CN103710433A - 用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量pcr试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测一对用于检测巴贝斯虫的引物对，其中的上下游引物序列如如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。一种用于检测巴贝斯虫的实时荧光PCR试剂盒，包括Taq DNA聚合酶混合液，ROX染料，引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，TaqMan探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，阴性对照，阳性对照。提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测效果特异性强，灵敏度高。

Description

用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量PCR试剂盒。
背景技术
巴贝斯虫病（Babesiosis），是由顶复门孢子虫纲梨形虫亚纲梨形虫目巴贝斯属的多种原虫寄生于动物和人体而导致的一类血液原虫病的总称。研究显示，人巴贝斯虫病的主要病原是双芽巴贝斯虫（Babesia divergens）和鼠源巴贝斯虫（Babeisia microti）。人体感染后，可引起血红蛋白尿、黄疸、高热等，严重者可导致死亡。
巴贝斯虫病的传染源是动物宿主，蜱是传播媒介。离开蜱和宿主，巴贝斯虫不能存活。啮齿类动物的数量大，分布广，活动场所与蜱的生境一致，其常有蜱寄生。流行病学资料显示，人群患者多是在野外旅游或作业时，因受到蜱叮咬而发病。因此，啮齿类动物作为人巴贝斯虫病的传染源意义十分重大。特别是随着经济水平的提高和户外旅游业的发展，增加了人类患此类疾病的机会，特别是增高了从非流行区进入流行区时被感染的风险。近年来，人感染巴贝斯虫病例的报道不断增多，因此，开展人巴贝斯虫病的相关研究显得尤为迫切。由于人巴贝斯虫病没有典型的临床表现，实验室检测成为人巴贝斯虫病诊断的主要依据，尤其是对于非典型症状或无症状感染者，灵敏的检测技术成为检测人巴贝斯虫的关键。传统的巴贝斯虫的检测方法是采用血涂片染色镜检的方式进行，但图片染色镜检结果收到很多因素的影响，准确性较差。目前实验室检测用的方法是普通PCR，但普通PCR结果并不理想，并且对巴贝斯虫检测繁琐，检测周期长。
发明内容
针对现有技术的上述问题，本发明提供一组用于检测巴贝斯虫的核酸序列。
本发明还提供一种用于检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR试剂盒。
本发明采用以下技术方案：
一种用于PCR检测巴贝斯虫的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
一组用于检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述作为阳性对照的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
一种用于检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR的试剂盒，该试剂盒包括：
Taq DNA聚合酶混合液（2×）；
ROX染料；
引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
TaqMan探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，并且其5′标记有FAM基团、3＇端标记NONE基团；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
如上所述的试剂盒，优选地，所述Taq DNA聚合酶混合液（2×）为PCR反应用的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合液的2倍浓度的混合物；所述ROX染料为ROX Reference DyeⅡ(50×)。
如上所述的试剂盒，优选地，在应用该试剂盒时，按照以下终浓度配置实时荧光定量PCR反应液：
Figure BDA0000413534060000021
应用如上所述的试剂盒，优选地，实时荧光定量PCR反应条件为第一步95℃预变性10min，然后95℃，10sec和60℃，45sec反应40个循环。
本发明的有益效果：本发明建立了比较高效、灵敏的巴贝斯虫病原的快速检测方法。提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方便，操作简便，自动化程度高，有效替代传统PCR利用电泳观察结果，且试剂盒所用的试剂少，大大简化了操作过程，减少了在操作过程的污染，检测效果好，特异性强，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明试剂盒灵敏度检测结果。
图2为本发明试剂盒特异性检测结果。
图3为本发明试剂盒检测样品的结果。
具体实施方式
以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明。本发明所用试剂未作特别说明可选用常规试剂。
实施例1引物与探针的设计
本发明通过检索比对鼠源巴贝斯虫成员中18S rRNA基因序列，设计一对寡聚核苷酸序列（引物）和一条寡聚核苷酸序列（探针），设计的引物可特异性地扩增巴贝斯虫18SrRNA的基因片段，扩增产物为170bp。
设计的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
引物1（bc246f）SEQ ID No.1：5′-GGCGATGTATCATTCAAG-3′；
引物2（bc415r）SEQ ID No.2：5′-GTCAGGATTGGGTAATTTG-3′；
设计的探针序列如SEQ ID No.3所示，在合成该序列时其5′用FAM和NONE基团进行修饰，即bc394probe：5’-FAM-CGCCTGCTGCCTTCCTTAGA-NONE-3’，作为探针；
引物和探针委托生工合成。
扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，委托上海生工合成如SEQ ID No.4所示的阳性质粒。
实施例2巴贝斯虫实时荧光定量PCR检测试剂盒
检测试剂盒包括如下组分：
Taq DNA聚合酶混合液（2×）；
ROX染料；
引物1：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
引物2：其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
TaqMan探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，并且其5′标记有FAM基团、3＇端标记有NONE非荧光基团；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
其中，所述Taq DNA聚合酶混合液（2×）为PCR反应用的Taq DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合物的2倍浓度的混合液；所述ROX染料为ROX ReferenceDyeⅡ(50×)；所述Taq DNA聚合酶混合液（2×）也可为Premix Ex Taq（2×）。
本发明的试剂盒在应用时，PCR扩增体系配置成：Taq DNA聚合酶混合液(1×)，0.5μM/μL引物1，0.5μM/μL引物2，0.25μM/μL TaqMan探针，1×ROX ReferenceDyeⅡ。
实施例3巴贝斯虫实时荧光定量PCR试剂盒的检测灵敏度
（1）巴贝斯虫阳性质粒DNA的获取：上海生工合成。
（2）阳性质粒梯度稀释：进行10倍比稀释，即101～10-7，其中10-7质粒的浓度为1.34×10-7ng/μL。
（3）实时荧光定量RT-PCR反应体系的配制：
Figure BDA0000413534060000041
（4）实时荧光定量PCR反应程序：
Figure BDA0000413534060000042
（5）收集荧光信号，检测Ct值。
检测结果如图1(横坐标表示循环数Cycle Number，纵坐标表示荧光强度Fluorescence)所示，结果显示在阳性质粒稀释至1.34×10-7ng/μL浓度后仍能检测到信号，说明检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR试剂盒的灵敏度为1.34×10-7ng/μL。
实施例4巴贝斯虫实时荧光定量检测PCR试剂盒的特异性
（1）巴尔通体、Q热立克次体、钩端螺旋体、莱姆病毒、土拉菌等DNA的获取：中国检验检验科院研究院卫生检验研究所实验室保存的阳性核酸样品；
（2）实时荧光定量PCR反应体系的配制：
同实施例3，模板DNA分别为上述阳性核酸样品，阳性对照为巴贝斯虫阳性质粒DNA。
（3）实时荧光RT-PCR反应程序：
同实施例3。
（4）收集荧光信号，检测Ct值。
检测结果如图2所示，从图中可看出：阳性样本巴尔通体、Q热立克次体、钩端螺旋体、莱姆病毒、土拉菌的核酸在本次检测过程中均未检测到，证明所设计的引物及探针的特异性很强。
实施例5运用本发明的试剂盒进行样品的检测
（1）巴贝斯虫DNA的提取：待检测样品是老鼠的肝脏，先将样品研磨后用试剂盒进行提取。用天跟DNA提取试剂盒(全血DNA提取试剂盒)，按说明书操作。
（2）实时荧光RT-PCR反应体系的配制：
同实施例3，同时设置阳性质粒为阳性对照。
（3）实时荧光RT-PCR反应程序：
同实施例3。
（4）收集荧光信号，检测Ct值。
结果如图3所示，结果显示，两份样品中有两份阳性样品，阳性样本条带清晰，ct值在35以内，效果明显。
Figure IDA0000413534150000011
Figure IDA0000413534150000021

Claims (5)

1.一种用于PCR检测巴贝斯虫的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
2.一组用于检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR核酸，其特征在于，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述作为阳性对照的扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.一种用于检测巴贝斯虫的实时荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
Taq DNA聚合酶混合液（2×）；
ROX染料；
引物1：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
引物2：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
TaqMan探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，并且其5′标记有FAM基团、3＇端标记NONE基团；
阴性对照：灭菌超纯水；
阳性对照：携带有扩增产物的质粒DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶混合液（2×）为PCR反应用的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合液的2倍浓度的混合物；所述ROX染料为ROX Reference DyeⅡ(50×)。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，在应用该试剂盒时，按照以下终浓度配置实时荧光定量PCR反应液：
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