 to 50 minutes. It may be one, preferably after reacting at 50°C for 5 minutes, may be carried out for 25 to 35 minutes at 68°C, but is not limited thereto, and for 20 to 50 minutes at 65°C to 70°C without prior reaction , preferably at 68° C. for 25 to 35 minutes.
  • the coronavirus-19 detection method of the present invention includes detecting the product of the reverse thought-mediated isothermal amplification step.
  • the detection of the amplification product is fluorescence measurement using SYBR Green I, color change of an indicator such as phenol red, turbidity, precipitate formation, DNA laddering, capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radiometric measurement, or phosphorescence measurement. It may be performed through, preferably, fluorescence measurement using SYBR Green I, turbidity, and DNA laddering, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a reverse cycle mediated isotherm for detecting coronavirus-19 comprising oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 1 to 6 specific for the non-mutated N gene region of coronavirus-19 (SARS-CoV-2) Provides primer sets for reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP).
  • the primer set for RT-LAMP for detecting coronavirus-19 is GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan -Hu-1, the gene encoding the nucleocapsid protein from the complete genome-specific, SEQ ID NO: in the 201 to 500th nucleotide sequence of mutant non-generating area of the (N gene, SEQ ID NO: 7) 1 to 6 oligonucleotide primer sets.
  • LAMP 'Loop-mediated isothermal amplification
  • PCR polymerase chain reaction
  • the four basic primers are composed of two types of outer primers and two types of inner primers, and the outer primers are a forward outer (F3) primer and two types of backward outer (B3) primers. It is composed of and serves to unwind the DNA double strand during the non-cyclic step of the reaction.
  • the inner primer consists of two types: a forward inner primer (FIP) and a backward inner primer (BIP). It consists of the corresponding nucleotides.
  • the additional two types of primers consist of two types of forward loop (LoopF) primer and backward loop (LoopB) primer.
  • the inner primer attaches to a nucleotide sequence that does not bind to perform a loop-mediated isothermal amplification reaction. accelerate
  • the primer of SEQ ID NO: 1 is a forward outer primer F3
  • the primer of SEQ ID NO: 2 is a reverse outer primer B3
  • the primer of SEQ ID NO: 3 is a forward inner primer FIP
  • the primer of SEQ ID NO: 4 is a reverse inner primer BIP
  • the primer of SEQ ID NO: 5 is a forward loop primer LoopF
  • the primer of SEQ ID NO: 6 is a reverse loop primer LoopB.
  • the primer of the present invention may include an oligonucleotide consisting of a fragment of 15 or more, 16 or more, 17 or more consecutive nucleotides in SEQ ID NOs: 1, 2, 5 and 6, depending on the sequence length of each primer, and oligonucleotides consisting of segments of at least 32, at least 33, at least 34, at least 35, at least 36, at least 37 contiguous nucleotides in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • the primer of SEQ ID NO: 1 (20 oligonucleotides) includes an oligonucleotide consisting of fragments of 15 or more, 16 or more, 17 or more, 18 or more, 19 or more nucleotides in the sequence of SEQ ID NO: 1 can do.
  • primer refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be replicated, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product.
  • the length and sequence of the primers should allow synthesis of the extension product to begin.
  • the specific length and sequence of the primer will depend on the conditions of use of the primer, such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
  • the oligonucleotide used as a primer may also contain a nucleotide analogue, for example, a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid or An intercalating agent may be included.
  • a nucleotide analogue for example, a phosphorothioate, an alkylphosphorothioate or a peptide nucleic acid or An intercalating agent may be included.
  • each primer of the present invention may be modeled as a detection label in order to increase the convenience of detection.
  • the detection label may be, but is not limited to, a compound, biomolecule or biomolecule analog, etc., capable of confirming the density, concentration, amount, etc. of an amplification product in a conventional manner by linking, binding, or attaching to a primer, but is not limited thereto, but FAM, VIC , TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563, BIOTIN, DIGOXIGENIN and NED can be used.
  • the present invention also provides a composition for detecting coronavirus-19 comprising the primer set for the reverse cycle mediated isothermal amplification.
  • Example 1 Design of a primer set for LAMP for detection of coronavirus-19
  • SARS-CoV isolated from 449 clinical samples of COVID-19 to produce a primer set for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of COVID-19 (SARS-CoV-2) -2 N gene sequence (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/) and GenBank accession no.
  • LAMP loop-mediated isothermal amplification
  • a total of 47 nucleotide mutations were identified, and a non-mutation site (the 201 to 500 nucleotides in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) was secured.
  • the primer for LAMP was designed using OptiGene's LAMP Design software, and the position of the LAMP primer sequence for the final designed coronavirus-19 detection is shown in FIG. 2 .
  • coronavirus-19 In order to analyze the detection ability of coronavirus-19 using the prepared LAMP primer, RT-LAMP using a clinical specimen was performed. Coronavirus Infectious Disease-19 (COVID-19) clinical specimens and non-COVID-19 non-infected clinical specimens were provided and used by the Armed Forces Capital Hospital.
  • COVID-19 Coronavirus Infectious Disease-19
  • RNA was mixed with RT-LAMP premix (1 ⁇ l (8U) of Bst polymerase, 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 1.5 ⁇ l of 25mM dNTPs, 10 mM MgSO 4 1 ⁇ l, 5M betaine 5 ⁇ l, Reverse Transcriptase 0.1 ⁇ l (10 U)), 6 primers (5 pmol each for F3 and B3, 40 pmol each for FIP and BIP, 10 pmol each for LoopF and LoopB) 1 ⁇ l each, After mixing with 25X SYBR Green I 1 ⁇ l and distilled water (up to 25 ⁇ l) and reacting at 50° C. for 5 minutes, an isothermal amplification reaction was performed at 68° C. for 30 minutes using a BioRad CFX 96 Real time PCR machine. The fluorescence signal was measured every 20 seconds.
  • the fluorescence signal was detected in the COVID-19 positive sample from 13 minutes and 20 seconds of the isothermal amplification reaction, and after 14 minutes, a clear amplification product was confirmed in the COVID-19 positive sample, and at the end of the reaction in the COVID-19 negative sample Until no fluorescence signal was detected, it was found that the primer set of the present invention could accurately detect coronavirus-19 (FIG. 3).
  • the limit of detection (LOD) of coronavirus-19 was analyzed using the LAMP primer prepared in the present invention.
  • synthetic RNA and synthetic virus particles were used. Synthetic RNA was prepared by requesting synthesis from Bionics Co., Ltd. by changing thymine (T) to uracil (U) in the base sequence of SEQ ID NO.
  • synthetic virus particles were tested using the Accuplex SARS-CoV-2 Reference Material Kit from Seracare, USA.
  • RT-LAMP reaction 2 ⁇ l of template RNA, 1 ⁇ l of Bst polymerase (8U), 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ buffer, 1.5 ⁇ l of 25mM dNTP, 1 ⁇ l of 10mM MgSO 4 , 5 ⁇ l of 5M betaine, 0.1 ⁇ l of Reverse Transcriptase (10U), 6 primers (5 pmol each for F3 and B3, 40 pmol each for FIP and BIP, 10 pmol each for LoopF and LoopB) 1 ⁇ l each, 25 ⁇ SYBR Green I 1 ⁇ l and distilled water (up to 25 ⁇ l) After preparing 25 ⁇ l of a reaction solution and reacting at 50° C. for 5 minutes, an isothermal amplification reaction was performed at 68° C. for 30 minutes using a BioRad CFX 96 Real time PCR machine. The fluorescence signal was measured every 20 seconds.
  • the detection is possible to synthesize RNA in the limit of detection performance analysis using a sample 10 0, that is, have been identified is detected available to one copy of the (4) and the detection limit performance analysis using synthetic virus-like particles can be virus-like particles to 50 was found (FIG. 5). From the above results, it was found that by using the primer set according to the present invention, it was possible to quickly and accurately detect COVID-19 through the RT-LAMP reaction.

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Abstract

본 발명은 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스-19 감염 진단을 위한 RT-LAMP용 키트 및 방법
본 발명은 코로나바이러스-19 감염 진단을 위한 RT-LAMP(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 키트 및 방법에 관한 것이다.
코로나바이러스-19(Coronavirus-19)는 2019년 12월 중국 후베이성 우한시에서 처음 발견된 사람 코로나바이러스 변종이다. 우한 바이러스 또는 2019-신종 코로나바이러스(2019-nCoV) 등으로 불려왔으나, 2020년 2월 13일 국제바이러스분류위원회는 바이러스명을 SARS-CoV-2로 공식 발표했다. 국내 질병관리본부는 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)의 한글표기를 코로나바이러스-19(약칭 코로나19)로 명명하였다. 코로나바이러스는 감기 등 호흡기 질환을 유발하는 RNA 바이러스로, 외피가 돌기로 둘러싸인 왕관(Corona) 모양이라 코로나바이러스라는 이름이 붙었다. 사람을 포함한 다양한 동물에게 감염을 일으킨다. 현재까지 확인된 인체 전염 코로나바이러스는 총 7종으로 HCoV 229E, HCoV NL63, HCoV OC43, HCoV HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2가 이에 해당한다.
주요 증상은 발열과 호흡기 증상(기침·인후통·호흡곤란)이다. 환자에 따라 두통·근육통·오한·가슴 통증·설사 등의 증상이 나타나기도 한다. 감염증에 대한 백신이나 치료제가 없어 환자의 증상에 따라 대처하는 대증요법만 가능하다. 잠복기는 다른 코로나바이러스처럼 2~14일 정도일 것으로 추정한다. 건강한 성인은 시간이 지나면 회복될 가능성이 크지만, 노약자나 기저 질병이 있던 사람 등 면역 기능이 낮은 사람이 감염될 경우 치명적일 수 있다. 일부는 감염 후 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS)·급성 폐 손상·패혈성 쇼크·급성 신장 손상 등으로 진행되기도 하며, 심할 경우 사망에 이를 수 있다.
코로나19의 진단 및 검사 방법은 크게 유전자 검사(RT-PCR), 폐 CT 및 항체 검사(혈액 검사)가 있다. RT-PCR 진단검사는 두개의 프로토콜이 있으며 첫째, 2단계의 프로토콜을 사용하는 경우 E 유전자를 PCR로 검사하는 선별검사(Screening test)와 orf1b 유전자의 RdRP 부위를 PCR법으로 확인검사(confirmatory test)하는 2단계 해석 알고리즘이 있으며 이 방법이 가장 대표적인 방법이다. 항체 검사는 바이러스 자체를 검사하는 대신 항체가 형성되었는지를 검사하는 방법이다.
한편, 한국등록특허 제2018079호에는 '메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1100436호에는 '사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스 코로나바이러스 검출 방법 및 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 코로나바이러스-19 감염 진단을 위한 RT-LAMP용 키트 및 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 코로나바이러스-19 임상검체 449개로부터 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 N 유전자의 돌연변이를 분석한 후, 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제작하였다. 그 후 상기 프라이머 세트를 이용하여 코로나바이러스-19 감염 시료 합성 RNA 또는 합성 바이러스 입자를 대상으로 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification)을 수행한 결과, 시료 내에서 코로나바이러스-19의 핵산을 비특이적 반응 없이 정확하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 코로나바이러스-19의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스-19 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 코로나바이러스-19의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 RT-LAMP용 프라이머 세트 및 이를 이용한 코로나바이러스-19 검출 방법은 실시간 등온증폭기기만으로 분자진단 검사 결과를 현장에서 1시간 이내에 확인할 수 있으며, N 유전자의 돌연변이 비 발생 부위를 표적으로 하고 있어 정확한 검사 결과를 제시할 수 있으므로, 코로나바이러스-19의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 449개 임상검체로부터 분리된 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 N 유전자 염기서열(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)과 참조서열(GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome의 N 유전자; 서열번호 7)을 비교하여 돌연변이 위치를 분석한 결과이다. 빨간색 표시 염기: 돌연변이.
도 2는 코로나바이러스-19의 N 유전자의 돌연변이 비 발생 부위를 표적으로 하여 디자인된 본 발명의 RT-LAMP용 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 코 면봉법(nasal swab)으로 채취한 COVID-19 임상검체를 이용한 RT-LAMP 결과이다.
도 4는 합성 RNA를 이용하여 검출한계(Limit of detection, LOD)를 분석한 결과이다.
도 5는 합성 코로나바이러스-19 입자를 이용한 LOD 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2) 검출용 키트는 GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자( N 유전자, 서열번호 7)의 돌연변이 비 발생 부위인 201 내지 500번째 염기서열에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 코로나바이러스-19 검출용 키트는 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물에 결합할 수 있는, 형광 표지된 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 코로나바이러스-19 검출용 키트는 바람직하게는 역전사고리매개등온증폭(RT-LAMP)용 키트 또는 Direct RT-LAMP용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Direct LAMP용 키트는 시료(검체)를 키트에 포함된 용해 버퍼와 혼합한 후 LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 특징이 있다.
본 발명의 키트가 Direct RT-LAMP용일 경우, 상기 키트는 용해 버퍼를 추가로 포함하며, 상기 용해 버퍼는 바람직하게는 0.1~1.5 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~500 mM Tris일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.8~1.2 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 300~500 mM Tris일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 1 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 400 mM Tris일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트에서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 위해 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst 중합효소 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
코로나바이러스-19 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 코로나바이러스-19 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 검체(코 면봉법(nasal swab))일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 코로나바이러스-19 감염증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료이면 제한되지 않고 사용가능하다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 코로나바이러스-19 검출 방법에 있어서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응은 48~52℃에서 3분 내지 7분 동안 반응시킨 후 65℃ 내지 70℃에서 20분 내지 50분 동안 수행되는 것일 있고, 바람직하게는 50℃에서 5분 동안 반응시킨 후 68℃에서 25분 내지 35분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전반응 없이 65℃ 내지 70℃에서 20분 내지 50분 동안, 바람직하게는 68℃에서 25분 내지 35분 동안 수행될 수도 있다.
본 발명의 코로나바이러스-19 검출 방법은 상기 역전사고리매개등온증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 탁색도, DNA laddering일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 반응액 중 형광염료 등을 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 반응 후의 SYBR Green I 추가 없이 실시간으로 등온증폭을 확인하고, annealing peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수도 있다.
본 발명은 또한, 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 RT-LAMP용 프라이머 세트는 GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자( N 유전자, 서열번호 7)의 돌연변이 비 발생 부위인 201 내지 500번째 염기서열에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다.
본 명세서에 있어서, 용어 '고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)'은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.
상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.
본 발명의 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LoopF이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LoopB이다.
본 발명의 상기 프라이머는, 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5 및 6 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3 및 4 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지로 모식될 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, 이에 한정하지 않으나, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563, BIOTIN, DIGOXIGENIN 및 NED 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19 검출용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 코로나바이러스-19 검출을 위한 LAMP용 프라이머 세트 설계
코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 검출을 위한 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 제작하기 위해, COVID-19 임상검체 449개로부터 분리한 SARS-CoV-2의 N 유전자 서열(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)과 GenBank accession no. NC_045512.2인 Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 N 유전자(서열번호 7)의 서열을 비교하여 돌연변이 발생 부위를 조사하였다(도 1). 총 47개의 염기 변이가 확인되었고, 돌연변이 비 발생 부위(서열번호 7의 염기서열에서 201~500번째 염기)를 확보하였다. LAMP용 프라이머는 OptiGene사의 LAMP Design software를 이용하여 설계하였으며, 최종 설계된 코로나바이러스-19 검출을 위한 LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 2에 나타낸 바와 같다.
또한, 이전의 연구에 의하면 코로나바이러스-19의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자( N 유전자)를 표적으로 했을 때, 다른 인체 전염 코로나바이러스들(HCoV 229E, HCoV OC43, HCoV HKU1, HCoV NL63 및 MERS-CoV)은 검출되지 않는 결과들이 보고되었다(Corman Victor M. et al., 2020 Euro Surveill. 25(3):pii=2000045).
실시예 2. RT-LAMP 분석능 평가
제작된 LAMP 프라이머를 이용한 코로나바이러스-19의 검출능을 분석하기 위해, 임상검체를 이용한 RT-LAMP를 수행하였다. 코로나바이러스감염증-19(COVID-19) 임상검체 및 non-COVID-19 비감염 임상검체는 국군 수도병원으로부터 제공받아 사용하였다.
코 면봉법(nasal swab)으로 획득한 시료 50㎕에서 총 RNA를 추출한 뒤, 주형 RNA 2㎕를 RT-LAMP 프리믹스(Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTPs 1.5㎕, 10mM MgSO 4 1㎕, 5M betaine 5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(10U)), 6개의 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LoopF 및 LoopB는 각각 10pmol) 각 1㎕씩, 25X SYBR Green I 1㎕ 및 증류수(up to 25㎕)와 혼합한 후 50℃에서 5분간 반응시킨 후, BioRad CFX 96 Real time PCR 기기를 사용하여 68℃에서 30분간 등온증폭반응을 수행하였다. 형광 신호는 매 20초마다 측정하였다.
그 결과, 등온증폭반응 13분 20초부터 COVID-19 양성 시료에서 형광 신호가 검출되기 시작하여 14분 이후부터는 COVID-19 양성 시료에서 명확한 증폭산물이 확인되었고, COVID-19 음성 시료에서는 반응 종료 시점까지 형광 신호가 검출되지 않아, 본 발명의 프라이머 세트가 코로나바이러스-19를 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 3).
실시예 3. 코로나바이러스-19 검출능 분석
본 발명에서 제작한 LAMP 프라이머를 사용하여 코로나바이러스-19의 검출한계(limit of detection, LOD)를 분석하였다. 사용한 시료는 합성 RNA와 합성 바이러스 입자를 사용하였다. 합성 RNA는 서열번호 7의 염기서열에서 티민(T)를 우라실(U)로 변경하여 바이오닉스(주)에 합성 의뢰하여 준비하였으며, base pair 및 핵산량을 계산하여 카피 수를 환산하여 사용하였다. 또한, 합성 바이러스 입자는 미국 Seracare 사의 Accuplex SARS-CoV-2 Reference Material Kit를 이용하여 실험하였다.
RT-LAMP 반응은 주형 RNA를 2㎕, Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTP 1.5㎕, 10mM MgSO 4 1㎕, 5M betaine 5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(10U), 6개의 각 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LoopF 및 LoopB는 각각 10pmol) 각 1㎕씩, 25×SYBR Green I 1㎕ 및 증류수(up to 25㎕)를 포함하는 총 25㎕의 반응액을 제조한 뒤 50℃에서 5분간 반응시킨 후, BioRad CFX 96 Real time PCR 기기를 사용하여 68℃에서 30분간 등온증폭 반응을 수행하였다. 형광 신호는 매 20초마다 측정하였다.
그 결과, 합성 RNA를 시료로 사용한 검출한계능 분석에서는 10 0 즉, 1 카피까지 검출가능함이 확인되었고(도 4), 합성 바이러스 입자를 사용한 검출한계능 분석에서는 바이러스 입자 수 50개까지 검출가능함을 알 수 있었다(도 5). 상기 결과들을 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 RT-LAMP 반응을 통해 코로나바이러스-19를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (5)

  1. 코로나바이러스-19(SARS-CoV-2)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트.
  2. 코로나바이러스-19 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 또는 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 코로나바이러스-19의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트.
  5. 제4항에 따른 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19 검출용 조성물.
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