CN117327822A - 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测汉赛巴通体的引物组、试剂盒。该用于检测汉赛巴通体的引物组，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、内引物FIP以及内引物BIP；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。本发明采用环介导等温扩增，扩增温度为63℃，扩增时间为60min，扩增时间短、节约扩增时间，同时，检测时对仪器的性能要求低，降低了检测成本。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒。
背景技术
汉赛巴通体是1990年从HIV感染者血液中首次分离得到的一种病原体，是一种呈世界性分布的重要人兽共患病原体，传染源主要为猫和狗，尤其是幼猫。90％以上的患者与猫或狗有接触史，75％的病例有被猫或狗抓伤、咬伤的历史，猫口腔、咽部的病原体经伤口或通过其污染的毛皮、脚爪侵入而传播，多发于学龄前儿童及青少年。病原体从抓伤处进入体内，局部皮肤出现丘疹或脓疱，继而发展为以局部引流淋巴结肿大为特征的临床综合征，出现发热、厌食、肌痛、脾肿大等症状。常见的临床并发症是结膜炎伴耳前淋巴结肿大，同时可能会引起免疫功能低下的患者发生杆菌性血管瘤，主要表现为皮肤损害和内脏器官小血管增生，主要可见于HIV感染者、肿瘤或器官移植的病人。
目前汉赛巴通体的检验主要通过组织病理学检查、新鲜组织标本培养和PCR法。其中组织病理学检查步骤繁琐，时间长，对技术人员要求高，同时需要一些精密仪器。培养法需要至少几周来培养，时间久，花费大。荧光定量PCR法是一种分子生物学诊断方法，准确度高、特异性强，通量高，但需要使用专业的仪器和操作人员，同时对检测环境具有较高要求，不利于推广使用。随着经济形势的发展，养宠物者增多，引起汉赛巴通体病例增加，因此一种快速、稳定、灵敏度高的检测手段是迫切需要的。
环介导等温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术，借助4～6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，检测全过程只需要在60～65℃条件下扩增40～60min，具有操作简单、反应时间短等特点，对仪器、人员、实验环境要求低。环介导等温扩增技术结果判定方法主要有：1、反应后肉眼观察是否存在白色沉淀；2、显色法，加入HNB、酚红、甲酚等，反应结束后在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色；3、荧光检测法，向反应体系中加入荧光染料SYBRGreen，通过荧光PCR仪观察体系中荧光变化，生成荧光曲线。申请公布号为CN104988143A的发明专利公开了一种快速鉴定恙虫病立克次体的LAMP引物组、试剂盒及方法，该快速鉴定恙虫病立克次体的方法，利用用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP特异性引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应，反应结束后加入显色剂SYBRGREENⅠ，通过颜色变化判断是否为恙虫病立克次体。但无论是肉眼观察的浊度、显色法还是荧光染料SYBR Green均存在一定的人为主观判定造成的假阴性和非特异性扩增造成的假阳性风险。
分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。当样本中存在靶基因扩增时，分子信标打开，释放出荧光信号，分子信标具有高度特异性和灵敏度，降低假阳性风险。本发明通过汉赛巴通体保守序列16-23srRNA基因，并通过NCBIblast筛选出汉赛巴通体特异性保守序列，以此序列为靶基因给出一组特定的汉赛巴通体等温扩增引物及分子信标序列。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于检测汉赛巴通体的引物组。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测汉赛巴通体的试剂盒，该用于检测汉赛巴通体的试剂盒检测灵敏度高、特异性好。
为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：用于检测汉赛巴通体的引物组，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、内引物FIP以及内引物BIP；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步的，所述引物组根据汉赛巴通体的特异性保守序列设计，所述汉赛巴通体的特异性保守序列位于汉赛巴通体16S-23SrRNA序列，全长650bp，所述汉赛巴通体的特异性保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
用于检测汉赛巴通体的试剂盒，包含上述的引物组。
进一步的，还包含以下成分：Buffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱、AMV逆转录酶、BSTDNA聚合酶、阳性对照以及分子信标探针；所述Buffer的终浓度的为1X；dNTP的终浓度为1～1.4mmoL；MgSO4的终浓度为4～8mmoL；甜菜碱的终浓度为0.4～0.8moL；AMV逆转录酶的终浓度为0.08～0.2U/uL；BST DNA聚合酶的终浓度为0.32～0.48U/uL；所述阳性对照为含有汉赛巴通体的质粒。
进一步的，所述dNTP的终浓度为1.4mmoL；所述MgSO4的终浓度为6mmoL；甜菜碱的终浓度为0.8moL；AMV逆转录酶的终浓度为0.08U/uL；BSTDNA聚合酶的终浓度为0.32U/uL。
进一步的，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述分子信标探针的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团。
进一步的，所述发光基团为FAM、VIC、TET中的一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ、Dabcyl中的一种。
进一步的，所述分子信标探针全长38bp，环结构长度为28bp，茎结构长度为5bp；所述分子信标探针的环结构的Tm值高于茎结构的Tm值以便所述分子信标探针优先特异地与目的片段结合。
进一步的，所述外引物、环引物、内引物以及分子信标探针的终浓度比为0.2～0.4umoL：0.4～0.8umoL：1.6～2.4umoL：0.4～0.8umoL。
本发明的有益效果：
立克次体是一类细胞内寄生的原核细胞型微生物，种类多，包括莫氏立克次体、羌虫病东方体、汉赛巴通体、贝氏柯克斯体、斑点热群立克次体等，它们基因序列具有高度同源性，靶序列选择不当，往往造成检测结果的不准。本发明的选用汉赛巴通体的特异性保守序列来设计引物组和分子信标探针，该特异性保守序列是汉赛巴通体的标志基因，使得所设计的引物组具有良好的特异性，和其它菌种无交叉反应。
本发明采用环介导等温扩增，扩增温度为60～65℃，扩增时间为30～60min，扩增时间短、节约扩增时间，同时，检测时对仪器的性能要求低，降低了检测成本。
本发明的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，包括六条扩增引物，只有当六条引物引物均与靶基因结合时，才能起始扩增，特异性高，同时本发明采用分子信标进行信号检测，只有等温扩增反应的扩增体系发生特异性扩增，分子信标茎结构打开时，才会出现荧光信号，该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、无假阳性的优点。
本发明检测汉赛巴通体是基于分子信标的等温扩增技术，既具有等温扩增快速、简单，不需要精密仪器的优点，又具有分子信标高特异性的优势，整个过程操作简单，检测时间短，特异性高，大大降低了常规LAMP SYBR Green染料法、LFD法易造成假阳性和气溶胶污染的风险。
附图说明
图1为本发明的用于检测汉赛巴通体的试剂盒可行性荧光检测图；
图2为本发明的用于检测汉赛巴通体的试剂盒灵敏度检测图；
图3为本发明的用于检测汉赛巴通体的试剂盒特异性检测。
图中：460A1、汉赛巴通体阳性对照；460C1、汉赛巴通体阴性对照；460C2、空白对照；460B1、普氏立克次体；460B2、莫氏立克次体；460B3、羌虫病东方体；460B4、贝氏柯克斯体；460B5、斑点热群立克次体；460B6、金黄色葡萄球菌；460B7、大肠杆菌O157的基因组DNA；460B8、人血浆DNA。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例的用于检测汉赛巴通体的引物组是根据汉赛巴通体的保守基因设计的，根据GeneBank公布的汉赛巴通体全基因组序列，利用NCBI blast对多株汉赛巴通体及其他立克次体全基因组序列进行比对，确定汉赛巴通体特有的特异性保守序列，该特异性保守序列位于汉赛巴通体16S-23SrRNA序列，全长650bp，该特异性保守序列的核苷酸序列如SEQID NO.1。根据特异性保守序列的核苷酸序列，利用专用引物设计软件Primer及VectorNTI设计汉赛巴通体等温扩增引物组及分子信标探针，引物组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、内引物FIP以及内引物BIP。外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。本发明中所选用的分子信标探针全长38bp，其中环结构长度28bp，茎结构长度5bp。分子信标探针环结构无二级结构，环结构的Tm值比茎结构的Tm值高7℃，分子信标探针的茎结构使得5’端发光基团与3’端淬灭基团相抵，由于分子信标探针的环结构的Tm值比茎结构的Tm值高，分子信标探针优先特异地与目的片段相结合。当样本中存在靶基因，在环介导等温扩增过程中将产生大量靶基因，从而引发分子信标探针茎结构的打开，发射荧光信号，提高检测的特异性，能够更准确地检测出目标片段。分子信标探针5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，发光基团为FAM，3’端淬灭基团为Dabcyl。
SEQ NO.1：
CTTCGTTTCTCTTTCTTCAGATGATGATCCCAAGCCTTCTGGCGATCTAGACAAAACAAGTCCACCGTGGGCTTTGAAAAACGCTTTCCTTGATAAAATTTAAGCGTTTTATAAGAGGATGCCCGGGAAGGTTTTCCGGTTTATCCCGGAGGGCTTGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCGCGCGCTTGATAAGCGTGAGGTCGGAGGTTCAAGTCCTCCCAGGCCCACCAGTTTATCCATTACTTTCATAAGTGCTTTTAAAAAATAAGTACTTCTAAAAAGATTGCTTCTAAAAAGCTTATCAAAATTGGCAGGCTTATTGCTTTTGTGTGAGTAATCCAAAGTTAAAGCAAATTAATGGCAAAAAAACAGTTCAAATGCTAAATACTAAGGAGTCAAAATTCCTTGCAAAGTGATTTTTACAGCGTCCATTTGGTTGATATAAATTCCAAATGCTCATAGACGTCAATGCCTATATGAAACTATCGGTTCAATCATATCGCTTTGAGTTATATAGATTTTGTAATCCCTCTTTTGATCGTTTTAAACGCTTTATCCTGATTTAGGGGCCGTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTGCTTTGCAAGCAGGGGGTCGTCGGTTCGATCCCGTCCGGCTCCACCATAAGGTCATCAT
SEQ NO.2:
F3:GATGATCCCAAGCCTTCT
SEQ NO.3:
B3:AAAGTAATGGATAAACTGGTGG
SEQ NO.4:
FIP:CGGGCATCCTCTTATAAAACGCTTA-GGCGATCTAGACAAAACAAG
SEQ NO.5:
BIP:AAGGTTTTCCGGTTTATCCCGG-TTGAACCTCCGACCTCAC
SEQ NO.6:
LF：TCAAAGCCCACGGTGGA
SEQ NO.7:
LB：GGGCTTGTAGCTCAGTTGGT
SEQ NO.8:
分子信标探针：FAM-CCAGGTTTAAGCGTTTTATAAGAGGATGCCCGGCCTGG-Dabcyl
本实施例的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，包括上述引物组及扩增体系；阳性对照为含有汉赛巴通体的质粒。
本实施例的等温扩增反应的扩增体系如表1所示。
表1等温扩增反应的扩增体系
荧光曲线判定
将等温扩增反应的扩增体系在63℃下，30s一次循环，循环末尾收集荧光信号，循环120次，反应时间为60min，荧光检测图如图1所示。从图1中可与看出，当存在有效扩增时，汉赛巴通体阳性对照出现典型的扩增曲线，证实分子信标检测的可行性。
实施例2
灵敏度检测
将汉赛巴通体质粒阳性对照进行十倍梯度稀释后，稀释梯度为106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、101copies/mL，按照实施例1样本处理和等温扩增反应的扩增体系对各稀释度汉赛巴通体样本建立LAMP检测，以确定检测方法的灵敏度，结果如图2所示。
由图2可以看出，将汉赛巴通体质粒阳性对照进行十倍梯度稀释后，建立的汉赛巴通体的试剂盒灵敏度可达到102copies/mL。
实施例3
特异性检测
将汉赛巴通体分别和普氏立克次体、莫氏立克次体、羌虫病东方体、贝氏柯克斯体、斑点热群立克次体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157的基因组DNA、人血浆DNA、空白对照为模板的基因组DNA，按照实施例1等温扩增反应的扩增体系和条件进行特异性实验，实验结果如图3所示。图3结果表明，只有汉赛巴通体对应的反应体系出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。
Claims (9)
1.用于检测汉赛巴通体的引物组，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物LB、内引物FIP以及内引物BIP；其特征在于，所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测汉赛巴通体的引物组，其特征在于，所述引物组根据汉赛巴通体的特异性保守序列设计，所述汉赛巴通体的特异性保守序列位于汉赛巴通体16S-23SrRNA序列，全长650bp，所述汉赛巴通体的特异性保守序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，还包含以下成分：Buffer、dNTP、MgSO4、甜菜碱、AMV逆转录酶、BST DNA聚合酶、阳性对照以及分子信标探针；所述Buffer的终浓度的为1X；dNTP的终浓度为1～1.4mmoL；MgSO4的终浓度为4～8mmoL；甜菜碱的终浓度为0.4～0.8moL；AMV逆转录酶的终浓度为0.08～0.2U/uL；BST DNA聚合酶的终浓度为0.32～0.48U/uL；所述阳性对照为含有汉赛巴通体的质粒。
5.根据权利要求4所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，所述dNTP的终浓度为1.4mmoL；所述MgSO4的终浓度为6mmoL；甜菜碱的终浓度为0.8moL；AMV逆转录酶的终浓度为0.08U/uL；BST DNA聚合酶的终浓度为0.32U/uL。
6.根据权利要求4所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述分子信标探针的5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团。
7.根据权利要求6所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，所述发光基团为FAM、VIC、TET中的一种，所述淬灭基团为TAMRA、BHQ、Dabcyl中的一种。
8.根据权利要求6所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，所述分子信标探针全长38bp，环结构长度为28bp，茎结构长度为5bp；所述分子信标探针的环结构的Tm值高于茎结构的Tm值以便所述分子信标探针优先特异地与目的片段结合。
9.根据权利要求4所述的用于检测汉赛巴通体的试剂盒，其特征在于，所述外引物、环引物、内引物以及分子信标探针的终浓度比为0.2～0.4umoL：0.4～0.8umoL：1.6～2.4umoL：0.4～0.8umoL。
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