CN110651051A

CN110651051A - 用于检测巴贝虫的组合物和方法

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Publication number: CN110651051A
Application number: CN201880033130.1A
Authority: CN
Inventors: E·H·费斯; J·孙
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-07-18
Filing date: 2018-07-18
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2038-07-18
Also published as: US20200399716A1; US11767567B2; EP3655554A1; US20190024189A1; JP2020532292A; US10760137B2; US11718883B2; US20200399715A1; JP6911190B2; CN110651051B; WO2019016253A1

Abstract

描述了用于快速检测生物学或非生物学样品中巴贝虫(Babesia)的存在或缺失的方法。该方法可包括实施扩增步骤,杂交步骤,和检测步骤。而且,提供了靶向巴贝虫的18S基因的引物和探针,和试剂盒,它们设计用于检测巴贝虫,包括但不限于田鼠巴贝虫(B.microti),分歧巴贝虫(B.divergens),邓肯巴贝虫(B.duncani),和猎户巴贝虫(B.venatorum)的巴贝虫属物种。还描述的是用于扩增和检测巴贝虫的试剂盒,反应混合物,和寡核苷酸(例如引物和探针)。

Description

用于检测巴贝虫的组合物和方法

发明领域

本公开涉及体外诊断剂领域。在此领域内,本发明关注使用引物和探针,样品中可能存在的巴贝虫属物种的靶核酸的扩增和检测,特别是包含序列变异和/或个别突变的靶核酸的扩增,检测,和量化。本发明进一步提供含有用于扩增和检测巴贝虫的引物和探针的反应混合物和试剂盒。

发明背景

巴贝虫(Babesia)(也称作纳脱原虫(Nuttallia))是一类原生动物寄生虫,感染红细胞,引起称作巴贝虫病(也称作梨浆虫病)的疾病。巴贝虫通常是蜱媒的(和蜱传播的)但也通过输血或在妊娠或分娩期间自母亲至婴儿可传播。

巴贝虫病的大多数病例是无症状的,而且如果发生的话,症状是非特异性的且可包括流感样症状(即发烧,发冷,出汗,头痛,肌痛,和关节痛),溶血性贫血,或血小板减少症。特别是,在具有无脾,减弱的免疫系统(例如由于癌症淋巴瘤,或AIDS),并存病,诸如肝或肾病,或年龄超过50的患者中,巴贝虫病是危及生命的。在此类患者中,可发生多器官功能障碍,播散性血管内凝血,和甚至死亡(Vannier et al.,Infect.Dis.Clin.N.Am.29:357-370(2015))。巴贝虫属寄生虫在红细胞中繁殖,在那里作为十字形包涵体看到它们并引起溶血性贫血,与疟疾没有不同。由于历史上的错误分类,巴贝虫病还称作德克萨斯牛热,红尿热,蜱热,和楠塔基特热。巴贝虫病是一种疟疾样寄生虫病且被看作是哺乳动物的第二最常见血液寄生虫,而且对家畜和人的健康具有重大影响。虽然人巴贝虫病在历史上并不常见,但是它是美国东北部和中西部以及欧洲多个部分的一种新兴疾病。

巴贝虫被认为是哺乳动物的第二最常见血液寄生虫(位居锥虫之后)。已经鉴定了巴贝虫属的多于一百个物种。在美国,巴贝虫感染的绝大多数输血相关病例是由于物种田鼠巴贝虫,而且大约2％的报告病例是由于邓肯巴贝虫。田鼠巴贝虫的蜱传播主要在美国东北部的七个州(康涅狄格,缅因,马萨诸塞,新罕布什尔,新泽西,纽约,和罗德岛)和中西部的上部(特别是明尼苏达和威斯康辛)发生(见Herwaldt et al.,Annals of InternalMedicine155(8):509-520(2011))。邓肯巴贝虫在美国西海岸流行(见Herwaldt et al.(2011))。在2011年,美国报告了1,124例巴贝虫病,其中10例是输血相关的(见Center forDisease Control and Prevention:Morbidity and Mortality Weekly Report 61(27):501-515(2012))。自1979年至2009年,跨越30年的时间段,报告了162例输血相关巴贝虫病,发生率随时间升高(见Herwaldt et al.(2011))。尽管这些统计可能显著低估输血相关巴贝虫病的真实发生率,然而巴贝虫是最常传播的输血相关感染(Leiby,Annals ofInternal Medicine 155(8):556-557(2011))。至今,在美国尚未许可用于筛选献血者的巴贝虫测试,而且没有用于巴贝虫的病原体减少技术可得。虽然巴贝虫病感染的历史是无限期推迟作为献血者的一项基础,但是许多捐献者可能不知道他们携带寄生虫且可能具有无症状的寄生虫病且保持感染达超过一年。而且,巴贝虫属寄生虫在血液产品中可存活。大多数输血相关病例与红细胞(包括白细胞减少的或经过照射的单位)有关,少数病例由于血小板输注。美国流行地区的献血的前瞻性测试产生0.38％巴贝虫阳性率(Moritz et al.,N.Engl.J.Med.375(23):2236-2245(2016))。

因为至今没有FDA许可的筛选测试可得,所以当前没有对美国血液供应筛选巴贝虫。因而,临床医生可能错过输血相关巴贝虫病的诊断,因为临床表现是非特异性的,而且血液产品的全国分布意味着可能在高巴贝虫流行区域以外和在蜱媒疾病的夏季高峰期以外发生病例。

虽然有用于检测血液和其它组织和/或生物学样品中的巴贝虫的方法(即免疫学方法),但是这些方法缺乏灵敏性且并不精确预测血液中巴贝虫的感染性。而且,此类免疫学方法不能在巴贝虫存在,但尚未引发足以检测的足够抗体时的时间段期间检测感染。像筛选献血的其它感染性疾病,必须用检测巴贝虫的灵敏测定法筛选献血,从而可以禁止和丢弃受到感染的单位。

在分子诊断领域,核酸的扩增和检测是相当重要的。可采用此类方法来检测任何数目的微生物,诸如病毒和细菌。最突出和广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增技术包括连接酶链式反应,聚合酶连接酶链式反应,缺口-LCR,修复链式反应,3SR,NASBA,链置换扩增(SDA),转录介导的扩增(TMA),和Qβ扩增。用于基于PCR的分析的自动化系统常常利用在同一反应器皿中实时检测PCR过程期间的产物扩增。此类方法的关键是使用携带报告物基团或标记物的经修饰寡核苷酸。

因而,在美国,巴贝虫感染的发生率急剧升高,没有可靠的灵敏测定法或手段用于检测样品中的它。由于没有用于检测巴贝虫的可靠灵敏手段,因此巴贝虫感染率的升高特别威胁献血者供应的安全性。因此,本领域需要用于检测和量化样品中巴贝虫的存在的快速,可靠,特异性,和灵敏方法。

发明概述

本公开中的某些实施方案涉及用于快速检测生物学或非生物学样品中巴贝虫的存在或缺失的方法,例如,单个测试管或器皿中通过实时聚合酶链式反应(PCR)对巴贝虫的多路检测和量化。实施方案包括检测巴贝虫的方法,包含实施至少一个循环步骤,其可以包括扩增步骤和杂交步骤。而且,实施方案包括设计用于在单个管或器皿中检测巴贝虫的引物,探针,和试剂盒。

请求保护的发明的一个实施方案致力于一种检测样品中的巴贝虫(Babesia)的方法,该方法包含:(a)实施扩增步骤,其包含使样品与一或多套引物接触以生成扩增产物,如果样品中存在巴贝虫的靶核酸的话；(b)实施杂交步骤,其包含使扩增产物,如果样品中存在巴贝虫的靶核酸的话,与一或多种探针接触；和(c)检测扩增产物的存在或缺失,其中扩增产物的存在指示样品中巴贝虫的存在,且其中扩增产物的缺失指示样品中巴贝虫的缺失；且其中一或多套引物包含一或多种引物,一或多种引物包含由SEQ ID NO:1,3,4,6,和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物；且其中一或多种探针包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。在一个实施方案中,巴贝虫包含由田鼠巴贝虫(B.microti),分歧巴贝虫(B.divergens),邓肯巴贝虫(B.duncani),和猎户巴贝虫(B.venatorum)组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。在又一个实施方案中,巴贝虫属物种由巴贝虫属物种田鼠巴贝虫组成。在一个实施方案中,一或多套引物包含:包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物,和包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且其中一或多种探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,巴贝虫属物种由巴贝虫属物种分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫中任一或多项组成。在一个相关实施方案中,一或多套引物包含:包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物,和包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且其中一或多种探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。在一个实施方案中,包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种第二引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。在另一个实施方案中,引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。在另一个实施方案中,巴贝虫属物种由巴贝虫属物种田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫中任一或多项组成。在一个相关实施方案中,检测田鼠巴贝虫的方法包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的方法包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。在一个相关实施方案中,(a)用于扩增田鼠巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物；和(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且(b)用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物；和(ii)包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,包含由SEQ IDNO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ IDNO:7的核酸序列,或其互补物的引物。在一个相关实施方案中,引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。在另一个实施方案中,样品是生物学样品,诸如全血,呼吸道标本,尿液,粪便标本,血液标本,血浆,皮肤拭子,鼻拭子,伤口拭子,血液培养物,皮肤,或软组织感染。在一个相关实施方案中,生物学样品是全血。在另一个实施方案中,在扩增步骤前使全血与核酸稳定溶液接触。在另一个实施方案中,核酸稳定溶液包含胍盐和缓冲剂。在另一个实施方案中,胍盐是氯化胍(GuHCl),其中氯化胍的浓度在2至6M之间,诸如4.2M。在另一个实施方案中,缓冲剂是Tris,其中Tris的浓度在20至100mM之间,诸如50mM。在另一个实施方案中,核酸稳定溶液的pH在6至8之间,诸如7.5。在另一个实施方案中,核酸稳定溶液在血液收集器皿中。在一个相关实施方案中,血液收集器皿具有真空室。在另一个实施方案中,杂交步骤包含使扩增产物与一或多种探针接触,其中一或多种探针是用供体发荧光模块和相应的受体模块标记的；且检测步骤包含检测一或多种探针的供体发荧光模块和受体模块之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或缺失,其中荧光的存在或缺失指示样品中巴贝虫的存在或缺失。在一个相关实施方案中,供体发荧光模块是HEX或FAM。在另一个实施方案中,受体模块是猝灭剂,诸如BlackHole Quencher^TM-2(BHQ-2)。在另一个实施方案中,供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体发荧光模块和受体模块彼此在7至10个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体发荧光模块和受体模块彼此在8个核苷酸内,或彼此在10个核苷酸内。

请求保护的发明的另一个实施方案致力于一种检测样品中巴贝虫的方法,其中样品是全血,该方法包含:(a)实施扩增步骤,其包含使样品与一或多套引物接触以生成扩增产物,如果全血样品中存在巴贝虫的靶核酸的话；(b)实施杂交步骤,其包含使扩增产物,如果样品中存在巴贝虫的靶核酸的话,与一或多种探针接触；和(c)检测扩增产物的存在或缺失,其中扩增产物的存在指示样品中巴贝虫的存在,且其中扩增产物的缺失指示样品中巴贝虫的缺失；且其中一或多套引物包含一或多种引物,一或多种引物包含由SEQ ID NO:1,3,4,6,和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物；且其中一或多种探针包含由SEQ IDNO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。在一个相关实施方案中,全血是在血液收集器皿中收集的。在另一个实施方案中,血液收集器皿具有真空室。在另一个实施方案中,血液收集器皿在其内含有核酸稳定溶液。在一个相关实施方案中,核酸稳定溶液包含胍盐和缓冲剂。在一个相关实施方案中,胍盐是氯化胍(GuHCl)。在一个实施方案中,GuHCl处于4.2M的浓度。在另一个实施方案中,缓冲剂是Tris。在另一个实施方案中,Tris处于50mM的浓度。在一个实施方案中,核酸稳定溶液处于7.5的pH。在另一个实施方案中,巴贝虫属物种包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。在另一个实施方案中,检测田鼠巴贝虫的方法包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的方法包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。在另一个实施方案中,(a)用于扩增田鼠巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物；和(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且(b)用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物；和(ii)包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,包含由SEQ IDNO:6和7组成的组中任一或多项的核苷酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。在一个相关实施方案中,引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

请求保护的发明的另一个实施方案致力于一种用于检测样品中可能存在的巴贝虫的核酸的试剂盒,该试剂盒包含扩增试剂,包含DNA聚合酶,核苷酸单体,包含一或多种引物的一或多套引物,和包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种探针,其中一或多种引物包含由SEQ ID NO:1,3,4,6,和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,巴贝虫包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。在另一个实施方案中,试剂盒包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中试剂盒包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。在另一个实施方案中,(a)用于扩增田鼠巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物；和(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且(b)用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物；和(ii)包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核苷酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ IDNO:7的核酸序列,或其互补物的引物。在一个相关实施方案中,引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。在另一个实施方案中,样品是生物学样品,诸如全血,呼吸道标本,尿液,粪便标本,血液标本,血浆,皮肤拭子,鼻拭子,伤口拭子,血液培养物,皮肤,或软组织感染。在另一个实施方案中,生物学样品是全血。在另一个实施方案中,试剂盒进一步包含血液收集器皿。在另一个实施方案中,血液收集器皿具有真空室。在另一个实施方案中,血液收集器皿在其内含有核酸稳定溶液。在另一个实施方案中,核酸稳定溶液包含胍盐和缓冲剂。在另一个实施方案中,胍盐是处于4.2M的浓度的氯化胍(GuHCl)。在另一个实施方案中,缓冲剂是处于50mM的浓度的Tris。在另一个实施方案中,核酸稳定溶液处于7.5的pH。在另一个实施方案中,一或多种探针包含供体发荧光模块和相应的受体模块。在一个相关实施方案中,供体模块是HEX或FAM。在另一个实施方案中,受体模块是猝灭剂,诸如BlackHole Quencher^TM-2(BHQ-2)。在另一个实施方案中,供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体模块和受体模块彼此在7至10个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体模块和受体模块彼此在8个核苷酸内,或彼此在10个核苷酸内。

请求保护的发明的还有另一个实施方案致力于用于检测样品中巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针,其中一或多套引物包含一或多种引物,一或多种引物包含选自SEQID NO:1,3,4,6,和7的组中任一项的核酸序列,或其互补物；且其中一或多种探针包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,巴贝虫包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。在另一个实施方案中,用于检测田鼠巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。在另一个实施方案中,(a)用于扩增田鼠巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物；和(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的一或多种探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且(b)用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物；和(ii)包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的一或多种探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。在另一个实施方案中,包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。在另一个实施方案中,引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。在另一个实施方案中,一或多种探针包含供体发荧光模块和相应的受体模块。在另一个实施方案中,供体模块是HEX或FAM。在另一个实施方案中,受体模块是猝灭剂,诸如BlackHole Quencher^TM-2(BHQ-2)。在另一个实施方案中,供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体模块和受体模块彼此在7至10个核苷酸内。在另一个实施方案中,供体模块和受体模块彼此在8或10个核苷酸内。

其它实施方案提供包含选自SEQ ID NO:1-7的核苷酸序列,或其互补物或由其组成的一种寡核苷酸,该寡核苷酸具有100个或更少核苷酸。在另一个实施方案中,本公开提供包括与SEQ ID NO:1-5之一,或其互补物具有至少70％序列同一性(例如至少75％,80％,85％,90％或95％,等)的核酸的一种寡核苷酸,该寡核苷酸具有100个或更少核苷酸。一般地,这些寡核苷酸可以是这些实施方案中的引物核酸,探针核酸,等等。在这些实施方案中某些中,寡核苷酸具有40个或更少核苷酸(例如35个或更少核苷酸,30个或更少核苷酸,25个或更少核苷酸,20个或更少核苷酸,15个或更少核苷酸,等)。在一些实施方案中,寡核苷酸包含至少一个经修饰核苷酸,例如为了相对于未修饰核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地,寡核苷酸包含至少一个标记物和任选地至少一个猝灭剂模块。在一些实施方案中,寡核苷酸包括至少一个保守修饰变异。特定核酸序列的“保守修饰变异”或简称“保守变异”指编码相同或本质上相同的氨基酸序列的核酸,或,在核酸不编码氨基酸序列的情况下指本质上相同的序列。本领域技术人员会认识到,在改变导致删除氨基酸,添加氨基酸,或将氨基酸用化学上相似的氨基酸替代的情况下,改变,添加或删除编码序列中的单个核苷酸或小百分比的核苷酸(典型地少于5％,更加典型地少于4％,2％或1％)的个别替代,删除或添加是“保守经修饰变异”。

在一个方面,扩增可采用具有5’至3’核酸酶活性的聚合酶。因而,供体发荧光模块和受体模块(例如猝灭剂)可以沿着探针的长度彼此在不多于5至20个核苷酸内(例如在7或10个核苷酸内)。在另一个方面,探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成可导致第一和第二发荧光模块之间的空间接近。依照这种方法,探针上的第二发荧光模块可以是猝灭剂。

本公开还提供用于检测来自个体的生物学样品中巴贝虫或巴贝虫核酸的存在或缺失的方法。可采用这些方法来检测血浆中巴贝虫核酸的存在或缺失,供血液筛选和诊断测试中使用。另外,本领域技术人员可使用相同测试来评估尿液和其它样品类型以检测和/或量化巴贝虫核酸。此类方法一般地包括实施至少一个循环步骤,其包括扩增步骤和染料结合步骤。典型地,扩增步骤包括使样品与多对寡核苷酸引物接触以生成一或多种扩增产物,如果样品中存在核酸分子的话,且染料结合步骤包括使扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测双链DNA结合染料进入扩增产物的结合的存在或缺失,其中结合的存在指示样品中巴贝虫核酸的存在,且其中结合的缺失指示样品中巴贝虫核酸的缺失。一种代表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。其它核酸结合染料包括DAPI,Hoechst染料,

和花青染料,诸如

和

Green。另外,此类方法还可以包括确定扩增产物和双链DNA结合染料之间的解链温度,其中解链温度确认巴贝虫核酸的存在或缺失。

在又一个实施方案中,提供了一种用于检测和/或量化一或多种巴贝虫核酸的试剂盒。试剂盒可包括对于扩增所靶向的基因特异性的一或多套引物；和对于检测扩增产物特异性的一或多种可检测寡核苷酸探针。

在一个方面,试剂盒可包括早已用供体和相应的受体模块(例如另一种发荧光模块或暗猝灭剂)标记的探针,或者可包括用于标记探针的荧光团模块。试剂盒还可包括核苷三磷酸,核酸聚合酶,和对于核酸聚合酶的功能必需的缓冲剂。试剂盒还可包括关于使用引物,探针,和荧光团模块来检测样品中巴贝虫核酸的存在或缺失的说明书和包装插页。

除非另有定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员的普遍理解相同的含义。虽然可以在本主题的实践或测试中使用与本文描述的那些相似或等同的方法和材料,但是下文描述了合适的方法和材料。另外,材料,方法,和实施例仅是例示性的,并不意图是限制性的。

在附图和下文描述中列出了本发明的一或多个实施方案的详情。根据图和详述,根据权利要求书,本发明的其它特征,目的,和优点会是明显的。

附图简述

图1显示对pEF113(田鼠巴贝虫)质粒DNA稀释液的田鼠巴贝虫核酸测试(“395”)的实时PCR生长曲线(使用具有SEQ ID NO:1和3的核酸序列的引物和具有SEQ ID NO:2的核酸序列的探针)。

图2显示对田鼠巴贝虫基因组DNA(ATCC 30221D)稀释液的田鼠巴贝虫核酸测试(“395”)的实时PCR生长曲线(使用具有SEQ ID NO:1和3的核酸序列的引物和具有SEQ IDNO:2的核酸序列的探针)。

图3显示对质粒pEF114(分歧巴贝虫),pEF115(邓肯巴贝虫),和pEF116(猎户巴贝虫)和来自邓肯巴贝虫(ATCC PRA 302)的总核酸的用于分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫核酸测试(“DDV”)的PCR生长曲线(使用具有SEQ ID NO:4和6的核酸序列的引物和具有SEQ ID NO:5的核酸序列的探针)。

图4显示在多路设置中田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDV”,SEQ ID NO:4-6)的PCR生长曲线。

图5显示荧光团和猝灭剂之间间距7个碱基的田鼠巴贝虫探针(SEQ ID NO:2)的PCR生长曲线,以便确定最佳间距。

图6显示荧光团和猝灭剂之间间距10个碱基的田鼠巴贝虫探针(SEQ ID NO:2)的PCR生长曲线,以便确定最佳间距。

图7显示以不同染料(FAM和HEX)评估的田鼠巴贝虫探针(SEQ ID NO:2)的PCR生长曲线,以便确定最佳染料。

图8显示田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)的PCR后分析,其展示有效扩增,如通过寡核苷酸消减和有效探针切割证明的。

图9显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDV”,SEQ ID NO:4-6)时田鼠巴贝虫的PCR生长曲线。

图10显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDV”,SEQ ID NO:4-6)时邓肯巴贝虫(图10A),分歧巴贝虫(图10B),和猎户巴贝虫(图10C)的PCR生长曲线。

图11显示一幅图中图10A,10B,和10C的覆盖,显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDV”,SEQ ID NO:4-6)时邓肯巴贝虫,分歧巴贝虫,和猎户巴贝虫的PCR生长曲线。

图12显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDVR2”,SEQ ID NO:4-7,有等量反向引物SEQ ID NO:6和7的混合物)时田鼠巴贝虫的PCR生长曲线。

图13显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDVR2”,SEQ ID NO:4-7,有等量反向引物SEQ ID NO:6和7的混合物)时邓肯巴贝虫(图13A),分歧巴贝虫(图13B),和猎户巴贝虫(图13C)的PCR生长曲线。

图14显示一幅图中图13A,13B,和13C的覆盖,显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用田鼠巴贝虫寡核苷酸套组(“395”,SEQ ID NO:1-3)和分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫寡核苷酸套组(“DDV”,SEQ ID NO:4-6)时邓肯巴贝虫,分歧巴贝虫,和猎户巴贝虫的PCR生长曲线。

图15显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用第一寡核苷酸套组(SEQ ID NO:1-6)(图15A)和第二寡核苷酸套组(SEQ IQ NO:1-7,有等量反向引物SEQ IDNO:6和7的混合物)(图15B)时邓肯巴贝虫,分歧巴贝虫,和猎户巴贝虫的PCR生长曲线。

图16显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用第一寡核苷酸套组(SEQ ID NO:1-6)(图16A)和第二寡核苷酸套组(SEQ IQ NO:1-7,有等量反向引物SEQ IDNO:6和7的混合物)(图16B)时邓肯巴贝虫的PCR生长曲线。

图17显示一幅图中图16A和16B的覆盖,显示在全血(用cobas PCR介质处理)中在多路设置中使用第一寡核苷酸套组(SEQ ID NO:1-6)(标注为“DDVR”)和第二寡核苷酸套组(SEQ IQ NO:1-7,有等量反向引物SEQ ID NO:6和7的混合物)(标注为“DDVR2”)时邓肯巴贝虫的PCR生长曲线。

发明详述

通过核酸扩增诊断巴贝虫感染提供一种用于快速,准确,可靠,特异性,和灵敏检测和/或量化BK病毒感染的方法。本文中描述了一种用于检测和/或量化非生物学或生物学样品中巴贝虫核酸(包括DNA和/或RNA)的实时PCR测定法。提供了用于检测和/或量化巴贝虫的引物和探针,以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其它方法相比升高的实时PCR用于检测巴贝虫的特异性和灵敏性,以及改善的实时PCR的特征(包括样品容纳和实时检测和量化扩增产物)使得在临床实验室中执行这种技术来例行诊断巴贝虫感染变得可行。另外,这种技术可用于血液筛选以及预后。这种巴贝虫检测测定法还可以与用于平行检测其它核酸(例如其它细菌和/或病毒)的其它测定法多路复用。

本公开包括与巴贝虫基因组杂交,以便使用例如扩增和检测技术特异性鉴定巴贝虫的荧光标记的水解探针和寡核苷酸引物。

所公开的方法可包括实施至少一个循环步骤,其包括使用一或多对引物自样品扩增核酸分子基因靶的一或多个部分。如本文中使用的,“BK引物”指与在巴贝虫基因组中找到的核酸序列特异性退火,并在适宜条件下自其启动DNA合成,生成各自的扩增产物的寡核苷酸引物。在巴贝虫基因组中找到的核酸序列的例子包括在巴贝虫基因组的病毒衣壳蛋白区域,诸如VP2区域内的核酸。所讨论的巴贝虫引物中每一项与靶退火,使得每一种扩增产物的至少一部分含有与靶对应的核酸序列。在样品中存在一或多种核酸的前提下生成一或多扩增产物,因而一或多种扩增产物的存在指示样品中巴贝虫的存在。扩增产物应当含有用于巴贝虫的与一或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文中使用的,“巴贝虫探针”指与在巴贝虫基因组中找到的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每一个循环步骤包括扩增步骤,杂交步骤,和检测步骤,其中使样品与一或多种可检测巴贝虫探针接触以检测样品中巴贝虫的存在或缺失。

如本文中使用的,术语“扩增”指合成与模板核酸分子(例如来自巴贝虫基因组的核酸分子)的两条链之一或二者互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子典型地包括使模板核酸变性,在引物的解链温度以下的温度使引物与模板核酸退火,和酶促延伸引物以生成扩增产物。扩增典型地要求存在脱氧核糖核苷三磷酸,DNA聚合酶(例如

Taq)和适宜的缓冲剂和/或用于实现聚合酶的最佳活性的辅因子(例如MgCl₂和/或KCl)。

如本文中使用的,术语“引物”是本领域技术人员知道的且指能够由模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成的寡聚化合物,主要指寡核苷酸,但也指经修饰寡核苷酸,即例如寡核苷酸的3’端提供游离3’-OH基团,在那里可以由模板依赖性DNA聚合酶附着别的“核苷酸”,建立3’至5’磷酸二酯连接,其中使用脱氧核苷三磷酸且其中释放焦磷酸根。

术语“杂交”指一或多种探针与扩增产物的退火。“杂交条件”典型地包括在探针的解链温度以下但避免探针的非特异性杂交的温度。

术语“5’至3’核酸酶活性”指核酸聚合酶的一种活性,典型地与核酸链合成有关,其中自核酸链的5’端去除核苷酸。

术语“热稳定聚合酶”指热稳定的聚合酶,即酶催化形成与模板互补的引物延伸产物且经受升高的温度达实现双链模板核酸变性必需的时间时并不不可逆变性。一般地,合成在每一种引物的3’端启动并沿着模板链以5’至3’方向行进。已经自黄栖热菌(Thermusflavus),红栖热菌(T.ruber),嗜热栖热菌(T.thermophilus),水生栖热菌(T.aquaticus),乳栖热菌(T.lacteus),红色栖热菌(T.rubens),嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus),和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离热稳定聚合酶。无论如何,在必要时,也可以在PCR测定法中采用并非热稳定的聚合酶,前提是补充酶。

术语“其互补物”指既与给定核酸长度相同又与给定核酸完全互补的核酸。

在就核酸而言使用时,术语“延伸”或“延长”指将另外的核苷酸(或其它类似分子)掺入核酸时。例如,核酸任选地由掺入核苷酸的生物催化剂延伸,诸如典型地在核酸的3’末端添加核苷酸的聚合酶。

在两或更多条核酸序列的语境中,术语“相同/同一”或百分比“同一性”指当为了最大对应性而比较和比对时,相同的或具有规定百分比的相同的核苷酸的两或更多条序列或子序列,例如如使用技术人员可得的序列比较算法之一或通过目测测量的。适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的例示性算法是BLAST程序,其描述于例如Altschul etal.(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215:403-410,Gish etal.(1993)“Identification of protein coding regions by database similaritysearch”Nature Genet.3:266-272,Madden et al.(1996)“Applications of networkBLAST server”Meth.Enzymol.266:131-141,Altschul et al.(1997)“Gapped BLAST andPSI-BLAST:a new generation of protein database search programs”Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,和Zhang et al.(1997)“PowerBLAST:A new network BLASTapplication for interactive or automated sequence analysis and annotation”Genome Res.7:649-656。

在寡核苷酸的语境中,“经修饰核苷酸”指如下改变,其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸用对寡核苷酸提供期望特性的不同核苷酸替换。本文中描述的寡核苷酸中可替代的例示性经修饰核苷酸包括例如叔丁基苄基,C5-甲基-dC,C5-乙基-dC,C5-甲基-dU,C5-乙基-dU,2,6-二氨基嘌呤,C5-丙炔基-dC,C5-丙炔基-dU,C7-丙炔基-dA,C7-丙炔基-dG,C5-丙炔基氨基-dC,C5-丙炔基氨基-dU,C7-丙炔基氨基-dA,C7-丙炔基氨基-dG,7-脱氮-2-脱氧黄苷,吡唑并嘧啶类似物,假-dU,硝基吡咯,硝基吲哚,2’-0-甲基核糖-U,2’-0-甲基核糖-C,N4-乙基-dC,N6-甲基-dA,5-丙炔基dU,5-丙炔基dC,7-脱氮-脱氧鸟苷(脱氮G(u-脱氮))等等。寡核苷酸中可替代的许多其它经修饰核苷酸在本文中有提及或以其它方式是本领域已知的。在某些实施方案中,相对于相应的未修饰寡核苷酸的解链温度,经修饰核苷酸替代修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。为了进一步说明,在一些实施方案中,某些经修饰核苷酸替代可降低非特异性核酸扩增(例如最小化引物二聚体形成等等),提高预期靶扩增子的产量,等等。这些类型的核酸修饰的例子描述于例如美国专利No.6,001,611。其它经修饰核苷酸替代可改变寡核苷酸的稳定性,或提供其它期望特征。

巴贝虫靶核酸的检测/量化

本公开提供检测巴贝虫的方法,其通过扩增例如巴贝虫核酸序列的一部分。具体地,本公开中的实施方案提供了扩增和检测和/或量化巴贝虫核酸分子靶的引物和探针。

为了检测和/或量化巴贝虫,提供了扩增和检测/量化巴贝虫的引物和探针。也可以使用除了本文中例示以外的巴贝虫核酸来检测样品中的巴贝虫。例如,本领域技术人员可以使用例行方法对功能性变体评估特异性和/或灵敏性。代表性的功能性变体可以包括例如本文中公开的巴贝虫核酸中的一或多处删除,插入,和/或替代。

更具体地,寡核苷酸的实施方案每个包括具有选自SEQ ID NO:1-7的序列的核酸,其实质性相同变体(其中变体与SEQ ID NO:1-7之一具有至少例如80％,90％,或95％序列同一性),或SEQ ID NO:1-7和变体的互补物。

表1:巴贝虫测试中的寡核苷酸

在一个实施方案中,使用上文描述的巴贝虫引物和探针套组以便提供怀疑含有巴贝虫的生物学样品中巴贝虫的检测(表1)。引物和探针套组可包含对巴贝虫核酸序列特异性的引物和探针或由其组成,引物和探针包含SEQ ID NO:1-7的核酸序列或由其组成。在另一个实施方案中,用于巴贝虫靶的引物和探针包含任何SEQ ID NO:1-7的引物和探针的功能性活性变体或由其组成。

可以通过在所公开的方法中使用引物和/或探针来鉴定任何SEQ ID NO:1-7的引物和/或探针的功能性活性变体。任何SEQ ID NO:1-7的引物和/或探针的功能性活性变体属于与SEQ ID NO:1-7的各自序列相比在所描述的方法或试剂盒中提供相似或更高特异性和灵敏性的引物和/或探针。

变体可以例如与SEQ ID NO:1-7的序列相差一或多处核苷酸添加,删除或替代,诸如SEQ ID NO:1-7的各自序列的5’端和/或3’端处的一或多处核苷酸添加,删除或替代。如上文详述的,可以化学修饰引物和/或探针,即引物和/或探针可包含经修饰核苷酸或非核苷酸化合物。然后,探针(或引物)是经修饰寡核苷酸。“经修饰核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”不同在于一些修饰但仍然由碱基或碱基样化合物,呋喃戊糖基糖或呋喃戊糖基糖样化合物,磷酸根部分或磷酸根样部分,或其组合组成。例如,可以将“标记物”附着于“核苷酸”的碱基部分,由此获得“经修饰核苷酸”。也可以用例如7-脱氮嘌呤替换“核苷酸”中的天然碱基,由此同样获得“经修饰核苷酸”。术语“经修饰核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请可互换使用。“经修饰核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷不同在于一些修饰,其方式如上文关于“经修饰核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的。

寡核苷酸包括扩增编码巴贝虫靶的核酸分子的经修饰寡核苷酸和寡核苷酸类似物,例如,可以使用例如计算机程序,诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade,Colo.)设计编码巴贝虫的备选(alternative)部分的核酸。设计要作为扩增引物使用的寡核苷酸时的重要特征包括但不限于适宜大小扩增产物以推动检测(例如通过电泳),引物对成员的相似解链温度,和每种引物的长度(即,引物需要足够长以致序列特异性地退火及启动合成但不要太长以免保真度在寡核苷酸合成期间降低)。典型地,寡核苷酸引物长8至50个核苷酸(例如长8,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40,42,44,46,48,或50个核苷酸)。

在引物套组以外,该方法可以使用一或多种探针以便检测巴贝虫的存在或缺失。术语“探针”指合成或生物生成的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择,含有特定核苷酸序列,容许它们在限定的预定严格性下与“靶核酸”特异性(即优先)杂交,在本案中是巴贝虫(靶)核酸。“探针”可以称作“检测探针”,意味着它检测靶核酸。

在一些实施方案中,可以用至少一种发荧光标记物标记所描述的巴贝虫探针。在一个实施方案中,可以用供体发荧光模块,例如发荧光染料,和相应的受体模块,例如猝灭剂标记巴贝虫探针。在一个实施方案中,探针包含发荧光模块和核酸序列或由其组成,核酸序列包含SEQ ID NO:3或由其组成。

可以以与设计引物相似的方式实施设计要作为探针使用的寡核苷酸。实施方案可使用一种探针或一对探针来检测扩增产物。取决于实施方案,所使用的探针可包含至少一种标记物和/或至少一种猝灭剂模块。与引物一样,探针通常具有相似的解链温度,而且每种探针的长度必须足以发生序列特异性杂交但不要太长以免保真度在合成期间降低。寡核苷酸探针一般地长15至40(例如16,18,20,21,22,23,24,或25)个核苷酸。

构建物可包括载体,每种含有巴贝虫引物和探针核酸分子(例如SEQ ID NO:1,2,3,4,和5)之一。可使用构建物,例如作为对照模板核酸分子。适合于使用的载体可商购和/或通过本领域例行的重组核酸技术方法生成。可例如通过化学合成,直接自巴贝虫克隆,或核酸扩增来获得巴贝虫核酸分子。

在巴贝虫核酸分子(例如含有SEQ ID NO:1-5中一或多种序列的核酸分子)以外,适合于在该方法中使用的构建物典型地包括编码用于选择期望构建物和/或转化子的选择标志(例如抗生素抗性基因)的序列,和复制起点。载体系统的选择通常取决于数种因素,包括但不限于宿主细胞的选择,复制效率,可选择性,可诱导性,和容易回收。

可以在宿主细胞中繁殖含有巴贝虫核酸分子的构建物。如本文中使用的,术语宿主细胞意味着包括原核生物和真核生物,诸如酵母,植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium),粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens),和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母,诸如酿酒酵母(S.cerevisiae),粟酒裂殖酵母(S.pombe),巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),哺乳动物细胞,诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,昆虫细胞,和植物细胞,诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum)。可以使用本领域普通技术人员普遍知道的任何技术将构建物导入宿主细胞。例如,磷酸钙沉淀,电穿孔,热休克,脂转染,显微注射,和病毒介导的核酸转移是用于将核酸导入宿主细胞的常用方法。另外,可以将裸露的DNA直接投递至细胞(见例如美国专利No.5,580,859和5,589,466)。

聚合酶链式反应(PCR)

美国专利No.4,683,202,4,683,195,4,800,159,和4,965,188公开常规PCR技术。PCR典型地采用结合选定核酸模板(例如DNA或RNA)的两种寡核苷酸引物。在一些实施方案中有用的引物包括能够作为所描述的巴贝虫核酸序列(例如SEQ ID NO:1,2,4,和5)内的核酸合成的起始点起作用的寡核苷酸。可以通过常规方法自限制消化物纯化引物,或者可以合成生成它。引物优选是单链的以实现最大扩增效率,但是引物可以是双链的。首先将双链引物变性,即处理以分开链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

如果模板核酸是双链的话,必须分开两条链,之后它才能用作PCR中的模板。可以通过任何合适变性方法实现链分开,包括物理,化学或酶促手段。分开核酸链的一种方法牵涉加热核酸直至它主体变性(例如大于50％,60％,70％,80％,90％或95％变性)。使模板核酸变性必需的加热条件会取决于例如缓冲盐浓度和所变性的核酸的长度和核苷酸组成,但是典型地范围为约90℃至约105℃达取决于反应特征,诸如温度和核酸长度的时间。典型地实施变性达约30秒至4分(例如1分至2分30秒,或1.5分)。

如果通过热使双链模板核酸变性的话,容许反应混合物冷却至促进每种引物与它靶序列退火的温度。用于退火的温度通常为约35℃至约65℃(例如约40℃至约60℃；约45℃至约50℃)。退火时间可以是约10秒至约1分(例如约20秒至约50秒；约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调节至促进或优化聚合酶的活性的温度,即足以自退火引物发生延伸以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应当足以自与核酸模板退火的每种引物合成延伸产物,但是不应太高以免延伸产物自它的互补模板变性(例如,用于延伸的温度一般地范围为约40℃至约80℃(例如约50℃至约70℃；约60℃))。延伸时间可以是约10秒至约5分(例如约30秒至约4分；约1分至约3分；约1分30秒至约2分)。

逆转录病毒或RNA病毒的基因组由核糖核酸,即RNA构成。在此类情况中,必须首先经由逆转录酶的作用将模板核酸,RNA转录成互补DNA(cDNA)。逆转录酶使用RNA模板和与RNA的3’端互补的短引物来指导第一链cDNA的合成,其然后可以直接用作用于聚合酶链式反应的模板。

PCR测定法可采用巴贝虫核酸,诸如RNA或DNA(cDNA)。不需要纯化模板核酸；它可以是复杂混合物的微小部分,诸如人细胞中含有的巴贝虫核酸。可以通过例行技术自生物学样品提取巴贝虫核酸分子,诸如Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications(Persing et al.(eds),1993,American Society for Microbiology,Washington D.C.)中描述的那些。可以自多种来源获得核酸,诸如质粒,或天然来源,包括细菌,酵母,病毒,细胞器,或高等生物,诸如植物或动物。

在诱导引物延伸的反应条件下组合寡核苷酸引物(例如SEQ ID NO:1,2,4,和5)与PCR试剂。例如,链延伸反应一般地包括50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH 8.3),15mM MgCl₂,0.001％(w/v)明胶,0.5-1.0μg变性模板DNA,50pmol每种寡核苷酸引物,2.5U Taq聚合酶,和10％DMSO。反应通常含有150至320μM每种dATP,dCTP,dTTP,dGTP,或一或多种其类似物。

可以在反应的后继步骤中使用自双链分子新合成的链。可以根据需要重复链分开,退火,和延伸的步骤以生成期望数量的与靶巴贝虫核酸分子对应的扩增产物。反应中的限制性因素是引物的量,热稳定的酶,和反应中存在的核苷三磷酸。循环步骤(即变性,退火,和延伸)优选重复至少一次。为了在检测中使用,循环步骤的数目会取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物的话,会需要更多的循环步骤来扩增足以检测的靶序列。一般地,循环步骤重复至少约20次,但是可以重复多达40,60,或甚至100次。

荧光共振能量转移(FRET)

FRET技术(见例如美国专利No.4,996,143,5,565,322,5,849,489,和6,162,603)基于如下概念,即当供体发荧光模块和相应的受体发荧光模块彼此位于某个距离内时,在两种发荧光模块之间发生能量转移,其可以可视化或以其它方式检测和/或量化。典型地,当供体受到具有合适波长的光辐射激发时,供体将能量转移至受体。典型地,受体以具有不同波长的光辐射的形式重发射转移的能量。在某些系统中,可以通过包括实质性非发荧光供体模块的生物分子在供体和受体模块之间转移非发荧光能量(见例如美国专利No.7,741,467)。

在一个例子中,寡核苷酸探针可含有供体发荧光模块或染料(例如HEX或FAM)和相应的猝灭剂(例如BlackHole Quencher^TM(BHQ)(诸如BHQ-2)),其可以发荧光或可以不发荧光,且其以除了光以外的形式消散转移的能量。当探针完整时,典型地在供体和受体模块之间发生能量转移,使得来自供体发荧光模块的荧光发射受到受体模块淬灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间,结合至扩增产物的探针受到例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性切割,使得供体发荧光模块的荧光发射不再受到淬灭。用于这种目的的例示性探针描述于例如美国专利No.5,210,015,5,994,056,和6,171,785。常用供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用暗猝灭剂包括BlackHole Quencher^TM(BHQ)(诸如BHQ2)(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.),Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa),BlackBerry^TMQuencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。

在另一个例子中,可以在由寡核苷酸探针与巴贝虫靶核酸序列的互补性决定的特定位置处使每种含有发荧光模块的两种寡核苷酸探针与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针与扩增产物核酸在适宜位置杂交时,生成FRET信号。杂交温度的范围可以是约35℃至约65℃,达约10秒至约1分。

可以使用例如光子计数落射荧光(epifluorescent)显微镜系统(含有用于监测特定范围的荧光发射的适宜分色镜和滤色片),光子计数光电倍增管系统,或荧光计进行荧光分析。可以用氩离子激光,高强度汞(Hg)弧光灯,氙灯,导光纤维光源,或为了期望范围中的激发适宜过滤的其它高强度光源进行激发以启动能量转移,或容许直接检测荧光团。

如本文中就供体和相应的受体模块而言使用的,“相应的/对应的”指具有与供体发荧光模块的发射光谱交叠的吸收光谱的受体发荧光模块或暗猝灭剂。受体发荧光模块的发射光谱的最大波长应当比供体发荧光模块的激发光谱的最大波长大至少100nm。因而,可以在其之间产生有效的非放射性能量转移。

发荧光供体和相应的受体模块一般选择有(a)高效率Foerster能量转移；(b)较大的最终Stokes位移(>100nm)；(c)尽可能位移入可见光谱的红色部分(>600nm)的发射；和(d)位移至比通过供体激发波长处的激发生成的Raman水荧光发射要高的波长的发射。例如,可以选择如下的供体发荧光模块,其具有接近激光线(例如氦-镉442nm或氩488nm)的它的最大激发,高消光系数,高量子产量,和较好的它的荧光发射与相应的受体发荧光模块的激发光谱的交叠。可以选择如下的相应的受体发荧光模块,其具有高消光系数,高量子产量,较好的它的激发与供体发荧光模块的发射的交叠,和可见光谱的红色部分中的发射(>600nm)。

可以在FRET技术中与各种受体发荧光模块一起使用的代表性供体发荧光模块包括荧光素,萤光黄,B-藻红蛋白,9-吖啶异硫氰酸,萤光黄VS,4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸合均二苯乙烯-2,2’-二磺酸,7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸合苯基)-4-甲基香豆素,琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯,和4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸合均二苯乙烯-2,2’-二磺酸衍生物。取决于所使用的供体发荧光模块,代表性受体发荧光模块包括LC红640,LC红705,Cy5,Cy5.5,丽丝胺罗丹明B磺酰氯,四甲基罗丹明异硫氰酸酯,罗丹明x异硫氰酸酯,藻红异硫氰酸酯,荧光素,二亚乙基三胺五乙酸酯,或镧系离子(例如铕或铽)的其它螯合物。可以自例如Molecular Probes(Junction City,Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得供体和受体发荧光模块。

可以经由接头臂将供体和受体发荧光模块附着至适宜的探针寡核苷酸。每个接头臂的长度是重要的,因为接头臂会影响供体和受体发荧光模块之间的距离。接头臂的长度可以是核苷酸碱基至发荧光模块的以埃

计的距离。一般地,接头臂是约至约

接头臂可以是WO 84/03285中描述的种类的。WO 84/03285还公开用于将接头臂附着至特定核苷酸碱基,和还有用于将发荧光模块附着至接头臂的方法。

可以组合受体发荧光模块(诸如LC Red 640)与含有氨基接头(例如自ABI(FosterCity,Calif.)或Glen Research(Sterling,VA)可得的C6-氨基亚磷酰胺)的寡核苷酸以生成例如LC Red 640标记的寡核苷酸。频繁用于偶联供体发荧光模块(诸如荧光素)与寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC衍生的,例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland,Mass.)的荧光素-CPG),酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的,诸如来自BioGenex(San Ramon,Calif.)的CX-荧光素-CPG),或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3’-氨基-CPG。

巴贝虫扩增产物(扩增子)的检测

本公开提供用于检测生物学或非生物学样品中巴贝虫的存在或缺失的方法。所提供的方法避免样品污染,假阴性,和假阳性的问题。该方法包括实施至少一个包括使用一或多对巴贝虫引物自样品扩增巴贝虫靶核酸分子的一部分的循环步骤,和FRET检测步骤。实施多个循环步骤,优选在热循环仪中。可以使用巴贝虫引物和探针实施方法以检测巴贝虫的存在,而且巴贝虫的检测指示样品中巴贝虫的存在。

如本文中描述的,可使用利用FRET技术的经过标记的杂交探针来检测扩增产物。一种FRET格式利用

技术来检测扩增产物的存在或缺失,和因此巴贝虫的存在或缺失。

技术利用用例如一种发荧光模块或染料(例如HEX或FAM)和一种猝灭剂(例如BHQ-2)(其可以是或不是发荧光的)标记的一种单链杂交探针。当第一发荧光模块受到合适波长的光激发时,依照FRET的原理,所吸收的能量转移至第二发荧光模块或暗猝灭剂。第二模块一般是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤期间,经过标记的杂交探针结合靶DNA (即扩增产物)并在后续延伸阶段期间受到例如Taq聚合酶的5’至3’核酸酶活性降解。结果是,发荧光模块和猝灭剂模块变成在空间上彼此分开。后果是,一旦在猝灭剂缺失下激发第一发荧光模块,就能检测到来自第一发荧光模块的荧光发射。举例而言,ABI7700序列检测系统(AppliedBiosystems)使用

技术,而且适合于实施本文中描述的方法来检测样品中巴贝虫的存在或缺失。

分子信标联合FRET也可用于使用实时PCR方法检测扩增产物的存在。分子信标技术使用用第一发荧光模块和第二发荧光模块标记的杂交探针。第二发荧光模块一般是猝灭剂,而发荧光标记物典型地位于探针的每个末端。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为探针内形成二级结构的结果,当探针在溶液中时两个发荧光模块在空间上接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交后,探针的二级结构遭到破坏且发荧光模块变成彼此分开,使得在用合适波长的光激发后,能检测到第一发荧光模块的发射。

另一种常见格式的FRET技术利用两种杂交探针。可以用不同发荧光模块标记每种探针,而且一般设计成在靶DNA分子(例如扩增产物)中彼此紧邻杂交。通过

仪器的光源在470nm处激发供体发荧光模块,例如荧光素。在FRET期间,荧光素将它的能量转移至受体发荧光模块,诸如

红640(LC红640)或

红705(LC红705)。受体发荧光模块然后发射更长波长的光,其通过

仪器的光学检测系统检测。只有当发荧光模块处于直接局部接近时且当供体发荧光模块的发射光谱与受体发荧光模块的吸收光谱交叠时,才能发生有效FRET。可以关联发射信号的强度与最初靶DNA分子的数目(例如巴贝虫基因组的数目)。如果发生巴贝虫靶核酸的扩增且生成扩增产物的话,杂交步骤基于探针对成员之间的FRET导致可检测信号。

一般地,FRET的存在指示样品中巴贝虫的存在,而且FRET的缺失指示样品中巴贝虫的缺失。然而,标本收集不当,运输延迟,运输条件不当,或使用某些收集拭子(藻酸钙或铝杆)都是能影响测试结果的成功和/或准确性的条件。

可用于实践该方法的代表性生物学样品包括但不限于全血,呼吸道标本,尿液,粪便标本,血液标本,血浆,真皮拭子,鼻拭子,伤口拭子,血液培养物,皮肤,和软组织感染。本领域技术人员知道生物学样品的收集和贮存方法。可以加工(例如通过本领域知道的核酸提取方法和/或试剂盒)生物学样品以释放巴贝虫核酸,或者在一些情况中可以将生物学样品与PCR反应成分和适宜的寡核苷酸直接接触。在一些情况中,生物学样品是全血。当典型地收集全血时,常常在装有抗凝剂,诸如肝素,柠檬酸盐,或EDTA的器皿中收集它,得以在合适的温度贮存全血。然而,在此类条件下,全血内的核酸经历可观量的降解。因此,在会裂解,变性,和稳定全血成分,包括核酸的试剂,诸如核酸稳定溶液中收集血液可能是有利的。在此类情况中,可以更好地保存和稳定核酸以用于后续分离和分析,诸如通过核酸测试,诸如PCR。此类核酸稳定溶液是本领域公知的,包括但不限于cobas PCR介质,其含有4.2M胍盐(GuHCl)和50mM Tris,处于pH 7.5。

可以通过设计用于在分析前适当保存和贮存样品的任何方法或装置来收集样品。此类方法和装置是本领域公知的。在样品是生物学样品,诸如全血的情况中,该方法或装置可包括血液收集器皿。此类血液收集器皿是本领域公知的,而且可以包括例如血液收集管。在许多情况中,使用血液收集管可能是有利的,其中血液收集器皿在用于样品摄取的空间中是减压的,诸如带有真空室的血液器皿,诸如真空血液收集管。此类带有真空室的血液收集管,诸如真空血液收集管是本领域公知的。在有或无如下真空室的血液收集器皿中收集血液可能是进一步有利的,在该真空室内装有会裂解,变性和稳定全血成分,包括核酸的溶液,诸如核酸稳定溶液,使得抽取的全血立即接触血液收集器皿中的核酸稳定溶液。

解链曲线分析是循环概况中可以包括的额外步骤。解链曲线分析基于如下事实,即DNA在称作解链温度(Tm)的特征性温度解链,其定义为半数DNA双链体分开成单链的温度。DNA的解链温度主要取决于它的核苷酸组成。因而,富含G和C核苷酸的DNA分子具有比具有丰富A和T核苷酸的DNA分子要高的Tm。通过检测失去信号的温度,可以确定探针的解链温度。类似地,通过检测生成信号的温度,可以确定探针的退火温度。巴贝虫探针自巴贝虫扩增产物的解链温度能确认样品中巴贝虫的存在或缺失。

在每次热循环仪运行中,也可以循环对照样品。阳性对照样品能使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所描述的靶基因的扩增产物)。阳性对照样品也能扩增例如含有靶核酸分子(例如SEQ ID NO:8)的质粒构建物。此类质粒对照可以内部地(例如在样品内)或使用与用于检测预定靶相同的引物和探针与患者的样品并排在分开的样品运行中扩增。此类对照是扩增,杂交,和/或FRET反应成功或失败的指标。每次热循环仪运行还可以包括阴性对照,其例如缺乏靶模板DNA。阴性对照能测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此,对照反应能容易确定例如引物以序列特异性退火和启动延伸的能力,以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。

在一个实施方案中,该方法包括用于避免污染的步骤。例如,利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的一种酶促方法描述于美国专利No.5,035,996,5,683,896和5,945,313,用于降低或消除一个热循环仪运行和下一个之间的污染。

可以使用常规PCR方法连同FRET技术来实践该方法。在一个实施方案中,使用

仪器。下面的专利申请描述如技术中使用的实时PCR:WO 97/46707,WO 97/46714,和WO 97/46712。

可以使用PC工作站操作

且可以利用Windows NT操作系统。随着机器将毛细管顺序放置在光学单元上获得来自样品的信号。软件能在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间是10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤后,可以为所有样品连续更新荧光的定量显示与循环数。可以存储所生成的数据用于进一步分析。

作为FRET的一种备选,可以使用双链DNA结合染料,诸如发荧光DNA结合染料(例如

绿或

金(Molecular Probes))检测扩增产物。一旦与双链核酸相互作用,此类发荧光DNA结合染料就在用合适波长的光激发后发射荧光信号。也可以使用双链DNA结合染料,诸如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时,通常实施解链曲线分析来确认扩增产物的存在。

本领域技术人员会领会,也可以采用其它核酸或信号扩增方法。此类方法的例子包括但不限于分支DNA信号扩增,环介导的等温扩增(LAMP),基于核酸序列的扩增(NASBA),自持序列复制(3SR),链置换扩增(SDA),或智能扩增过程版本2(SMAP 2)。

理解的是,本公开的实施方案不受一或多种可商购仪器的配置限制。

制品/试剂盒

本公开的实施方案进一步提供用于检测巴贝虫的制品或试剂盒。制品可包括用于检测巴贝虫基因靶的引物和探针,连同合适的包装材料。用于检测巴贝虫的代表性引物和探针能够与巴贝虫靶核酸分子杂交。另外,试剂盒还可以包括DNA固定化,杂交,和检测需要的合适包装的试剂和材料,诸如固体支持物,缓冲剂,酶,和DNA标准品。本文中公开了设计引物和探针的方法,而且提供了扩增巴贝虫靶核酸分子和与其杂交的引物和探针的代表性例子。

制品还可以包括一或多种用于标记探针的发荧光模块,或者,随试剂盒供应的探针可以是经过标记的。例如,制品可包括用于标记巴贝虫探针的供体和/或受体发荧光模块。上文提供了合适的FRET供体发荧光模块和相应的受体发荧光模块的例子。

制品还可以含有包装插页或包装标签,其上具有关于使用巴贝虫引物和探针检测样品中的巴贝虫的说明书。制品可以另外包括用于进行本文中公开的方法的试剂(例如缓冲剂,聚合酶,辅因子,或用于防止污染的药剂)。此类试剂可以是专门用于本文中描述的可商购仪器之一。

本公开的实施方案还提供用于检测样品中的巴贝虫的一套引物和一或多种可检测探针。

会在下面的实施例中进一步描述本公开的实施方案,实施例并不限制权利要求书中描述的发明的范围。

实施例

提供了下面的实施例和图以帮助理解主题,其真实范围在所附权利要求书中列出。理解的是,可以在不背离本发明的精神的情况下在所列出的规程中进行修饰。

测试是全自动化样品制备(核酸提取和纯化),继以PCR扩增和检测。所使用的系统是

6800/8800系统,其由样品供应模块,转移模块,加工模块,和分析模块组成。自动化数据管理由6800/8800系统实施。

靶核酸的选择性扩增通过使用选自靶核酸的高度保守区域的特异性正向和反向引物来实现。将热稳定DNA聚合酶用于逆转录和扩增二者。主要混合物包括脱氧尿苷三磷酸(dUTP),代替脱氧胸苷三磷酸(dTTP),其掺入新合成的DNA(扩增产物或扩增子)。当在第一个热循环步骤中加热时,来自先前PCR运行的任何污染性扩增子遭到PCR混合物中包括的AmpErase酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)破坏。然而,新形成的扩增子不受破坏,因为AmpErase酶一旦暴露于55℃以上的温度就灭活。

巴贝虫主要混合物含有对巴贝虫和对照核酸特异性的检测探针。特异性巴贝虫和对照检测探针每一种用两种独特的起报告物作用的发荧光染料之一标记。每一种探针还具有起猝灭剂作用的第二染料。以限定的波长测量报告物染料,因而允许检测和区分扩增的巴贝虫靶和对照。完整探针的荧光信号受到猝灭剂染料遏制。在PCR扩增步骤期间,探针对特定单链DNA模板的杂交导致受到DNA聚合酶的5’至3’核酸酶活性的切割,导致报告物和猝灭剂染料分开和荧光信号生成。随着每一个PCR循环,生成越来越多量的受到切割的探针且报告物染料的累积信号随着升高。因为在限定波长测量两种特定报告物染料,所以有可能同时检测和区分扩增的巴贝虫靶和对照。

用于巴贝虫测试的引物和探针是如下设计的,即基于比对在最保守区域中沿着基因组播种引物和探针。然后将引物和探针组合入测定法并基于包容性和排他性计算机评估对测定法打分。在基因组保守性以外,测定法的打分中还包括基因组覆盖率(其高度依赖于什么序列是公众可得的)。巴贝虫基因组的靶定区域是巴贝虫属物种田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的18S基因。设计了一套寡核苷酸(SEQ ID NO:1-3)来检测田鼠巴贝虫,其在本文中常常称作“395,”并设计了另一套寡核苷酸(SEQ ID NO:4-7)来检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫。设计用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套寡核苷酸包括两套不同寡核苷酸,如下:(1)第一套包括寡核苷酸SEQ ID NO:4-6(在本文中常常称作“DDVR”)；和(2)第二套包括寡核苷酸SEQ ID NO:4-7(在本文中常常称作“DDVR2”)。

实施例1:通过实时PCR扩增和检测田鼠巴贝虫

使用设计用于扩增和检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组(正向引物SEQ ID NO:1,反向引物SEQ ID NO:3,和探针SEQ ID NO:2),并使用pEF113(pUC19中的田鼠巴贝虫株Gray)(图1)或田鼠巴贝虫基因组DNA(图2)测试用于巴贝虫18S rRNA基因的田鼠巴贝虫核酸测试。所使用的试剂包括

6800/8800通用PCR主要混合物,及与

6800/8800一起使用的概况和条件,并使用

扩增和检测技术。主要混合物中寡核苷酸的终浓度对于引物是0.3μM且对于探针是0.1μM。下文表2中描绘了所采用的

6800/8800PCR概况:

表2

这些研究显示在这些条件下,寡核苷酸(SEQ ID NO:1-3)能够扩增和检测田鼠巴贝虫(见图1和2)。

还实施了终点稀释系列分析以评估这种系统中的检测下限。使用ddPCR量化田鼠巴贝虫pUC19质粒(pEF113),稀释,和测试。下文在表3中显示了终点稀释分析的结果。

表3

检测限测定为3.32个拷贝的质粒DNA每个PCR,置信度95％。

因而,这些结果证明引物和探针(SEQ ID NO:1-3)在实时PCR测定法中有效且特异性扩增和检测田鼠巴贝虫的存在。

实施例2:通过实时PCR扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫

使用设计用于扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组(正向引物SEQ ID NO:4,反向引物SEQ ID NO:6,和探针SEQ ID NO:5),并使用质粒pEF114(分歧巴贝虫),pEF115(邓肯巴贝虫),和pEF116(猎户巴贝虫),或来自邓肯巴贝虫(ATCC PRA 302)的总核酸(图3)测试用于巴贝虫18S rRNA基因的分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫(这里常常称作“DDV”)核酸测试。所使用的试剂包括6800/8800通用PCR主要混合物,及与

6800/8800一起使用的概况和条件,并使用

扩增和检测技术。主要混合物中寡核苷酸的终浓度对于引物是0.3μM且对于探针是0.1μM。上文表2中描绘了所采用的6800/8800PCR概况。这些研究显示在这些条件下,寡核苷酸(SEQ ID NO:4-6)能够扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫(见图3)。

因而,这些结果证明引物和探针(SEQ ID NO:4-6)在实时PCR测定法中有效且特异性扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的存在。

实施例3:通过实时PCR多路扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫

因为用于扩增和检测田鼠巴贝虫的测定法(SEQ ID NO:1-3；实施例1；和图1-2)和用于扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的测定法(“DDV,”SEQ ID NO:4-6；实施例2；和图3)在单路中显示较好的性能,所以在与关于单路测试所述相同的条件下在多路设置中测试测定法。

正如预期的,图4显示田鼠巴贝虫靶在多路设置中受到SEQ ID NO:1-3强扩增和检测,而且受到DDV寡核苷酸(即SEQ ID NO:4-6)弱扩增和检测。类似地,图4还显示分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫没有受到SEQ ID NO:1-3扩增和检测,但是受到DDV寡核苷酸(即SEQ ID NO:4-6)强扩增和检测。

实施例4:优化探针的荧光团和猝灭剂之间的间距

以荧光团和猝灭剂之间的不同间距评估田鼠巴贝虫探针(即SEQ ID NO:2)以确定最佳间距(见图5)。在与先前实施例1-3中所述相同的条件下测试测定法。虽然探针以荧光团和猝灭剂之间7和10个碱基的间距是有效的,但是间距10的探针展现相似的终点RFI和更好的包容性(见图5和6)。

因而,巴贝虫探针在荧光团和猝灭剂之间的间距的宽范围内是有效且特异性的,包括7-10个碱基之间。

实施例5:优化探针染料

以不同发荧光模块或发荧光染料(FAM和HEX)评估田鼠巴贝虫探针(即SEQ ID NO:2)。在与先前实施例1-4中所述相同的条件下测试测定法。虽然探针对FAM或HEX发荧光模块/染料是有效的,但是HEX标记的探针展现更低的基线,导致大大升高的信号(见图7)。

因而,巴贝虫探针对多种不同类型的发荧光模块/染料是有效且特异性的,包括FAM和HEX。

实施例6:PCR后分析

用检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸(SEQ ID NO:1-3)实施PCR后分析。实施这项PCR后分析以便确保有效扩增,如通过寡核苷酸消减和有效探针切割证明的。如图8中可见,田鼠巴贝虫寡核苷酸(SEQ ID NO:1-3)展现寡核苷酸消减和探针切割。

因而,巴贝虫寡核苷酸确保有效扩增,如通过寡核苷酸消减和有效探针切割证明的。

实施例7:在全血中通过实时PCR多路扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫

在全血中测试用于扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸。简言之,通过在cobas PCM介质(CPM)中裂解巴贝虫培养物来生成二级标准品。cobas PCR介质是一种裂解,变性,和稳定全血成分(包括核酸)的分析前试剂。cobasPCR介质含有胍盐(这里是GuHCl,4.2M)和Tris(这里是50mM),处于pH 7.5。以这种方式生成用于四种不同巴贝虫属物种(田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫)的四种分开的标准品。在cobas PCR介质中将二级标准品稀释至中等水平,然后加标入全血:cobasPCR介质混合物。全血:cobas PCR介质混合物是1份全血,和7份cobas PCR介质。每种标准品的终浓度如下文表4中显示的。

表4

在先前(实施例1-6)所述条件下,将标准品加标全血提交用于扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸(SEQ ID NO:1-3和4-6)。结果显示于图9-11。图9揭示用于检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-3与用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:4-6组合(在多路设置中)能够特异性且有效扩增和检测全血中的田鼠巴贝虫。图10-11揭示用于检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-3与用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:4-6组合(在多路设置中)能够特异性且有效扩增和检测全血中的分歧巴贝虫(图10A和11),邓肯巴贝虫(图10B和11),和猎户巴贝虫(图10C和11)。因而,这些结果证明寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-6特异性且有效扩增和检测全血中的田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫。这些结果还证明cobas PCR介质裂解,变性,和稳定全血成分,包括核酸。

实施例8:用用于分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的成对反向引物在全血中通过实时PCR多路扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫

进行了进一步的研究以展示如上文实施例7,在全血中通过实时PCR多路扩增和检测田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫,但是使用用于扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一对反向引物。就是说,测试了用于扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一个新寡核苷酸套组。特别地,与反向引物SEQ ID NO:6一起使用新反向引物SEQ ID NO:7。然后与设计用于扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的正向引物SEQ ID NO:4和探针SEQ ID NO:5组合使用两种不同反向引物(SEQ ID NO:6和7)。然后组合设计用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:4-7与设计用于检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-3以调查组合寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7是否能扩增和检测全血中的田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫。条件与先前描述的先前全血研究所述相同。每种标准品的终浓度如下文表5中所示。

表5

结果显示于图12-14。图12揭示用于检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-3与用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:4-7组合(在多路设置中)能够特异性且有效扩增和检测全血中的田鼠巴贝虫。图13-14揭示用于检测田鼠巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-3与用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的寡核苷酸套组SEQ ID NO:4-7组合(在多路设置中)能够特异性且有效扩增和检测全血中的分歧巴贝虫(图13A和14),邓肯巴贝虫(图13B和14),和猎户巴贝虫(图13C和14)。

然后再现这些实验就它们检测和扩增全血中的田鼠巴贝虫(数据未显示),分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的能力比较寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-6与寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7。这些结果显示于图15。寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7等量采用两种反向引物,SEQ ID NO:6和7。图15显示使用寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-6(图15A)与寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7(图15B)时分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的曲线。特别地,分析了邓肯巴贝虫的PCR曲线(图16-17)。这些数据揭示寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7(图16B)展现与寡核苷酸套组SEQ ID NO:6(图16A)相比改善的邓肯巴贝虫扩增。就是说,虽然寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-6(其包括一种反向引物(SEQ ID NO:6)来扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫)能够成功扩增和检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫,但是寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-7(其等量包括两种反向引物(SEQ ID NO:6和7)来扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫),成对反向引物(SEQ ID NO:6和7)展现改善的邓肯巴贝虫扩增(图17)。

因而,这些结果证明寡核苷酸套组SEQ ID NO:1-6特异性且有效扩增和检测全血中的田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫。这些结果还证明cobas PCR介质裂解,变性,和稳定全血成分,包括核酸。

序列表

<110> 罗氏诊断公司（Roche Diagnostics GmbH）

豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）

罗氏分子系统公司（Roche Molecular Systems, Inc.）

<120> 用于检测巴贝虫的组合物和方法

<130> P34266-WO-KOE

<150> US 62/534046

<151> 2017-07-18

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (23)..(23)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 1

acctgctaaa ttaggatctg gga 23

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<220>

<221> 混杂特征

<222> (0)..(1)

<223> HEX-Thr

<220>

<221> 混杂特征

<222> (10)..(11)

<223> BHQ-2

<220>

<221> 混杂特征

<222> (33)..(34)

<223> 磷酸酯

<400> 2

ctgttccagt atcgcttctt agagggactt tgc 33

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (24)..(24)

<223> 叔丁基苄基-dC

<400> 3

tgttattgcc ttacacttcc ttgc 24

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (16)..(16)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 4

gatgtcctgg gctgca 16

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<220>

<221> 混杂特征

<222> (0)..(1)

<223> HEX-Thr

<220>

<221> 混杂特征

<222> (8)..(9)

<223> BHQ-2

<220>

<221> 混杂特征

<222> (29)..(30)

<223> 磷酸酯

<400> 5

aactcgatga atgcatcagt gtagcgcg 28

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (22)..(22)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 6

ccccgtcacg atgcatacta aa 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (22)..(22)

<223> 叔丁基苄基-dA

<400> 7

ccccatcacg atgcatacta aa 22

<210> 8

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 阳性对照

<400> 8

gattagatct aattccacca ggtccagaca tagagaggat tgacagattg atagctcttt 60

cttgattcta tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttg gtggagtgat ttgtctggtt 120

aattccgtta acgaacgaga ccttaacctg ctaaattagg atctgggaca agctttgctg 180

ttccagtatc gcttcttaga gggactttgc gttcataaaa cgcaaggaag tgtaaggcaa 240

taacaggtct gtgatgccct tagatgtcct gggctgcacg cgcgctacac tgatgcattc 300

aacgagtttt tccttggccg tcgggtccgg gtaatcttac agtatgcatc gtgatgggga 360

tagattattg caattattaa tcttgaaaca tgaggattac ccatgtctcg aggtgtaat 419

Claims

1.一种检测样品中巴贝虫(Babesia)的方法,该方法包含:

(a)实施扩增步骤,其包含使样品与一或多套引物接触以生成扩增产物,如果样品中存在巴贝虫的靶核酸的话；

(b)实施杂交步骤,其包含使扩增产物,如果样品中存在巴贝虫的靶核酸的话,与一或多种探针接触；和

(c)检测扩增产物的存在或缺失,其中扩增产物的存在指示样品中巴贝虫的存在,且其中扩增产物的缺失指示样品中巴贝虫的缺失；且

其中一或多套引物包含一或多种引物,一或多种引物包含由SEQ ID NO:1,3,4,6,和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物；且

其中一或多种探针包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。

2.权利要求1的方法,其中巴贝虫包含由田鼠巴贝虫(B.microti),分歧巴贝虫(B.divergens),邓肯巴贝虫(B.duncani),和猎户巴贝虫(B.venatorum)组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。

3.权利要求1或2的方法,其中巴贝虫属物种由巴贝虫属物种田鼠巴贝虫组成。

4.前述权利要求任一项的方法,其中一或多套引物包含:包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物,和包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且其中一或多种探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物。

5.权利要求1至3任一项的方法,其中一或多套引物包含:包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物,和包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且其中一或多种探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。

6.权利要求5的方法,其中包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种第二引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ IDNO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。

7.权利要求5或6的方法,其中引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

8.权利要求1,2或5-7任一项的方法,其中检测田鼠巴贝虫的方法包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的方法包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。

9.权利要求8的方法,其中

(a)用于扩增田鼠巴贝虫的那套引物包含:(i)包含SEQ ID NO:1的核酸序列,或其互补物的第一引物；和(ii)包含SEQ ID NO:3的核酸序列,或其互补物的第二引物；且

用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且

(b)用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的那套引物包含:

(i)包含SEQ ID NO:4的核酸序列,或其互补物的引物；和(ii)包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物；且

用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针包含SEQ IDNO:5的核酸序列,或其互补物。

10.权利要求8的方法,其中包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。

11.权利要求10的方法,其中引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

12.前述权利要求任一项的方法,其中杂交步骤包含使扩增产物与一或多种探针接触,其中一或多种探针是用供体发荧光模块和相应的受体模块标记的；且检测步骤包含检测一或多种探针的供体发荧光模块和受体模块之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或缺失,其中荧光的存在或缺失指示样品中巴贝虫的存在或缺失。

13.权利要求12的方法,其中供体发荧光模块是HEX或FAM。

14.权利要求12的方法,其中受体模块是猝灭剂。

15.权利要求12的方法,其中供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。

16.一种检测样品中巴贝虫的方法,其中样品是全血,该方法包含:

(a)实施扩增步骤,其包含使样品与一或多套引物接触以生成扩增产物,如果全血样品中存在巴贝虫的靶核酸的话；

17.权利要求16的方法,其中巴贝虫属物种包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。

18.权利要求16或17的方法,其中检测田鼠巴贝虫的方法包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的方法包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。

19.权利要求16-18任一项的方法,其中

20.权利要求16-19任一项的方法,其中包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。

21.权利要求20的方法,其中引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

22.一种用于检测样品中可能存在的巴贝虫的核酸的试剂盒,该试剂盒包含扩增试剂,包含DNA聚合酶,核苷酸单体,包含一或多种引物的一或多套引物,和包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物的一或多种探针,其中一或多种引物包含由SEQ ID NO:1,3,4,6,和7组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。

23.权利要求22的试剂盒,其中巴贝虫包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。

24.权利要求22或23的试剂盒,其中试剂盒包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中试剂盒包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。

25.权利要求22-24任一项的试剂盒,其中

26.权利要求22-25任一项的试剂盒,其中包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核苷酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物。

27.权利要求22-26任一项的试剂盒,其中引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ IDNO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

28.权利要求22-27任一项的试剂盒,其中一或多种探针包含供体发荧光模块和相应的受体模块。

29.权利要求28的试剂盒,其中供体模块是HEX或FAM。

30.权利要求28的试剂盒,其中受体模块是猝灭剂。

31.权利要求28的试剂盒,其中供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。

32.用于检测样品中巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针,其中一或多套引物包含一或多种引物,一或多种引物包含选自SEQ ID NO:1,3,4,6,和7的组中任一项的核酸序列,或其互补物；且其中一或多种探针包含由SEQ ID NO:2和5组成的组中任一项的核酸序列,或其互补物。

33.权利要求32的一或多套引物和一或多种探针,其中巴贝虫包含由田鼠巴贝虫,分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫组成的组中任一或多种巴贝虫属物种。

34.权利要求32或33的一或多套引物和一或多种探针,其中用于检测田鼠巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针包含用于扩增田鼠巴贝虫的一套引物,和用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的探针；且其中用于检测分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一或多套引物和一或多种探针包含用于扩增分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的一套引物,和用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的探针。

35.权利要求32-34任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中

用于与田鼠巴贝虫的扩增产物杂交的一或多种探针包含SEQ ID NO:2的核酸序列,或其互补物；且

用于与分歧巴贝虫,邓肯巴贝虫,和猎户巴贝虫的扩增产物杂交的一或多种探针包含SEQ ID NO:5的核酸序列,或其互补物。

36.权利要求32-35任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中包含由SEQ ID NO:6和7组成的组中任一或多项的核酸序列,或其互补物的一或多种引物构成引物混合物,其中引物混合物包含:(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ IDNO:7的核酸序列,或其互补物的引物。

37.权利要求32-36任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中引物混合物包含有等量的(i)包含SEQ ID NO:6的核酸序列,或其互补物的引物,和(ii)包含SEQ ID NO:7的核酸序列,或其互补物的引物的混合物。

38.权利要求32-37任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中一或多种探针包含供体发荧光模块和相应的受体模块。

39.权利要求32-38任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中供体模块是HEX或FAM。

40.权利要求32-39任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中受体模块是猝灭剂。

41.权利要求32-40任一项的一或多套引物和一或多种探针,其中供体发荧光模块和受体模块彼此在5至20个核苷酸内。