KR102402765B1 - SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 단일 튜브 내 RT-LAMP 반응에서 다중의 프라이머 세트 및 프로브를 통해 형광량에 따른 실시간 검출로 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인하여 비특이적 반응 또는 오염에 의한 위양성을 줄이고, 내부 대조구를 통해 위음성을 배제함으로써 진단의 정확도를 높여 SARS-CoV-2 감염의 진단을 신속·정확하게 수행할 수 있게 하였다.

Description

SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도{Multiplex RT-LAMP composition for diagnosis of SARS-CoV-2 infection and uses thereof}

본 발명은 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)은 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된, 새로운 유형의 코로나바이러스인 SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 호흡기 증후군으로, 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기감염증상이 나타난다. 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스로 지정된 SARS-CoV-2는 외피 바이러스로, 30kb의 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 게놈을 가지며, 베타 코로나 바이러스 속에 속한다. SARS-CoV-2는 4종류의 주요 구조 단백질(S-spike, E-envelope, M-membrane, N-nucleocapsid)과 16종류의 비구조 단백질(NSP 1-16), 5 내지 8 종류의 보조 단백질로 구성되어 있다.

SARS-CoV-2의 팬더믹(pandemic)으로 현재까지 전 세계적으로 누적 확진자는 2억여명, 사망자는 4백여만명에 육박하고 있을 정도로(2021.08.21 기준), SARS-CoV-2는 세계인의 건강에 심각한 위협이 될 뿐만 아니라 사회 안정 및 경제 발전에도 위협이 되고 있다. 이에 많은 연구자들이 SARS-CoV-2의 진단, 예방, 치료를 위한 기술의 개발을 위해 많은 노력을 기울이고 있다.

한편, 한국등록특허 제2281380호에는 'S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 세트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2109196호에는 '2019 신종코로나바이러스 검출용 LAMP 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 'SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 멀티플렉스 RT-LAMP용 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 SARS-CoV-2의 실시간 진단을 위해, SARS-CoV-2의 N 유전자에 특이적인 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)용 프라이머 세트 2개와 인간 β-actin 유전자에 특이적인 RT-LAMP 프라이머 세트 및 상기 RT-LAMP 프라이머 세트에 의해 증폭되는 앰플리콘에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 표지된 프로브를 제작하고, 상기 3개의 프라이머 세트 및 프로프를 단일 튜브에 혼합하여 시료를 증폭하며 실시간으로 형광 신호를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 RT-LAMP 프라이머 세트가 멀티플렉스 RT-LAMP 반응에서 SARS-CoV-2 감염 양성 시료를 정확하게 검출할 수 있으며, 서로 다른 형광 표지된 프로브를 통해 핵산 증폭 반응을 실시간으로 확인함으로써 특이도 및 민감도를 향상시켰으며 내부 대조구(β-actin)를 통해 위음성을 배제함으로써 진단의 정확도를 높일 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1과 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2와 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2; 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3과 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 3;을 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계; 상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 RT-LAMP 조성물은 형광 표지된(fluorephore-labeled) 프로브, 2개의 SARS-CoV-2 N 유전자 특이적 프라이머 세트 및 1개의 인간 베타-액틴 유전자 특이적 프라이머 세트를 포함하고 있어, 등온증폭 반응에서 형광량 측정을 통해 실시간으로 반응을 검출할 수 있어, 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인하여 비특이적 반응 또는 오염에 의한 위양성(false positive) 반응을 해결하였다. 또한, 단일 튜브 내에서 내부 대조구로 사용되는 프라이머 세트 및 표적 특이적 프라이머 세트 총 3개의 프라이머 세트가 서로 간섭없이 등온증폭 반응을 일으켜 표적 핵산의 증폭 여부에 대한 신뢰도를 높여 검출의 정확도를 높였다.

도 1은 SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1)의 N 유전자를 표적으로 하는 2개의 LAMP 프라이머 세트 및 프로브의 위치를 보여준다.
도 2는 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 프라이머 세트와 프로브를 보여준다.
도 3은 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 조성물을 이용하여 비활성화된 SARS-CoV-2를 대상으로 멀티플렉스 등온증폭 반응을 수행한 결과이다.
도 4는 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 조성물을 이용하여 SARS-CoV-2 감염 양성 임상 검체 및 다른 호흡기 감염증 임상 검체를 대상으로 멀티플렉스 등온증폭 반응을 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 조성물을 이용하여 SARS-CoV-2 감염 양성 임상 검체를 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1과 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2와 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2; 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3과 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 3;을 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1 및 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2는 GenBank accession no. NC_045512.2인 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서, 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(N gene, 서열번호 22)에 특이적이고(도 1 참고), 상기 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3은 GenBank accession no. AY582799.1인 Homo sapiens actin, beta (ACTB) gene에 특이적이다.

본 발명에 따른 프라이머 세트 1 내지 프라이머 세트 3은 시료(검체)로부터 핵산을 추출 및 정제하여, 분리된 핵산 특히, RNA를 주형으로 역전사 효소(reverse transcriptase)와 중합효소(polymerase)를 하나의 튜브에 혼합하여 역전사 반응과 고리매개등온증폭 반응이 동시에 일어나도록 수행하는 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 방법에 이용될 수 있고, RNA를 대상으로 역전사 반응을 먼저 수행하여 만들어진 cDNA를 주형으로 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 단독으로 수행하는 방법에도 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, 용어 '고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)'은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.

상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭 반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.

본 발명의 서열번호 1 내지 6; 8 내지 13; 및 15 내지 20;의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 8 및 서열번호 15의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2, 서열번호 9 및 서열번호 16의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3, 서열번호 10 및 서열번호 17의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4, 서열번호 11 및 서열번호 18의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5, 서열번호 12 및 서열번호 19의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LF이고, 서열번호 6, 서열번호 13 및 서열번호 20의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LB이다.

본 발명의 상기 프라이머는, 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5, 6, 8, 9, 12, 13, 15, 16, 19 및 20 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3, 4, 10, 11, 17 및 18 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 7, 서열번호 14 또는 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단과 3' 말단 중 한쪽 말단에는 형광염료가 표지되고, 다른 쪽 말단에는 소광제(quencher)가 표지될 수 있으며, 바람직하게는 5' 말단에는 형광염료가 표지되고, 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것일 수 있고, 각각 프라이머 세트 1 내지 3에 의해 증폭되는 산물에 특이적으로 결합되는 프로브이다(도 2). 상기 형광염료는 이에 한정하지 않으나, FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563, BIOTIN, DIGOXIGENIN 및 NED 등이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 '멀티플렉스(multiplex)'는 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 증폭하는 방법을 의미한다. 종래 LAMP 반응의 핵산 증폭 여부 확인에 있어서 탁도 측정 또는 SYBR Green I과 같은 인터칼레이터를 사용한 형광 측정법은 비특이 증폭 여부를 확인할 수 없으며 동시 다중(multiplex) 핵산 검출이 불가하다는 제한점이 있었으나, 본 발명에서는 하나의 튜브에 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 RT-LAMP용 프라이머 세트 1과 프라이머 세트 2 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 RT-LAMP용 프라이머 세트 3, 그리고 각각의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 특이적으로 결합할 수 있으며 서로 다른 형광염료로 표지된 3개의 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 단일 튜브에서 다중 LMAP 반응을 통해 핵산 검출을 가능하게 하였다.

통상 멀티플렉스 반응에서는 단일 반응 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함되는데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 멀티플렉스 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 세트를 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 간섭(interference) 및 억제(inhibition)가 발생할 수 있으므로, 멀티플렉스 기법에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다. 또한 포함되는 여러 프라이머 세트마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 멀티플렉스 기법 적용시에는 단일 증폭 반응에서 포함되는 프라이머 세트 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 멀티플렉스 증폭에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.

본 명세서에 있어서, 용어 '프라이머'는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트는 전술한 것과 같이, SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 22)에 특이적인, 2개의 프라이머 세트(서열번호 1 내지 6; 및 서열번호 8 내지 13)와, 내부 대조구(internal control)인 인간 베타-액틴(ACTB) 유전자에 특이적 프라이머 세트 3(서열번호 15 내지 20), 및 이들 프라이머 세트 각각에 의해 증폭되는 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 표지된 프로브가 포함되어 있다. 프라이머 세트와 프로브에 관한 자세한 설명은 전술한 것과 같다.

본 발명의 키트에서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응(RT-LAMP)을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 역전사고리매개등온증폭법을 위해 기존의 고리매개등온증폭법(LAMP)에서 주로 사용되어진 Bst 중합효소 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 용해 버퍼를 추가로 포함하며, 상기 용해 버퍼는 바람직하게는 0.05~0.15 %(v/v) Triton X-100, 0.3~0.7 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(proteinase K), 0.1~1.0 %(v/v) Tween 20, 100~200 ng/㎖ 소혈청알부민(bovine serum albumin), 10~20 mM DTT (dithiothreitol), 0.1~0.5 M 수크로스 및 3~7 mM 염화마그네슘을 포함하는 TBE (Tris/Borate/EDTA) 버퍼일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 %(v/v) Triton X-100, 0.5 ㎎/㎖ 프로테이나제 K, 0.5 %(v/v) Tween 20, 200 ng/㎖ 소혈청알부민, 20 mM DTT, 0.3 M 수크로스 및 5 mM 염화마그네슘을 포함하는 TBE 버퍼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 SARS-CoV-2 검출용 키트는 바람직하게는 Direct RT-LAMP용 키트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Direct RT-LAMP용 키트는 임상 시료(검체)를 키트에 포함된 용해 버퍼와 혼합한 후 RT-LAMP 반응을 바로 수행할 수 있어, 시료로부터 핵산을 추출하고 정제하는 단계가 필요한 종래의 LAMP 진단법에 비해, 신속한 진단이 가능한 장점이 있다.

또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계;

상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 검체(코 면봉법(nasal swab))일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료이면 제한되지 않고 사용가능하다.

본 발명의 검출 방법에 따른 시료(예컨대, 코 면봉 시료 또는 분리된 인간 혈액)를 용해 버퍼로 전처리하는 단계는, 바람직하게는 시료와 용해 버퍼를 1:4의 부피비로 혼합하고 5분 이내에 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용해 버퍼는 전술한 것과 같다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법에 있어서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응은 48℃ 내지 52℃에서 1분 내지 3분 동안 전처리 후 60℃ 내지 68℃에서 20분 내지 50분 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 49℃ 내지 51℃에서 1.5분 내지 2.5분 동안 전처리 후 62℃ 내지 66℃에서 20분 내지 30분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50℃에서 2분 동안 전처리 후 63℃에서 25분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법은, FAM 형광염료로 표지된 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프로브, CY5 형광염료로 표지된 서열번호 14의 올리고뉴클페이티드 프로브 및 HEX 형광염료로 표지된 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드 프로브가 각각 프라이머 세트 1과 프라이머 세트 2에 의해 증폭되는 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위 앰플리콘 및 프라이머 세트 3에 의해 증폭되는 인간 β-actin 유전자 부위 앰플리콘에 각각 특이적으로 결합하여 각 형광염료에 따른 형광 수준 측정을 통해 실시간으로 핵산 증폭 결과를 확인할 수 있는 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 검출 방법에 있어서, SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료가 FAM 및/또는 CY5, 그리고 HEX 형광이 확인될 경우, 해당 시료를 SARS-CoV-2 감염 양성으로 결정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. SARS-CoV-2 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 설계

SARS-CoV-2 검출을 위한 역전사고리매개증폭반응(RT-LAMP)용 프라이머 세트 및 프로브를 제작하기 위해, GenBank accession no. NC_045512.2인 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 유전자(N gene)의 정보를 확보하였다. 또한, 등온증폭 반응의 내부 대조구로 사용하기 위해 GenBank accession no. AY582799.1인 Homo sapiens β-actin 유전자의 정보도 확보한 후, OptiGene사의 LAMP Design software를 이용하여 RT-LAMP용 프라이머 세트를 설계하였다. 특히, 본 발명자는 반응의 신뢰도를 높이기 위해 N 유전자 특이적인 프라이머 세트를 2 세트 제작하였다(N1 및 N2 프라이머 세트). N 유전자 특이적인 RT-LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 1에 나타내었다. 또한, 각 프라이머 세트에 의해 증폭되는 SARS-CoV-2의 N 유전자 앰플리콘 및 인간 β-actin 유전자 앰플리콘 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 표지된 프로브를 각각 제작하였다(도 2).

실시예 2. SARS-CoV-2 검출능 분석

제작된 멀티플렉스(multiplex) RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 SARS-CoV-2 검출능을 분석하기 위해, direct RT-LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)를 수행하였다. 사용한 시료는 불활화(inactivated) SARS-CoV-2 (VIRCELL Inc., TOTAL SARS-COV-2 CONTROL (SWAB))를 사용하였다. 또한, COVID-19 음성 환자의 호흡기 스왑(swab) 검체를 음성 대조군으로 사용하였다.

상기 각 시료 50㎕를 본 발명자가 개발한 용해 버퍼 [0.10 %(v/v) Triton X-100, 0.5 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(proteinase K), 0.5 %(v/v) Tween 20, 200 ng/㎖ 소혈청알부민(bovine serum albumin), 20 mM DTT (dithiothreitol), 0.3 M 수크로스 및 5 mM 염화마그네슘, 1x TBE (Tris/Borate/EDTA) 버퍼] 200㎕와 혼합한 후 볼텍싱을 통해 섞어준 후, 상기 혼합액 중 5㎕를 취하여 RT-LAMP 프리믹스 [Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTP 1.5㎕, 10mM MgSO₄ 1㎕, 5M betaine 4㎕, 10X 버퍼 2.5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(20U)], 및 5㎕의 프라이머-프로브 혼합물 [N1 및 N2 프라이머 세트(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LF는 20pmol, LB는 10pmol), β-actin 프라이머 세트(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 20pmol, LF는 2.5pmol), FAM-BHQ₁ N1 프로브 5pmol, CY5-BHQ₁ N2 프로브 5pmol, HEX-BHQ₁ β-actin 프로브 2.5pmol]을 포함하는 총 25㎕의 반응액에서 수행하였다. RT-LAMP 반응은 실시간 PCR 장비(BioRad CFX 96 Real time PCR)를 사용하여 50℃에서 2분 전처리 후 63℃, 25분간 수행하였으며, 형광 신호는 매 1분마다 측정하였다.

그 결과, RT-LAMP 증폭 과정 동안에 음성 대조군(COVID-19 음성 환자의 호흡기 스왑 검체)은 β-actin 증폭에 의해 HEX 형광 신호가 증폭되는 것이 확인되었으나, FAM 및 CY5 형광 신호는 확인되지 않음을 알 수 있었다. 또한, 불활화 SARS-CoV-2 검체(50 바이러스 입자가 인간상피세포와 함께 섞여 있음)에서는 FAM 및 CY5 형광 신호가 증폭되었고 HEX 형광도 증폭되는 것을 알 수 있었다(도 3). 상기 결과를 통해 본 발명의 3개의 RT-LAMP 프라이머 세트가 멀티플렉스용으로 사용가능함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. SARS-CoV-2에 대한 특이도 검증

SARS-CoV-2에 대한 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 분석하기 위해, COVID-19 양성 환자의 호흡기 스왑(swab) 검체(국군의학연구소 진단검사실), 인플루엔자 A (H1N1, H3N2 분리주; 고려대학교 바이러스연구소), 인플루엔자 B(바이러스 분리주, 고려대학교 바이러스연구소), 아데노바이러스 55형(Adenovirus type 55; 임상검체, 사단의무대), 한탄강 한타바이러스(Hantaan orthohantavirus, HTNV; 바이러스 분리주, 고려대학교 바이러스연구소), 서울 한타바이러스(Seoul orthohantavirus, SEOV; 고려대학교 바이러스연구소), 푸말라 한타바이러스(Puumala orthohantavirus, PUUV; 고려대학교 바이러스연구소)를 비교군으로 사용하였다. 증폭반응은 전술한 실시예 2와 동일한 반응 조성 및 조건을 사용하여 RT-LAMP로 수행하였다.

그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이, HEX 형광 신호는 임상 검체인 SARS-CoV-2 및 아데노바이러스 55형에서 확인되었고, FAM 및 CY5 형광 신호는 오직 SARS-CoV-2 시료에서만 증폭되는 것을 알 수 있었다. 이를 통해 본 발명에 따른 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브가 교차 반응 없이 SARS-CoV-2를 특이적으로 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 임상 검체를 이용한 SARS-CoV-2에 대한 특이도 검증

SARS-CoV-2에 대한 본 발명의 멀티플렉스 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 임상 검체를 대상으로 평가하였다. 국군 병원 및 국군의학연구소 진단검사실로부터 제공받은 COVID-19 양성 환자의 호흡기 스왑(swab) 검체와 COVID-19 음성 환자의 호흡기 스왑(swab) 검체를 실험에 사용하였으며, 반응 수행 조건은 실시예 2와 동일하게 진행하였다.

본 발명에 따른 멀티플렉스 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브를 사용한 direct RT-LAMP 반응 결과, COVID-19 음성 환자의 스왑 검체에서는 β-actin 증폭에 의해 HEX 형광 신호만 확인되었으며, COVID-19 양성 환자의 스왑 검체에서는 FAM 및 CY5 형광 신호, 그리고 HEX 형광 신호가 모두 검출되었다(도 5). 이를 통해, 본 발명에 따른 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브가 SARS-CoV-2를 정확하게 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Republic of Korea(Armed Forces Medical Command) <120> Multiplex RT-LAMP composition for diagnosis of SARS-CoV-2 infection and uses thereof <130> PN21293 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_F3_primer <400> 1 tcctgctaac aatgctgc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_B3_primer <400> 2 tcaatctgtc aagcagcag 19 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_FIP_primer <400> 3 aacgagaaga ggcttgactg ctcaaggaac aacattgcca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_BIP_primer <400> 4 ctcatcacgt agtcgcaaca gtattgccag ccattctagc 40 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_LF_primer <400> 5 ccttctgcgt agaagcctt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_LB_primer <400> 6 aattcaactc caggcagca 19 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1_probe <400> 7 ggcttcccct tctgcgtaga agcctt 26 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_F3_primer <400> 8 agtcaagcct cttctcgt 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_B3_primer <400> 9 cttcttagaa gcctcagcag 20 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_FIP_primer <400> 10 gccagccatt ctagcaggag gtagtcgcaa cagttcaaga 40 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_BIP_primer <400> 11 aatggcggtg atgctgctgc tctcaagctg gttcaa 36 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_LF_primer <400> 12 tgctgcctgg agttgaatt 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_LB_primer <400> 13 ttgctgctgc ttgacaga 18 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2_probe <400> 14 tctgtcttgc tgctgcttga caga 24 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_F3_primer <400> 15 ggcatcctca ccctgaagt 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_B3_primer <400> 16 aggccaggaa ggagggag 18 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_FIP_primer <400> 17 tcctcgggag ccacacgcaa tcgagcacgg catcgt 36 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_BIP_primer <400> 18 tgaccgaggc ccccctgaac caccagaaga ggtagcgg 38 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_LF_primer <400> 19 ggtgccagat tttctccatg tc 22 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_LB_primer <400> 20 cgcgagaaga tgacccagg 19 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin_probe <400> 21 cctgggcgcg agaagatgac ccagg 25 <210> 22 <211> 1260 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SARS-CoV-2 <400> 22 atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60 tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120 cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180 aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300 atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360 cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420 acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660 ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780 aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840 caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900 tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960 ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020 gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140 gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200 gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260 1260

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1과 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2와 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2; 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3과 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 3;을 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트로서,
   상기 서열번호 7, 서열번호 14 또는 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단과 3' 말단 중 한쪽 말단에는 형광염료가 표지되고, 다른 쪽 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것을 특징으로 하며,
   상기 키트는 0.05~0.15 %(v/v) Triton X-100, 0.3~0.7 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(proteinase K), 0.1~1.0 %(v/v) Tween 20, 100~200 ng/㎖ 소혈청알부민(bovine serum albumin), 10~20 mM DTT (dithiothreitol), 0.1~0.5 M 수크로스 및 3~7 mM 염화마그네슘을 포함하는 TBE (Tris/Borate/EDTA) 버퍼로 이루어진 용해 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 검출용 키트.
4. 삭제
5. SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계;
   상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1과 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2와 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2; 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 15 내지 20의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 3과 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 3;을 포함하는, 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated Isothermal Amplification) 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 형광 측정을 통해 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법으로서,
   상기 용해 버퍼는 0.05~0.15 %(v/v) Triton X-100, 0.3~0.7 ㎎/㎖ 프로테이나제 K(proteinase K), 0.1~1.0 %(v/v) Tween 20, 100~200 ng/㎖ 소혈청알부민(bovine serum albumin), 10~20 mM DTT (dithiothreitol), 0.1~0.5 M 수크로스 및 3~7 mM 염화마그네슘을 포함하는 TBE (Tris/Borate/EDTA) 버퍼로 이루어진 것을 특징으로 하며,
   상기 서열번호 7, 서열번호 14 또는 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단과 3' 말단 중 한쪽 말단에는 형광염료가 표지되고, 다른 쪽 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것을 특징으로 하며,
   상기 역전사고리매개등온증폭반응은 48℃ 내지 52℃에서 1분 내지 3분 동안 전처리 후, 62℃ 내지 66℃에서 20분 내지 30분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법.
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