CN104988143A - 一种快速鉴定恙虫病立克次体的lamp引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测恙虫病立克次体的引物组、试剂盒及方法。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、逆转录酶、对照和显色剂。其检测方法是通过提取待检病原体RNA，利用逆转录酶的逆转录活性，采用六条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品RNA模板进行扩增，加入显色剂观察反应管内的颜色变化来判断扩增与否。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测与鉴定，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定恙虫病立克次体的方法。
背景技术
恙虫病，又称为丛林斑疹伤寒，是由恙虫病立克次体导致的疾病，是中国最早发现的感染性疾病之一。恙虫病立克次体呈短杆状，平均长度1.2um，常见成双排列，寄居于恙螨，并可经卵传代。恙螨幼虫需吸取人或动物的淋巴液或血液完成从幼虫到稚虫的发育过程，叮咬机体后可引起畏寒、发热、叮咬处有焦痂或溃疡、淋巴结肿大、结膜充血、皮疹等临床症状。 恙虫病广泛流行于我国，根据流行时间，可分为夏季型和秋冬型。夏季型主要分布于南方广东、广西、海南等省份，秋冬型主要流行于江苏、山东等地。恙虫病为散发性的自然疫源性疾病，自1986年以来，恙虫病由主要在南方流行呈现逐渐向北方扩增的流行态势。
恙虫病感染者早期的临床症状与登革热、疟疾、伤寒等热带病极为相似。目前针对恙虫病的病原培养性检测比较困难，常规的血清学分型又有检测耗时长且特异性、灵敏性差等缺点。荧光PCR等核酸检测方法，虽然提高了检测的灵敏度和特异性，但需要昂贵的仪器设备。以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的诊断价值，但由于其各自的缺点未能在临床上大规模使用。环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速鉴定恙虫病立克次体。
发明内容
本发明的目的在于提供一组用于快速检测恙虫病立克次体的特异性引物，及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速鉴定恙虫病立克次体的方法。本鉴定方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
用于快速鉴定恙虫病立克次体的特异性引物组，其特征在于，包括：
内引物1：5’- TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’- TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’- TTGATCTGAGTATGATTGTCGG -3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3’（SEQ ID No.4）；
环引物1：5’- GCAACCATACCTGTATGCC-3’ （SEQ ID No.5）；
环引物2：5’- ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3’ （SEQ ID No.6）。
一种用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其含有上述的RT-LAMP特异性引物组。
所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为8：1：4。
所述用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒还包括以下成分：逆转录酶；（3）DNA聚合酶； RT-LAMP反应液；显色剂；阳性对照和阴性对照。
所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM 甜菜碱，四者的体积比为6～8：4～5：2～3：8～10。
所述显示剂为SYBR GREENⅠ。
所述阳性对照为含有恙虫病立克次体保守序列的基因片段（SEQ ID NO.7）的质粒，阴性对照为DEPC水。
一种快速鉴定恙虫病立克次体的方法，具体包括如下步骤：
（1）提取模板RNA；
（2）利用上述特异性引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应；
（3）结果判断：在上述反应管中加入2μL显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为恙虫病立克次体，橙色则为非恙虫病立克次体。
环介导等温基因扩增反应的25μL反应体系含有：内引物1、2各8pmol/μL，外引物1、2各1 pmol/μL，环引物1、2各4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μL；环介导等温基因扩增反应的条件为：60～65℃反应30～40min。
本发明的有益效果在于：本发明针对恙虫病立克次体TSA56区域特异性设计了6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性。本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴定恙虫病立克次体，且不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。
附图说明
图1为本发明RT-LAMP试剂盒的阴性与阳性对照品的检测结果（－：阴性对照，＋：阳性对照）；
图2为本发明对恙虫病立克次体以及对非恙虫病立克次体的扩增结果（－：阴性样品，＋：阳性样品，1：非恙虫病立克次体样本，2：恙虫病立克次体样品）
图3为实施例2的特异性验证结果（1：阴性，2：O. Tsutsugamushi，3：Rickettsia prowazekii，4：Rickettsia mooseri，5：Rickettsia rickettsii，6：YFV，7：JEV，8：HSV，9：EBV，10：DENV 2 ）；
图4为实施例3的灵敏度实验结果（a：普通PCR扩增结果，b: Real-time PCR扩增结果，c: 本发明RT-LAMP扩增的凝胶电泳结果，d:本发明RT-LAMP扩增的Real-time结果，e: 本发明RT-LAMP扩增的显色结果 1:DEPC，2～8:含有恙虫病立克次体特异性TSA56基因1.0、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106 拷贝/μL）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒的建立
用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，包括以下成分：（1）特异性引物组；（2）逆转录酶；（3）DNA聚合酶；（4）RT-LAMP反应液；（5）显色剂；（6）阳性对照和阴性对照。
（1）特异性引物的设计：
根据恙虫病立克次体（GenBank登录号为：GU446621.1）的特异性区域设计6条特异性引物，序列分别如下：
内引物1：5’- TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’- TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’- TTGATCTGAGTATGATTGTCGG -3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3’（SEQ ID No.4）；
环引物1：5’- GCAACCATACCTGTATGCC-3’ （SEQ ID No.5）；
环引物2：5’- ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3’ （SEQ ID No.6）；
（2）逆转录酶为AMV逆转录酶；
（3）DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
（4）RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM 甜菜碱，四者的体积比为8：5：3：10。
（5）显示剂为SYBR GREENⅠ。
（6）阳性对照为含有恙虫病立克次体基因片段（SEQ ID NO.7）的pMD-19T质粒（利用常规的质粒构建方法将SEQ ID NO.7插入pMD-19T质粒中得到）。阴性对照为DEPC水。
阳性对照和阴性对照的扩增结果见图1。
实施例2 恙虫病立克次体的检测方法
（1）提取模板RNA。
（2）利用实施例1的特异性引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应：
25μL反应体系含有：内引物1、2终浓度各为8pmol/μL，外引物1、2终浓度各为1 pmol/μL，环引物1、2终浓度各为4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检RNA 50ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μL；环介导等温基因扩增反应的条件为：63℃反应40min。
（3）结果判断：在上述反应管中加入2μL显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为恙虫病立克次体，橙色则为非恙虫病立克次体。
实施例3 特异性实验
利用实施例2的方法分别对2种孢疹病毒（HSV、EBV）、乙型脑炎病毒（JEV）、黄热病毒（YFV）、2型登革热病毒（DENV2）、普氏立克次体（Rickettsia mooseri）、莫氏立克次体（Rickettsia mooseri）、立克次立克次体（Rickettsia mooseri）进行检测，DEPC水为阴性对照。
检测结果见图3。仅恙虫病立克次体管为绿色，其余管为橙色。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将恙虫病立克次体和普氏立克次体、莫氏立克次体、立克次立克次体以及其他非相关病毒区分开来（图3）。
实施例4 常规PCR、Real-time PCR检测方法与本发明检测灵敏度的比较
取阳性对照品（即构建好的含有恙虫病立克次体基因TSA56片段的pMD-19T质粒），测定其浓度并计算TSA56基因的拷贝数，按照10浓度梯度稀释，选取1.0×100～1.0×106拷贝/μL进行实验。分别用本发明的鉴定方法和常规PCR方法以及Real-time PCR方法进行鉴定。
1、本发明的LAMP检测方法
每个浓度的阳性对照品各取1μL，采用实施例2的方法分别对各个浓度的样品进行检测，实验结果见图4中的c、d、e：1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106拷贝/μL的反应管均有扩增反应； LAMP通过显色、电泳、荧光曲线等3种方法显示了实验结果，均出现一致的结果。
2、常规PCR检测
（1）PCR引物：
F: TTGATCTGAGTATGATTGTCGG（SEQ ID NO.3），
R: GAAGTTATAGCGTACACCTACA（SEQ ID NO.4）。
（2）PCR反应：PCR反应体系为25μL体系，10×PCR Buffer（PCR反应缓冲液，Promega公司）2.5μL，10mM dNTPs （Promega公司）0.5μL，上、下游引物分别为实验室内部保存引物，各1μL，Taq酶（5U/μL ，Promega公司）0.5μL，上述每个浓度的阳性对照品各取1μL作为PCR模板，用灭菌去离子水补至25μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μL与2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压下30min，通过凝胶成像分析仪观察结果，预期目的条带为296bp。常规PCR方法的灵敏度为1.0×102-1个拷贝/μL的显示为阴性，即无扩增。实验结果见图4中a。
3、Real-time PCR检测
（1）Real-time PCR引物：
F: TTGATCTGAGTATGATTGTCGG（SEQ ID NO.3），
R: GAAGTTATAGCGTACACCTACA（SEQ ID NO.4）。
（2）Real-time PCR反应：反应体系为10μL体系，2×SYBR Green II buffer 5μL， 上下游引物终浓度各为0.4 μmol/L，上述每个浓度的阳性对照品各取1μL作为PCR模板，用灭菌去离子水补至10μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸20s，72℃延伸7min。通过荧光曲线判断实验结果。实验结果见图4中b。常Real-time PCR方法的灵敏度为1.0×101、1个拷贝/μL的没有出现扩增峰，即无扩增。
实施例5 本发明对临床恙虫病患者的检验
利用实施例2的方法对多个已经确定为恙虫病患者病人血样进行处理检验，处理多个病人样本，均为阳性，正确率可以达到100%。
表1本发明对临床恙虫病患者的检验
注：“+”表示检测结果为阳性，即有扩增；“-”表示检测结果为阴性，即无扩增。
以上实施例表明，本发明的方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
<110> 中山大学
<120> 一种快速鉴定恙虫病立克次体的LAMP引物组、试剂盒及方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 5
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<213> 人工序列
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
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<400> 7
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Claims (10)
1.用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP特异性引物组，其特征在于，包括：
内引物1：5’- TTGCTACACCAAGTGCTCCTGATATGCTGGTCTTGGTGC-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’- TTAATGCTGCTGAGGGTGTGTCGCATTTACCGAGTACTTATCT-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’- TTGATCTGAGTATGATTGTCGG -3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’-GAAGTTATAGCGTACACCTACA-3’（SEQ ID No.4）；
环引物1：5’- GCAACCATACCTGTATGCC-3’ （SEQ ID No.5）；
环引物2：5’- ATGTGGACATAGAAGGTGGTT-3’ （SEQ ID No.6）。
2.一种用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求3所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为8：1：4。
4.根据权利要求2或3所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：逆转录酶、DNA聚合酶、RT-LAMP反应液、显色剂、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为AMV逆转录酶；所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
6.根据权利要求4所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM 甜菜碱，四者的体积比为6～8：4～5：2～3：8～10。
7.根据权利要求4所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述显示剂为SYBR GREENⅠ。
8.根据权利要求4所述的用于快速鉴定恙虫病立克次体的RT-LAMP试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有恙虫病立克次体（SEQ ID NO.7）的质粒，阴性对照为DEPC水。
9.一种快速鉴定恙虫病立克次体的方法，其特征在于，采用权利要求2～8所述的试剂盒，加入模板RNA，在60～65℃，等温扩增60～90分钟，具体包括如下步骤：
（1）提取模板RNA；
（2）利用权利要求1所述的引物组对模板RNA进行环介导等温基因扩增反应；（3）结果判断：在上述反应管中加入2μL显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为恙虫病立克次体，橙色则为非登恙虫病立克次体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，环介导等温基因扩增反应的25μL反应体系含有：内引物1、2各8pmol/μL，外引物1、2各1 pmol/μL，环引物1、2各4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检RNA 1~100ng，逆转录酶1U，用灭菌去离子水补齐到25μL；环介导等温基因扩增反应的条件为：60～65℃反应30～40min。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110468222A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物 |
| CN117327822A (zh) * | 2023-11-16 | 2024-01-02 | 河南中检食安生物科技有限公司 | 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒 |
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| LIN,P.R. ET AL.: "GU446621.1", 《GENBANK》 * |
| NA-YOUNG HA ET AL.: "Detection of antibodies against Orientia tsutsugamushi Sca proteins in scrub typhus patients and genetic variation of sca genes of different strains", 《CLIN.VACCINE IMMUNOL.》 * |
| PEY-RU LIN ET AL: "Genetic Typing, Based on the 56-Kilodalton Type-Specific Antigen Gene,of Orientia tsutsugamushi Strains Isolated from Chiggers Collected from Wild-Caught Rodents in Taiwan", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 耿美玲 等: "恙虫病东方体环介导恒温扩增可视化快检方法的建立", 《中国病原生物学杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110468222A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-11-19 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物 |
| CN110468222B (zh) * | 2019-09-16 | 2022-08-30 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物 |
| CN117327822A (zh) * | 2023-11-16 | 2024-01-02 | 河南中检食安生物科技有限公司 | 用于检测汉赛巴通体的引物组及试剂盒 |
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