KR102313941B1

KR102313941B1 - Covid-19 감염 진단을 위한 rt-lamp용 키트 및 방법

Info

Publication number: KR102313941B1
Application number: KR1020200053161A
Authority: KR
Inventors: 노경태; 이원식; 최지은
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2021-10-18
Also published as: WO2021225221A1

Abstract

본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

COVID-19 감염 진단을 위한 RT-LAMP용 키트 및 방법{RT-LAMP kit and method for diagnosing COVID-19 infection}

본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19) 감염 진단을 위한 RT-LAMP(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 키트 및 방법에 관한 것이다.

코로나바이러스-19(COVID-19)는 2019년 12월 중국 후베이성 우한시에서 처음 발견된 사람 코로나바이러스 변종이다. 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)로 불려왔으나, 2020년 2월 12일 세계보건기구(WHO)에서 공식명칭을 COVID-19로 발표했다. 국내 질병관리본부는 COVID-19의 한글표기를 코로나바이러스-19(약칭 코로나19)로 명명하였고, 2020년 2월 13일 국제바이러스분류위원회는 바이러스명을 SARS-CoV-2로 공식 발표했다. 코로나바이러스는 감기 등 호흡기 질환을 유발하는 RNA 바이러스로, 외피가 돌기로 둘러싸인 왕관(Corona) 모양이라 코로나바이러스라는 이름이 붙었다. 사람을 포함한 다양한 동물에게 감염을 일으킨다. 현재까지 확인된 인체 전염 코로나바이러스는 총 7종으로 HCoV 229E, HCoV NL63, HCoV OC43, HCoV HKU1, SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2가 이에 해당한다.

주요 증상은 발열과 호흡기 증상(기침·인후통·호흡곤란)이다. 환자에 따라 두통·근육통·오한·가슴 통증·설사 등의 증상이 나타나기도 한다. 감염증에 대한 백신이나 치료제가 없어 환자의 증상에 따라 대처하는 대증요법만 가능하다. 잠복기는 다른 코로나바이러스처럼 2~14일 정도일 것으로 추정한다. 건강한 성인은 시간이 지나면 회복될 가능성이 크지만, 노약자나 기저 질병이 있던 사람 등 면역 기능이 낮은 사람이 감염될 경우 치명적일 수 있다. 일부는 감염 후 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS)·급성 폐 손상·패혈성 쇼크·급성 신장 손상 등으로 진행되기도 하며, 심할 경우 사망에 이를 수 있다.

코로나19의 진단 및 검사 방법은 크게 유전자 검사(RT-PCR), 폐 CT 및 항체 검사(혈액 검사)가 있다. RT-PCR 진단검사는 두개의 프로토콜이 있으며 첫째, 2단계의 프로토콜을 사용하는 경우 E 유전자를 PCR로 검사하는 선별검사(Screening test)와 orf1b 유전자의 RdRP 부위를 PCR법으로 확인검사(confirmatory test)하는 2단계 해석 알고리즘이 있으며 이 방법이 가장 대표적인 방법이다. 항체 검사는 바이러스 자체를 검사하는 대신 항체가 형성되었는지를 검사하는 방법이다.

한편, 한국등록특허 제2018079호에는 '메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1100436호에는 '사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스 코로나바이러스 검출 방법 및 키트'가 개시되어 있으나, 본 발명의 COVID-19 감염 진단을 위한 RT-LAMP용 키트 및 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 코로나바이러스-19(COVID-19) 임상검체 449개로부터 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 N 유전자의 돌연변이를 분석한 후, 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 고리매개 등온증폭용 프라이머 세트를 제작하였다. 그 후 상기 프라이머 세트를 이용하여 코로나바이러스-19 감염 시료 합성 RNA 또는 합성 바이러스 입자를 대상으로 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification)을 수행한 결과, 시료 내에서 코로나바이러스-19의 핵산을 비특이적 반응 없이 정확하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19) 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 RT-LAMP용 프라이머 세트 및 이를 이용한 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출 방법은 실시간 등온증폭기기만으로 분자진단 검사 결과를 현장에서 1시간 이내에 확인할 수 있으며, N 유전자의 돌연변이 비 발생 부위를 표적으로 하고 있어 정확한 검사 결과를 제시할 수 있으므로, 코로나바이러스-19(COVID-19)의 진단에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 449개 임상검체로부터 분리된 COVID-19의 N 유전자 염기서열(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)과 참조서열(GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome의 N 유전자; 서열번호 7)을 비교하여 돌연변이 위치를 분석한 결과이다. 빨간색 표시 염기: 돌연변이.
도 2는 COVID-19의 N 유전자의 돌연변이 비 발생 부위를 표적으로 하여 디자인된 본 발명의 RT-LAMP용 프라이머 세트의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 코 면봉법(nasal swab)으로 채취한 임상검체를 이용한 RT-LAMP 결과이다.
도 4는 합성 RNA를 이용하여 검출한계(Limit of detection, LOD)를 분석한 결과이다.
도 5는 합성 COVID-19 바이러스 입자를 이용한 LOD 분석 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 키트는 GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(N 유전자, 서열번호 7)의 돌연변이 비 발생 부위인 201 내지 500번째 염기서열에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 키트는 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트에 의해 증폭된 산물에 결합할 수 있는, 형광 표지된 프로브를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 키트는 바람직하게는 역전사고리매개등온증폭(RT-LAMP)용 키트 또는 Direct RT-LAMP용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Direct LAMP용 키트는 시료(검체)를 키트에 포함된 용해 버퍼와 혼합한 후 LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 특징이 있다.

본 발명의 키트가 Direct RT-LAMP용일 경우, 상기 키트는 용해 버퍼를 추가로 포함하며, 상기 용해 버퍼는 바람직하게는 0.1~1.5 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~500 mM Tris일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.8~1.2 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 300~500 mM Tris일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 1 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.5의 400 mM Tris일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트에서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 역전사고리매개등온증폭법(RT-LAMP)을 위해 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst 중합효소 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

코로나바이러스-19(COVID-19) 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 COVID-19 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 검체(코 면봉법(nasal swab))일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, COVID-19 감염증 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료이면 제한되지 않고 사용가능하다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 COVID-19 검출 방법에 있어서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응은 48~52℃에서 3분 내지 7분 동안 반응시킨 후 65℃ 내지 70℃에서 20분 내지 50분 동안 수행되는 것일 있고, 바람직하게는 50℃에서 5분 동안 반응시킨 후 68℃에서 25분 내지 35분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전반응 없이 65℃ 내지 70℃에서 20분 내지 50분 동안, 바람직하게는 68℃에서 25분 내지 35분 동안 수행될 수도 있다.

본 발명의 COVID-19 검출 방법은 상기 역전사고리매개등온증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 페놀 레드와 같은 지시약의 색상 변화, 탁색도, 침전물 생성, DNA laddering, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 SYBR Green I을 이용한 형광 측정, 탁색도, DNA laddering일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 반응액 중 형광염료 등을 실시간으로 검출할 수 있는 장비를 이용하여 별도의 전기영동(electrophoresis)이나 반응 후의 SYBR Green I 추가 없이 실시간으로 등온증폭을 확인하고, annealing peak를 통해서 표적서열의 증폭 여부를 확인할 수도 있다.

본 발명은 또한, 코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에 따른 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 RT-LAMP용 프라이머 세트는 GenBank accession no. NC_045512.2; Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(N 유전자, 서열번호 7)의 돌연변이 비 발생 부위인 201 내지 500번째 염기서열에 특이적인, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다.

본 명세서에 있어서, 용어 '고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)'은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.

상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LoopF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LoopB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.

본 발명의 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LoopF이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LoopB이다.

본 발명의 상기 프라이머는, 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5 및 6 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3 및 4 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 각 프라이머에는 검출의 편의성을 높이기 위해, 검출용 표지로 모식될 수 있다. 검출용 표지는 프라이머에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등일 수 있으며, 이에 한정하지 않으나, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563, BIOTIN, DIGOXIGENIN 및 NED 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 코로나바이러스-19 검출을 위한 LAMP용 프라이머 세트 설계

코로나바이러스-19(COVID-19)의 검출을 위한 고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)용 프라이머 세트를 제작하기 위해, COVID-19 임상검체 449개의 N 유전자 서열(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sars-cov-2-seqs/)과 GenBank accession no. NC_045512.2인 Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 N 유전자(서열번호 7)의 서열을 비교하여 돌연변이 발생 부위를 조사하였다(도 1). 총 47개의 염기 변이가 확인되었고, 돌연변이 비 발생 부위(서열번호 7의 염기서열에서 201~500번째 염기)를 확보하였다. LAMP용 프라이머는 OptiGene사의 LAMP Design software를 이용하여 설계하였으며, 최종 설계된 COVID-19 검출을 위한 LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 2에 나타낸 바와 같다.

또한, 이전의 연구에 의하면 COVID-19의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(N 유전자)를 표적으로 했을 때, 다른 인체 전염 코로나바이러스들(HCoV 229E, HCoV OC43, HCoV HKU1, HCoV NL63 및 MERS-CoV)은 검출되지 않는 결과들이 보고되었다(Corman Victor M. et al., 2020 Euro Surveill. 25(3):pii=2000045).

실시예 2. RT-LAMP 분석능 평가

제작된 LAMP 프라이머를 이용한 COVID-19의 검출능을 분석하기 위해, 임상검체를 이용한 RT-LAMP를 수행하였다. COVID-19 감염 임상검체 및 COVID-19 비감염 임상검체는 국군 수도병원으로부터 제공받아 사용하였다.

코 면봉법(nasal swab)으로 획득한 시료 50㎕에서 총 RNA를 추출한 뒤, 주형 RNA 2㎕를 RT-LAMP 프리믹스(Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTPs 1.5㎕, 10mM MgSO₄ 1㎕, 5M betaine 5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(10U)), 6개의 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LoopF 및 LoopB는 각각 10pmol) 각 1㎕씩, 25X SYBR Green I 1㎕ 및 증류수(up to 25㎕)와 혼합한 후 50℃에서 5분간 반응시킨 후, BioRad CFX 96 Real time PCR 기기를 사용하여 68℃에서 30분간 등온증폭반응을 수행하였다. 형광 신호는 매 20초마다 측정하였다.

그 결과, 등온증폭반응 13분 20초부터 COVID-19 양성 시료에서 형광 신호가 검출되기 시작하여 14분 이후부터는 COVID-19 양성 시료에서 명확한 증폭산물이 확인되었고, COVID-19 음성 시료에서는 반응 종료 시점까지 형광 신호가 검출되지 않아, 본 발명의 프라이머 세트가 COVID-19를 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 3).

실시예 3. 코로나바이러스-19 검출능 분석

본 발명에서 제작한 LAMP 프라이머를 사용하여 코로나바이러스-19의 검출한계(limit of detection, LOD)를 분석하였다. 사용한 시료는 합성 RNA와 합성 바이러스 입자를 사용하였다. 합성 RNA는 서열번호 7의 염기서열에서 티민(T)를 우라실(U)로 변경하여 바이오닉스(주)에 합성 의뢰하여 준비하였으며, base pair 및 핵산량을 계산하여 카피 수를 환산하여 사용하였다. 또한, 합성 바이러스 입자는 미국 Seracare 사의 Accuplex SARS-CoV-2 Reference Material Kit를 이용하여 실험하였다.

RT-LAMP 반응은 주형 RNA를 2㎕, Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTP 1.5㎕, 10mM MgSO₄ 1㎕, 5M betaine 5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(10U), 6개의 각 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LoopF 및 LoopB는 각각 10pmol) 각 1㎕씩, 25×SYBR Green I 1㎕ 및 증류수(up to 25㎕)를 포함하는 총 25㎕의 반응액을 제조한 뒤 50℃에서 5분간 반응시킨 후, BioRad CFX 96 Real time PCR 기기를 사용하여 68℃에서 30분간 등온증폭 반응을 수행하였다. 형광 신호는 매 20초마다 측정하였다.

그 결과, 합성 RNA를 시료로 사용한 검출한계능 분석에서는 10⁰ 즉, 1 카피까지 검출가능함이 확인되었고(도 4), 합성 바이러스 입자를 사용한 검출한계능 분석에서는 바이러스 입자 수 50개까지 검출가능함을 알 수 있었다(도 5). 상기 결과들을 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하면 RT-LAMP 반응을 통해 코로나바이러스-19를 신속하고 정확하게 검출할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> The Armed Forces Medical Command <120> RT-LAMP kit and method for diagnosing COVID-19 infection <130> PN20099 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 1 caaggcgttc caattaacac 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 2 gcagcattgt tagcagga 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 3 accgtcacca ccacgaattc caatagcagt ccagatgacc 40 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 4 ctaggaactg ggccagaagc acccatatga tgccgtct 38 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopF primer <400> 5 gctcttcggt agtagccaat t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LoopB primer <400> 6 gacttcccta tggtgctaac aa 22 <210> 7 <211> 1260 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SARS-CoV-2 <400> 7 atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60 tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120 cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180 aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300 atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360 cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420 acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660 ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780 aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840 caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900 tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960 ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020 gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140 gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200 gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260 1260

Claims

코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트; 및 역전사고리매개등온증폭반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하기 위한 RT-LAMP용 키트.
코로나바이러스-19(COVID-19) 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19)를 검출하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 형광발색, 탁색도, 스핀다운에 의한 침전물 생성 또는 전기영동을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
코로나바이러스-19(COVID-19)의 돌연변이 비 발생 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 코로나바이러스-19를 검출하기 위한 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트.
제4항에 따른 역전사고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 코로나바이러스-19(COVID-19) 검출용 조성물.