KR20220040834A - 분자 비콘 프로브를 포함하는 covid-19 진단 멀티플렉스 lamp 조성물 - Google Patents

분자 비콘 프로브를 포함하는 covid-19 진단 멀티플렉스 lamp 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분자 비콘 프로브를 포함하는 COVID-19 진단 멀티플렉스 LAMP 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 LAMP 핵산 증폭 반응에서 실시간 검출 및 형광량 측정을 통해 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인하여 비특이적 반응 또는 오염에 의한 위양성을 줄이고 저농도로 존재하는 표적 핵산의 증폭 여부를 민감하게 검출할 수 있다.

Description

분자 비콘 프로브를 포함하는 COVID-19 진단 멀티플렉스 LAMP 조성물{Multiplex LAMP composition for diagnosis of COVID-19 comprising molecular beacon probe}
본 발명은 분자 비콘 프로브를 포함하는 COVID-19 진단 멀티플렉스 LAMP 조성물에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)은 2019년 12월 중국 우한에서 처음 발생한 이후 중국 전역과 전 세계로 확산된, 새로운 유형의 코로나바이러스인 SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 호흡기 증후군으로, 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증까지 다양한 호흡기감염증상이 나타난다. 감염되면 약 2~14일(추정)의 잠복기를 거친 뒤 발열(37.5℃) 및 기침이나 호흡곤란 등 호흡기 증상, 폐렴이 주증상으로 나타나지만 무증상 감염 사례도 드물게 확인되고 있다.
우리나라의 경우 COVID-19 발생 초기에는 판 코로나바이러스 검사법(Conventional PCR)과 염기서열분석 일치 여부를 통한 확진 검사를 진행하였다. 이는 의심환자에 대해 코로나바이러스 계열인지 여부(판코로나 검사법)를 확인한 뒤 양성반응이 나오면 환자 검체에서 나온 바이러스 유전자 염기서열을 분석해 검사를 진행하는 것으로, 약 1~2일이 소요됐다. 그러나 1월 31일부터는 SARS-CoV-2만을 타깃으로 하는 새 검사법, 이른바 'RT-PCR'이 개발되면서 질병관리본부(국립인천공항검역소 포함)와 전국 18개 보건환경연구원에서부터 적용됐다. 이 검사법은 판 코로나 검사처럼 코로나바이러스 전체 계열이 아닌 SARS-CoV-2를 특정해 진단하여 검사 6시간 이내에 결과를 확인할 수 있어 COVID-19의 신속한 진단이 가능해졌다.
하지만, 상기 PCR 반응을 위한 온도 조절을 구현하기 위해서는 값비싼 온도 조절 장치가 필수적으로 요구되기 때문에, 대형 병원이나 전문 진단 센터 등 설비가 갖추어진 곳에서만 한정적으로 사용 가능하다는 단점이 있다. 최근 현장검사(point-of-care testing, POCT) 기술 개발에 대한 수요가 증대되면서, 온도 조절 장치를 필요로 하는 PCR 기술의 단점을 해결하여 소형화를 구현할 수 있는 대체 기술에 대한 관심이 높아지고 있다.
한편, 한국공개특허 제2019-0092883호에는 ThIsAmp (Three-way junction structure-induced Isothermal Amplification) 템플릿, ThIsAmp 프라이머 및 표적핵산이 혼성화 반응에 의해 결합되어 형성되는 삼중접합구조를 기반으로 한 '삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1875662호에는 '등온 핵산 증폭을 위한 리포터 염료, 퀀처가 포함되는 등온 기반 이중 기능성 올리고뉴클레오타이드 및 이를 이용한 핵산 증폭과 측정 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 분자 비콘 프로브를 포함하는 COVID-19 진단 멀티플렉스 LAMP 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 COVID-19의 실시간 진단을 위해, SARS-CoV-2의 N 유전자 및 인간 β-actin 유전자에 특이적인 LAMP (loop-mediated isothermal amplification)용 프라이머 세트와 상기 LAMP 프라이머 세트에 의해 증폭되는 앰플리콘에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 표지된 프로브를 제작하고, 상기 2개의 프라이머 세트 및 2개의 프로브를 포함하는 단일 튜브에서 시료를 증폭하며 실시간으로 형광 신호를 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 멀티플렉스 LAMP 조성물이 COVID-19 양성 시료를 정확하게 검출할 수 있으며, 서로 다른 형광 표지된 2개의 프로브를 통해 핵산 증폭 반응을 실시간으로 확인함으로써, 표적 유전서열 특이적인 프브로에 의한 특이도 향상을 통해 위양성을 배제하고 인간 β-actin 내부 대조구 확인을 통해 RNA 추출 및 LAMP 반응을 확인할 수 있어 위음성을 배제함으로써 진단의 정확도를 높일 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2;를 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 LAMP 조성물은 형광 표지된(fluorephore-labeled) 분자 비콘 프로브를 포함하고 있어, LAMP 핵산 증폭 반응에서 실시간 검출 및 형광량 측정을 통해 반응 튜브의 개봉 없이 핵산 증폭 여부를 확인하여 비특이적 반응 또는 오염에 의한 위양성(false positive) 반응을 해결하고 저농도로 존재하는 표적 핵산의 증폭 여부를 민감하게 검출할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)의 N 유전자를 표적으로 하는 LAMP 프라이머 세트와 분자 비콘 프로브를 보여준다.
도 2는 인간 β-actin 유전자를 표적으로 하는 LAMP 프라이머 세트와 분자 비콘 프로브를 보여준다.
도 3은 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) LAMP 조성물을 이용한 SARS-CoV-2 합성 DNA를 이용한 검출한계 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) LAMP 조성물을 이용한 임상 검체의 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) LAMP 조성물을 이용한 COVID-19 양성 임상 검체 및 다른 호흡기 감염증 임상 검체의 분석 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2;를 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1은 GenBank accession no. MN908947.3인 Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 N 유전자에 특이적이고(도 1 참고), 상기 서열번호 8 내지 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2는 GenBank accession no. AY582799.1인 Homo sapiens actin, beta (ACTB) gene에 특이적이다(도 2 참고).
본 발명에 따른 프라이머 세트 1 및 프라이머 세트 2는 시료(검체)로부터 핵산을 추출 및 정제하여, 분리된 핵산 특히, RNA를 주형으로 역전사 효소(reverse transcriptase)와 중합효소(polymerase)를 하나의 튜브에 혼합하여 역전사 반응과 고리매개등온증폭 반응이 동시에 일어나도록 수행하는 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 방법에 이용될 수 있고, RNA를 대상으로 역전사 반응을 먼저 수행하여 만들어진 cDNA를 주형으로 이용하여 고리매개등온증폭 반응을 단독으로 수행하는 방법에도 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 용어 '고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)'은 기존 PCR(polymerase chain reaction) 법과 달리 등온의 조건에서 증폭 반응을 수행할 수 있는 방법을 의미한다. LAMP 반응을 위해서는 기본적으로 4종의 프라이머(F3, B3, FIP, BIP)가 필요하고, 반응 속도를 향상시키기 위해 2종의 프라이머(LF, LB)를 추가하여 최종 6종의 각기 다른 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머가 반응에 필요하다.
상기 4종의 기본 프라이머는 외부(outer) 프라이머 2종과 내부(inner) 프라이머 2종으로 구성되며, 외부 프라이머는 정방향 외부(forward outer, F3) 프라이머와 역방향 외부(backward outer, B3) 프라이머 2종으로 구성되고 반응의 비순환기(non-cyclic step) 동안 DNA 이중 가닥을 풀어주는 역할을 한다. 내부 프라이머는 정방향 내부 프라이머(forward inner primer, FIP)와 역방향 내부 프라이머(backward inner primer, BIP) 2종으로 구성되고 고리매개 등온증폭 반응에 필수적인 고리(loop)를 만들 수 있도록 정방향 및 역방향 염기서열에 해당하는 뉴클레오티드로 구성된다. 추가 2종의 프라이머는 정방향 고리(forward loop, LF) 프라이머와 역방향 고리(backward loop, LB) 프라이머 2종으로 구성되며 내부(inner) 프라이머가 결합하지 않는 염기서열에 부착하여 고리매개등온증폭 반응을 가속화시킨다.
본 발명의 서열번호 1 내지 6; 및 8 내지 12;의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 8의 프라이머는 정방향 외부 프라이머인 F3이고, 서열번호 2 및 서열번호 9의 프라이머는 역방향 외부 프라이머인 B3이고, 서열번호 3 및 서열번호 10의 프라이머는 정방향 내부 프라이머인 FIP이며, 서열번호 4 및 서열번호 11의 프라이머는 역방향 내부 프라이머인 BIP이며, 서열번호 5 및 서열번호 12의 프라이머는 정방향 고리 프라이머인 LF이고, 서열번호 6의 프라이머는 역방향 고리 프라이머인 LB이다.
본 발명의 상기 프라이머는, 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 5, 6, 8, 9 및 12 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 서열번호 3, 4, 10 및 11 내의 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 멀티플렉스(multiplex) 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 7 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단과 3' 말단 중 한쪽 말단에는 형광염료가 표지되고, 다른 쪽 말단에는 소광제(quencher)가 표지될 수 있으며, 바람직하게는 5' 말단에는 형광염료가 표지되고, 3' 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것일 수 있고, 각각 프라이머 세트 1에 의해 증폭되는 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위 및 프라이머 세트 2에 의해 증폭되는 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적으로 결합되는 프로브이다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단에 FAM (Fluorescein amidites), 3' 말단에 BHQ1 (Black Hole Quencher-1)이 표지되어 있으며, 1~6번째 염기('TGCTGC')가 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루어 BHQ1에 의해 FAM 형광이 나타나지 않다가, 등온증폭 반응 단계에서 온도 상승에 따라 스템-루프 구조가 깨지면서 프라이머 세트 1에 의해 증폭되는 앰플리콘(amplicon)에 결합되며 FAM 형광이 나타나도록 설계된 것이다. 또한, 상기 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단에 HEX (Hexachloro-fluorescein), 3' 말단에 BHQ1이 표지되어 있으며, 1~6번째 염기('CCTGGG')가 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루어 BHQ1에 의해 HEX 형광이 나타나지 않다가, 등온증폭 반응 단계에서 온도 상승에 따라 스템-루프 구조가 깨지면서 프라이머 세트 2에 의해 증폭되는 앰플리콘에 결합되며 HEX 형광이 나타나도록 설계된 것이다.
본 명세서에서 용어 '멀티플렉스(multiplex)'는 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 증폭하는 방법을 의미한다. 종래 LAMP 반응의 핵산 증폭 여부 확인에 있어서 탁도 측정 또는 SYBR Green I과 같은 인터칼레이터를 사용한 형광 측정법은 비특이 증폭 여부를 확인할 수 없으며 동시 다중(multiplex) 핵산 검출이 불가하다는 제한점이 있었으나, 본 발명에서는 하나의 튜브에 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 RT-LAMP용 프라이머 세트 1 및 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 RT-LAMP용 프라이머 세트 2와, 각각의 프라이머 세트에 의해 증폭되는 산물에 특이적으로 결합할 수 있으며 서로 다른 형광염료로 표지된 프로브를 포함하는 조성물을 이용하여 단일 튜브에서 다중 핵산 검출을 가능하게 하였다.
본 명세서에 있어서, 용어 '프라이머'는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물은 역전사고리매개등온증폭을 위한 프라이머 세트와 프로브를 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 역전사고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하며, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 역전사 효소, DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 DNA 중합효소는 Bst 중합효소일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 역전사고리매개등온증폭법을 위해 기존의 고리매개등온증폭법에서 주로 사용되어진 Bst 중합효소 대신 보다 빠른 증폭 능력과 강력한 역전사효소능을 가지고 있는 GspSSD DNA 중합효소 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법에 있어서, 상기 생물학적 시료는 예를 들면, 채취한 인간의 검체(코 면봉법(nasal swab))일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료이면 제한되지 않고 사용가능하다. 또한, 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 또는, 분리된 생물학적 시료를 0.1~1.5 %(v/v)의 Triton X-100을 포함하는, pH 6.0~7.0의 30~500 mM Tris로 이루어진 용해 버퍼와 반응시켜 총 RNA를 분리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법에 있어서, 상기 역전사고리매개등온증폭 반응은 단일 튜브에 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2;를 특정 농도로 혼합한 후, 60~68℃에서 15분 내지 25분 동안 수행되는 것일 있고, 바람직하게는 64℃에서 20분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2의 실시간 검출 방법은, FAM 형광염료로 표지된 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프로브 및 HEX 형광염료로 표지된 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 프로브가 프라이머 세트 1에 의해 증폭되는 SARS-CoV-2의 N 유전자 부위 앰플리콘 및 프라이머 세트 2에 의해 증폭되는 인간 β-actin 유전자 부위 앰플리콘에 각각 특이적으로 결합하여 각 형광염료에 따른 형광 수준 측정을 통해 실시간으로 핵산 증폭 결과를 확인할 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 검출 방법에 있어서, SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료가 FAM과 HEX 형광 모두 확인될 경우, 해당 시료를 SARS-CoV-2 감염 양성으로 결정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SARS-CoV-2 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 설계
SARS-CoV-2 검출을 위한 역전사고리매개증폭반응(RT-LAMP)용 프라이머 세트 및 프로브를 제작하기 위해, GenBank accession no. MN908947.3인 Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1, complete genome에서 N 유전자의 정보를 확보하였다. 또한, 등온증폭 반응의 내부 대조구로 사용하기 위해 GenBank accession no. AY582799.1인 Homo sapiens β-actin 유전자의 정보도 확보한 후, OptiGene사의 LAMP Design software를 이용하여 RT-LAMP용 프라이머 세트를 설계하였다. 각 RT-LAMP 프라이머 서열의 위치는 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같다. 또한, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 SARS-CoV-2의 N 유전자 앰플리콘 및 인간 β-actin 유전자 앰플리콘 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 형광 표지된 프로브를 각각 제작하였다(도 1 및 도 2).
실시예 2. SARS-CoV-2 검출능 분석
2-1. 합성 주형을 사용한 검출 한계 분석
제작된 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 SARS-CoV-2 검출능을 분석하기 위해, RT-LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)를 수행하였다. 사용한 시료는 SARS-CoV-2의 서열(MN908947.3)의 1~855nt를 합성한 후 base pair 및 핵산량을 계산하여 카피 수를 환산한 후 사용하였다. 또한, COVID-19 음성 환자의 호흡기 스왑(swab) 검체에서 추출한 총 RNA 시료(internal control)를 대조군으로 사용하였다.
RT-LAMP 반응은 5㎕의 주형 RNA, 15㎕의 LAMP 프리믹스[Bst 폴리머라제 1㎕(8U), 10×buffer 2.5㎕, 25mM dNTP 1.5㎕, 10mM MgSO4 1㎕, 5M betaine 4㎕, 10X 버퍼 2.5㎕, Reverse Transcriptase 0.1㎕(20U)], 및 5㎕의 프라이머-프로브 혼합물[N 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 40pmol, LF는 20pmol, LB는 10pmol), β-actin 프라이머(F3 및 B3는 각각 5pmol, FIP 및 BIP는 각각 20pmol, LF는 2.5pmol), FAM-BHQ1 N 유전자 프로브 5pmol, HEX-BHQ1 β-actin 프로브 2.5pmol]을 포함하는 총 25㎕의 반응액에서 수행하였다. RT-LAMP 반응은 실시간 PCR 장비(BioRad CFX 96 Real time PCR)를 사용하여 64℃, 20분간 수행하였으며, 형광 신호는 매 30초마다 측정하였다.
그 결과, RT-LAMP 증폭 과정 동안에 COVID-19 음성 환자의 호흡기 스왑 검체에서 추출한 총 RNA 시료를 포함하는 대조군은 β-actin 증폭에 의해 HEX 형광 신호가 증폭되는 것이 확인되었으나, FAM 형광 신호는 확인되지 않음을 알 수 있었다. 또한, 합성한 SARS-CoV-2 N 단편만을 주형으로 포함하고 있던 101, 102, 103 카피 시료에서는 FAM 형광 신호는 증폭되었으나, HEX 형광 증폭은 일어나지 않음을 확인할 수 있었으며, SARS-CoV-2의 101 카피까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 3).
2-2. 임상 시료를 사용한 검출능 분석
합성 주형이 아닌 실제 임상 시료를 통해 본 발명의 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브의 SARS-CoV-2 검출능을 분석하였다. SARS-CoV-2 감염 임상검체 및 비감염 임상검체는 국군 수도병원 및 군군의학연구소 진단검사실로부터 제공받아 사용하였다. SARS-CoV-2 감염 환자 및 COVID-19 음성 환자로부터 코 면봉법(nasal swab)으로 획득한 시료 50㎕에서 총 RNA를 추출한 뒤, 이를 주형으로 사용하여 상기 실시예 2-1과 동일한 조성으로 반응물을 제조한 뒤 동일한 조건으로 RT-LAMP 반응을 수행하였다. 실시간으로 등온증폭 산물의 결과를 확인하기 위해, BioRad CFX 96 Real time PCR 기기를 사용하였고, 형광 신호는 매 30초마다 측정하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 SARS-CoV-2 감염 환자 및 COVID-19 음성 환자 시료 모두 β-actin 증폭에 의해 HEX 형광 신호가 증폭되는 것이 확인되었으나, COVID-19 음성 환자 시료의 경우 FAM 형광 신호가 증폭되지 않는 것이 확인되었고, SARS-CoV-2 감염 시료(positive clinical smaple 1, 2)에서만 FAM 형광 신호가 증폭되는 것이 확인되었다.
실시예 3. SARS-CoV-2에 대한 특이도 검증
SARS-CoV-2에 대한 본 발명의 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브의 특이도를 분석하기 위해, COVID-19와 유사한 임상 증상(기침 및/또는 발열)을 유발하는 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 마이코플라즈마 뉴모니에(Mycoplasma pneumonia), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus Influenzae), 아데노바이러스 55형(Adenovirus type 55), 말라리아 또는 인플루엔자 A 감염 임상 검체(호흡기 검체)를 국군 병원(수도, 양주, 고양, 포천병원) 및 사단의무대로부터 제공받아 비교군으로 사용하였다. 각각의 임상 검체로부터 총 RNA를 추출한 후, 전술한 실시예 2-1.과 동일하게 반응물을 제조하고 동일한 반응 조건으로 등온 증폭을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이, DEPC만 첨가한 음성 대조군을 제외한 모든 실험군에 HEX 형광 신호가 반응 진행 동안에 증폭되는 것이 확인되었으나, FAM 형광 신호는 오직 COVID-19 양성 시료에서만 증폭되는 것을 알 수 있었다. 특히, COVID-19 양성 시료는 다른 임상 검체 비교군에 비해 HEX 형광 신호가 낮은 수준으로 확인되었으나, FAM 형광 신호는 명확하고 높은 수준으로 증폭되는 것이 확인되어, 본 발명에 따른 RT-LAMP 프라이머 세트 및 프로브가 SARS-CoV-2를 정확하게 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Republic of Korea(The Armed Forces Medical Command) <120> Multiplex LAMP composition for diagnosis of COVID-19 comprising molecular beacon probe <130> PN20264 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcctgctaac aatgctgc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcaatctgtc aagcagcag 19 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aacgagaaga ggcttgactg ctcaaggaac aacattgcca 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcatcacgt agtcgcaaca gtattgccag ccattctagc 40 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccttctgcgt agaagcctt 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aattcaactc caggcagca 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 7 tgctgcaatt caactccagg cagca 25 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggcatcctca ccctgaagt 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aggccaggaa ggagggag 18 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcctcgggag ccacacgcaa tcgagcacgg catcgt 36 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgaccgaggc ccccctgaac caccagaaga ggtagcgg 38 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgcgagaaga tgacccagg 19 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 cctgggcgcg agaagatgac ccagg 25

Claims (5)

  1. SARS-CoV-2의 N 유전자 부위에 특이적인 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 1; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 1; 인간 β-actin 유전자 부위에 특이적인 서열번호 8 내지 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 2; 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브 2;를 포함하는, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스(multiplex) 역전사고리매개등온증폭(Reverse transcriptional Loop-mediated isothermal amplification)용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 7 또는 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단과 3' 말단 중 한쪽 말단에는 형광염료가 표지되고, 다른 쪽 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 키트.
  4. SARS-CoV-2 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 멀티플렉스 역전사고리매개등온증폭용 조성물을 이용하여 역전사고리매개등온증폭 반응으로 표적서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 SARS-CoV-2를 실시간으로 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 형광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117327822A (zh) * 2023-11-16 2024-01-02 河南中检食安生物科技有限公司 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒

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