CN117441029A - 用于检测具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)变体的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于快速检测生物学样品或非生物学样品中的在刺突(S)蛋白基因中含有突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的变体的存在的方法。所述方法可包括进行扩增步骤、杂交步骤和检测步骤。此外,提供了经设计用于检测含有S基因突变特别是60‑70缺失、N501Y和484K突变的SARS‑CoV‑2变体的引物和探针以及试剂盒,所述引物和探针靶向含有S基因突变的SARS‑CoV‑2变体。还请求保护的是用于采用阻断探针进行等位基因特异性扩增的特异性方法,所述阻断探针的至少一个核苷酸是LNA核苷酸。
Description
技术领域
本公开涉及病毒诊断领域,并且更具体地涉及包含刺突(S)蛋白基因中突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的变体的检测。
背景技术
冠状病毒科的病毒具有长度范围为26至32千碱基的单链、正义的RNA基因组。已经在几种鸟类宿主以及各种哺乳动物(包括骆驼、蝙蝠、果子狸、老鼠、狗和猫)中发现了冠状病毒。现在经常鉴定出新型哺乳动物冠状病毒。例如,蝙蝠来源的HKU2相关冠状病毒是2018年猪致命性急性腹泻综合征的病因。
在对人类致病的几种冠状病毒中,大多数都与轻微的临床症状相关联,有两个值得注意的例外:严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV),在2002-2003年间,在37个国家导致超过8000人感染以及774人死亡;和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV),该病毒于2012年在沙特阿拉伯首次检测到并且自2012年9月以来已造成2494例实验室确诊感染的病例以及858例死亡,包括38人在单次传入韩国后死亡。
使用下一代测序鉴定了一种新型感染人类的冠状病毒,最初命名为2019年新冠状病毒(2019-nCoV)。这种新型冠状病毒被归入冠状病毒家族、β冠状病毒属和沙贝病毒亚属,并描述在Lu,R.等人的“Genomic characterization and epidemiology of 2019novelcoronavirus:implications for virus origins and receptor binding”,Lancet,2020,Vol.395,p.565-574中。世界卫生组织(WHO)在2020年2月11日宣布该病毒的正式名称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
为了对抗SARS-CoV-2的传播并降低与COVID-19相关联的发病率和死亡率,正在推行多项研究和产品开发策略。其中包括mRNA的开发、病毒载体和蛋白质亚单位疫苗、小分子抗病毒药物、免疫调节剂和其他非药物干预。迄今为止,已研究和开发的疫苗主要集中在病毒包膜糖蛋白(刺突,S)上,并且迄今为止已取得了显著的成功。此外,靶标S的单克隆抗体已被开发为抗病毒药物,并且如果在感染或症状出现后立即施用,是有效的治疗方法。还可以对未感染的个体施用单克隆抗体,以防止SARS-CoV-2感染。
与所有RNA病毒一样,由于容易出错的RNA依赖性RNA聚合酶和庞大的种群规模,SARS-CoV-2具有响应外部选择压力而进化的倾向。虽然冠状病毒作为复制酶复合物的一部分具有校对功能,但其在每个宿主和大量感染者中的高复制率导致大量病毒变体的生成,从中可以出现更合适的变体。强烈但不完全的复制抑制可能发生在具有部分免疫力或接受单一抗S单克隆抗体治疗的感染者身上,几乎肯定会导致选择具有S逃逸突变的SARS-CoV-2变体在易感宿主群体中比野生型病毒具有更高的复制适应性。类似地,如果自然发生的变体在免疫学上未接触过的人群中传播能力增强,它就可以在相对较短的时间内击败野生型病毒。
SARS-CoV-2大流行一年多来,全球传播失控并且病毒发生显著进化,出现了数百种变体。其中一些变体被视为关注的变体(VOC),诸如英国(B.1.1.17)、南非(B.1.351)、巴西(P.1/B.1.1.248)和兴趣变体(VOI)美国[B.1.526(纽约)和B.1.427/B.1.429(加利福尼亚州和俄亥俄州)]可能更具传染性和/或影响治疗或疫苗反应。流行病学和病毒学评估已证实,更多的可传播VOC现在正在独立出现,英国于2020年12月首次报告,并且紧随其后,南非的报告示出一种独特的谱系迅速传播,在几周内成为主要谱系。虽然突变的全部意义尚未确定,但基因组数据示出其他谱系的快速置换,表明该谱系可能与传播性增加相关联。来自巴西的变体于2020年12月初出现,并且到2021年1月中旬,已经引起病例大规模反弹。对疫苗和相关刺突介导的SARS-CoV-2适应性的关注导致对选定的VOC进行流行病学和监测工作的需要。在这些新出现菌株中发现的关键突变(del 69-70、N501Y、E484K)正被用来追踪这些最关注的菌株的传播。SARS-CoV-2刺突基因中的突变使病毒具有高度传播性。因此,本领域需要一种快速、可靠、特异性和灵敏的方法来检测SARS-CoV-2的变体,特别是那些包含69-70缺失(del69-70)和在刺突蛋白基因中的N501Y和E484K突变。
发明内容
本公开涉及用于快速检测生物学或非生物学样品中具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体存在或不存在的方法,例如,通过在单个试管中进行定性或定量实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来多重检测SARS-CoV-2变体。实施例包括检测携带一种或多种包含del 69-70、N501Y和E484K的突变的SARS-CoV-2变体的方法,该方法包括进行逆转录步骤和至少一个循环步骤,该循环步骤可包括扩增步骤和杂交步骤。此外,本公开包括被设计用于在单管中检测SARS-CoV-2变体的引物、探针和试剂盒。
在一个方面,提供了用于检测样品中具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体的方法,其包括:进行扩增步骤,其包括使样品与一组引物接触,如果样品中存在SARS-CoV-2核酸,则产生扩增产物;进行杂交步骤,其包括使扩增产物与一种或多种可检测探针接触;以及检测扩增产物的存在,其中扩增产物的检出指示样品中SARS-CoV-2变体的存在;其中该一组引物包含:第一引物和第二引物,第一引物包含或由选自由SEQ ID NO:1-5或其互补序列组成的组的第一寡核苷酸序列组成、第二引物包含或由选自由SEQ ID NO:7-14或其互补序列组成的组的第二寡核苷酸序列组成;其中一种或多种可检测探针包含或由选自由SEQID NO:16-25或其互补序列组成的组的第三寡核苷酸序列组成;和其中刺突蛋白突变选自69-70缺失(del69-70)、N501Y突变、或E484K突变、或它们的组合。在一个实施例中,步骤在一种或多种阻断寡核苷酸探针的存在下进行。在进一步的实施例中,一种或多种阻断寡核苷酸探针包含或由SEQ ID NOs:37、38或39,或它们的任意组合的寡核苷酸序列组成。
在另一方面,提供了用于检测样品中具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体的多重方法,其包括:进行扩增步骤,其包括使样品与至少两组引物接触,如果样品中存在SARS-CoV-2核酸,则产生第一和第二扩增产物;进行杂交步骤,其包括使扩增产物与由至少两组引物产生的第一和第二扩增产物杂交的至少两种可检测探针接触;以及检测至少一种扩增产物的存在,其中至少一种扩增产物的存在指示样品中SARS-CoV-2变体的存在;并且其中第一组引物包括包含或由SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列组成的正向引物,和包含或由SEQID NO:7或8的寡核苷酸序列组成的反向引物;并且第二组引物包括包含或由SEQ ID NO:2的寡核苷酸序列组成的正向引物,和包含或由SEQ ID NO:9、10或11的寡核苷酸序列组成的反向引物;并且其中与由第一组引物产生的第一扩增产物杂交的第一可检测探针包含或由选自SEQ ID NO:16-17或其互补序列组成的组的寡核苷酸序列组成;并且其中与由第二组引物产生的第二扩增产物杂交的第二可检测探针包含或由选自SEQ ID NO:18-20或其互补序列组成的组的寡核苷酸序列组成;并且其中刺突蛋白突变选自69-70缺失(del 69-70)、N501Y突变、或E484K突变、或它们的组合。在一个实施例中,步骤在一种或多种阻断寡核苷酸探针存在下进行,该阻断寡核苷酸探针包含或由SEQ ID NOs:37、38或39,或它们的任意组合的寡核苷酸序列组成。
本文中,SARS CoV-2变体选自刺突蛋白中的69-70缺失(del 69-70)、N501Y突变、或E484K突变、或它们的组合,分别是由于S基因的突变和缺失。在一些实施例中,第一或第二可检测探针与引起SARS-CoV-2的69-70缺失的S基因序列特异性杂交。在一些实施例中,第一或第二可检测探针与引起SARS-CoV-2的N501Y突变的S基因序列特异性杂交。在一些实施例中,第一或第二可检测探针与引起SARS-CoV-2的E484K突变的S基因序列特异性杂交。在一个实施例中,一种或多种阻断探针包含或由寡核苷酸序列组成,该寡核苷酸序列与野生型S基因序列在刺突蛋白的氨基酸位置69-70、或在氨基酸位置484或在氨基酸位置501完美匹配。在一些实施例中,一种或多种阻断探针包含或由SEQ ID NO:37、38或39和它们的组合的寡核苷酸序列组成。在进一步的实施例中,提供了一组引物和可检测探针,引物扩增来自SARS-CoV-2的非结构开放阅读框(ORF1a/b)的特异性核酸序列,可检测探针与由该一组引物生成的ORF1a/b扩增产物杂交并检测该ORF1a/b扩增产物。在一个实施例中,该一组引物包括正向引物和反向引物,正向引物包含或由SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列组成,反向引物包含或由SEQ ID NO:15的寡核苷酸序列组成;并且可检测探针包含或由SEQ ID NO:36或其互补序列的寡核苷酸序列组成。
在一个实施例中,用于扩增SARS-CoV-2变体的该一组引物包括:包含或由SEQ IDNO:1的寡核苷酸序列组成的第一引物、和包含或由SEQ ID NO:7或8的寡核苷酸序列组成的第二引物、和包含或由SEQ ID NO:16或17或其互补序列的寡核苷酸序列组成的可检测探针。在另一个实施例中,第一引物包含或由选自由SEQ ID NO:2组成的组的寡核苷酸序列,第二引物包含或由SEQ ID NO:9-11的寡核苷酸序列组成,并且可检测探针包含或由SEQ IDNO:18-20或其互补序列的寡核苷酸序列组成。在一个实施例中,第一引物包含或由选自由SEQ ID NO:1组成的组的寡核苷酸序列,第二引物包含或由SEQ ID NO:8的寡核苷酸序列组成,并且可检测探针包含或由SEQ ID NO:17或其互补序列的寡核苷酸序列组成。在另一个实施例中,第一引物包含或由选自由SEQ ID NO:2组成的组的寡核苷酸序列,第二引物包含或由SEQ ID NO:10的寡核苷酸序列组成,并且可检测探针包含或由SEQ ID NO:19或其互补序列的寡核苷酸序列组成。在又另一个实施例中,第一引物包含或由选自由SEQ ID NO:2组成的组的寡核苷酸序列,第二引物包含或由SEQ ID NO:10的寡核苷酸序列组成,并且可检测探针包含或由SEQ ID NO:20或其互补序列的寡核苷酸序列组成。
其他方面提供了包含选自或由SEQ ID NO:1-39或其互补序列的核苷酸序列组成的寡核苷酸,其具有100个或更少的核苷酸。在另一方面,本公开提供了包括与SEQ ID NO:1-39中的一个或其互补序列具有至少70%序列同一性(例如,至少75%、80%、85%、90%或95%等)的核酸的寡核苷酸,其具有100个或更少的核苷酸。一般来讲,在这些实施例中,这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核酸等。
在某些方面,寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸(例如,35个或更少的核苷酸、30个或更少的核苷酸、25个或更少的核苷酸、20个或更少的核苷酸、15个或更少的核苷酸等)。在一些方面,寡核苷酸包含至少一种经修饰的核苷酸,例如,以改变相对于未经修饰的核苷酸的核酸杂交稳定性。任选地,寡核苷酸包含至少一个标记和任选地至少一个猝灭剂部分。
一方面,扩增可以使用具有5'至3'核酸酶活性的聚合酶。因此,供体荧光部分和受体部分(例如猝灭剂)沿着探针的长度可彼此相距不超过5至20个核苷酸(例如在8个或10个核苷酸以内)。另一方面,探针包括允许二级结构形成的核酸序列。这种二级结构的形成可使得第一和第二荧光部分之间的空间接近。根据该方法,探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
一方面,用于检测SARS CoV-2变体的可检测探针可以用荧光染料标记,其充当报告物。探针还可具有充当猝灭剂的第二染料。报告物染料在定义的波长下测量,从而允许检测和区分经扩增的SARS-CoV-2靶标。完整探针的荧光信号被猝灭剂染料抑制。在PCR扩增步骤期间,探针与特异性单链DNA模板的杂交导致DNA聚合酶的5'到3'核酸酶活性的切割,从而导致报告物染料和淬灭剂染料分离,并生成荧光信号。随着每个PCR循环,生成越来越多数量的经切割的探针,并且报告物染料的累积信号也随之增加。任选地,一种或多种另外的探针(例如,诸如内部参考对照或其他靶向探针(例如,其他病毒核酸)也可以用报告物荧光染料标记,其独特并且不同于与SARS-CoV-2探针相关联的荧光染料标记。在这种情况下,因为特异性报告物染料是在定义的波长下测量的,所以可以同时检测和区分经扩增的SARS-CoV-2靶标以及一种或多种另外的探针。
本公开还提供了检测来自个体的生物学样品中SARS-CoV-2变体或在刺突蛋白基因中包含突变或缺失的SARS-CoV-2核酸的存在或不存在的方法。这些方法可用于检测鼻咽(NSP)和口咽拭子样品中SARS-CoV-2变体或具有刺突基因突变或缺失的SARS-CoV-2的存在或不存在,用于诊断测试。此外,本领域有经验的人可以使用相同的测试来评估其他样品类型,以检测SARS-CoV-2变体或SARS-CoV-2刺突基因突变和缺失。此类方法通常包括执行逆转录步骤和至少一个循环步骤,该至少一个循环步骤包括扩增步骤和染料结合步骤。通常,扩增步骤包括使样品与多对寡核苷酸引物接触以产生一种或多种扩增产物,如果核酸分子存在于样品的话,并且染料结合步骤包括使扩增产物与双链DNA结合染料接触。此类方法还包括检测存在或不存在双链DNA结合染料结合到扩增产物中,其中存在结合指示样品中存在SARS-CoV-2变体或SARS-CoV-2刺突基因突变和缺失,并且其中不存在结合指示样品中不存在SARS-CoV-2变体或SARS-CoV-2刺突基因突变和缺失。代表性的双链DNA结合染料是溴化乙锭。其他核酸结合染料包括DAPI、和花青染料,诸如/>和/>Green。此外,此类方法还可包括确定扩增产物与双链DNA结合染料之间的解链温度,其中解链温度证实SARS-CoV-2变体或SARS-CoV-2核酸突变和缺失的存在或不存在。
在进一步的方面中,提供了用于检测来自SARS-CoV-2变体的一个或多个刺突基因突变的试剂盒。该试剂盒可包括:对扩增基因靶标具有特异性的一组或多组引物;和对检测扩增产物具有特异性的一个或多个(一种或多种)可检测寡核苷酸探针。
在一个方面,该试剂盒可包括已经用供体和相应的受体部分(例如,另一种荧光部分或黑暗猝灭剂)标记的探针,或者可包括用于标记探针的荧光部分。该试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶、和核酸聚合酶功能所需的缓冲液。试剂盒还可包括使用引物、探针和荧光部分来检测样品中SARS-CoV-2刺突基因突变和缺失的存在或不存在的包装说明书和使用说明书。
一方面,提供了用于靶序列的等位基因特异性扩增的方法,该靶序列以多种变体序列的形式存在于样品中,方法包括:提供包含5'末端、3'末端和至少一个为锁核酸(LNA)的核苷酸的阻断寡核苷酸,当杂交形成具有第一解链温度(Tm)的第一复合体时,阻断寡核苷酸与野生型(WT)序列完全互补,当杂交形成具有第二解链温度(Tm)的第二复合体时,阻断寡核苷酸在一个或多个核苷酸处与靶突变体(MT)序列部分不互补,其中第一Tm高于第二Tm,阻断寡核苷酸在3'末端被阻断,阻止延伸;和在高于第二Tm但低于第一Tm的温度下进行扩增步骤,扩增步骤包括使样品与一组引物接触以产生扩增产物,如果WT序列和/或靶MT序列存在于样品中,其中阻断寡核苷酸在扩增步骤期间变得不与靶MT序列杂交,但保持与WT序列杂交,从而抑制WT序列的扩增。
在另一方面,提供了用于靶序列等位基因特异性扩增的试剂盒,该靶序列以多种变体序列的形式存在,试剂盒包括:一组引物;和阻断寡核苷酸,其包含5'末端、3'末端和至少一个为锁核酸(LNA)的核苷酸,当杂交形成具有第一解链温度(Tm)的第一复合体时,阻断寡核苷酸与野生型(WT)序列完全互补,当杂交形成具有第二解链温度(Tm)的第二复合体时,阻断寡核苷酸在一个或多个核苷酸处与靶突变体(MT)序列部分不互补,其中第一Tm高于第二Tm。
在另一方面,提供了用于进行靶序列的等位基因特异性扩增的寡核苷酸,该靶序列以多种变体序列的形式存在,寡核苷酸包括:5'末端和3'末端在3'末端被阻断,阻止延伸,当杂交形成具有第一解链温度(Tm)的第一复合体时,序列与野生型(WT)序列完全互补,并且当杂交形成具有第二解链温度(Tm)的第二复合体时,序列在一个或多个核苷酸处与靶突变体(MT)序列部分不互补,其中第一Tm高于第二Tm;以及至少一种为锁核酸(LNA)的核苷酸。
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本主题的实践或测试中,可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料,但下文描述了合适的方法和材料。此外,材料、方法和实例仅是说明性的,而不旨在限制。
本发明的一个或多个实施例的细节在附图和下面的说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和详细描述以及权利要求中显而易见。
附图说明
图1示出本公开的刺突蛋白基因的缺失和突变以及它们在SARS-CoV-2基因组内的位置。ORF,开放阅读框;S,刺突蛋白;RBD,受体结合结构域。
图2示出由实例4中描述的SARS-CoV-2变体测试生成的生长曲线,在多重PCR测试中使用指示水平的Zeptometrix野生型SARS-CoV-2基因组RNA,在香豆素通道处进行检测。
图3示出由实例4中描述的SARS-CoV-2变体测试生成的生长曲线,在多重PCR测试中使用指示水平的含有E484K和N501Y突变两者的突变体转录物,在FAM通道(左)和HEX通道(右)处进行检测。
图4示出由实例4中描述的SARS-CoV-2变体测试生成的生长曲线,在多重PCR测试中使用指示水平的携带N501Y突变和69-70缺失两者的Twist合成对照转录物,在HEX通道(左)和JA270通道(右)处进行检测。
具体实施方式
通过核酸扩增诊断SARS-CoV-2(野生型和变体两者)感染,提供了一种用于快速、准确、可靠、特异性和灵敏地检测病毒感染的方法。本文描述了用于检测非生物学或生物学样品中具有刺突蛋白基因突变的SARS-CoV-2变体的实时逆转录酶PCR测定。提供了用于检测SARS-CoV-2变体的引物和探针,以及包含此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比,实时PCR检测SARS-CoV-2变体的特异性和灵敏度更高,以及实时PCR具有改进的特征,包括样品容纳和经扩增的产物的实时检测,使该技术的实施在临床实验室中可行,不仅适用于SARS-CoV-2感染的常规诊断也适用于从SARS-CoV-2变体的感染。此外,该技术可用于体外诊断以及用于预后。该SARS-CoV-2变体检测测定也可与其他测定并行地多重使用以检测其他核酸,例如,流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV。
SARS-CoV-2基因组是长度为29,903个碱基的正义单链RNA分子(如GenBank登录号NC_045512所示),具有如下基因顺序(5`到3`):复制酶ORF1ab(21,291个碱基,具有16个预测的病毒复制和病毒组装必需的非结构蛋白)、刺突(S基因,3,822个碱基,编码负责与细胞受体结合的刺突蛋白)、ORF3ab(长度为828个碱基)、包膜(E基因,228个碱基编码包膜蛋白)、膜(M基因,669个碱基,编码膜蛋白)、核衣壳(N基因,1260个碱基,编码与基因组RNA形成复合物的核衣壳蛋白)。此外,在5`末端有265个碱基的非编码区,且在3`末端有229个碱基的非编码区。
S基因编码刺突蛋白,也称为S蛋白或表面糖蛋白,是跨膜糖基化蛋白,由1273个氨基酸组成,组装成同源三聚体并且形成从SARS-CoV-2病毒包膜上突出的刺突。刺突蛋白首先通过S1亚单位中的受体结构域(RBD)与宿主受体结合,然后通过S2亚单位融合病毒和宿主细胞膜,从而介导病毒进入宿主细胞。与SARS-CoV类似,SARS-CoV-2将血管紧张素转换酶2(ACE2)识别为与病毒S蛋白结合的宿主受体。SARS-CoV-2中刺突蛋白的RBD被表征为残基331至524(或其他报告中的残基333至527)处的约200个氨基酸区域。
最近的研究结果报告了S基因变体的出现,这些变体表现出更强的传染性、高病毒载量、潜在增加的病死率伴随着由使用野生型S靶标的疫苗生成的抗体的中和作用降低。这些关注的变体(VOC)为英国B1.1.7(69-70del、N501Y等)、南非B.1.351(K417N、E484K和N501Y)以及巴西B.1.1.28(E484K、N501Y)和P1。这些变体是通过基于PCR的检测后对样品进行测序来检测的。69-70del、N501Y和E484K突变以及常见观察到的D614G突变的位置显示在图1中。
本公开包括寡核苷酸引物和荧光标记的水解探针,它们与SARS-CoV-2基因组的刺突蛋白基因杂交为了使用例如扩增和检测技术来特异性识别SARS-CoV-2变体。寡核苷酸与S基因特异性杂交。本公开还涉及与SARS-CoV-2基因组中的其他区域(例如ORF1ab基因)杂交的寡核苷酸引物和水解探针,因为与仅靶向单个基因基因座相比,具有与基因组中的多个位置杂交的寡核苷酸有利于提高灵敏度。
所公开的方法可包括执行逆转录步骤和至少一个循环步骤,该至少一个循环步骤包括使用一对或多对引物从样品扩增核酸分子基因靶标的一个或多个部分。如本文所用的“SARS-CoV-2引物”是指与在SARS-CoV-2基因组中发现的核酸序列特异性退火并在适当条件下从其启动DNA合成从而产生相应扩增产物的寡核苷酸引物。在SARS-CoV-2基因组中发现的核酸序列的实例包括ORF1ab基因、S基因、ORF3ab基因、E基因、M基因和N基因以及其他预测的ORF区域内的核酸。所论述的每个SARS-CoV-2引物与靶区域退火,使得每个扩增产物的至少一部分含有对应于靶标的核酸序列。如果样品中存在一种或多种核酸,则产生一种或多种扩增产物,因此一种或多种扩增产物的存在指示样品中存在SARS-CoV-2。扩增产物应含有与SARS-CoV-2的一种或多种可检测探针互补的核酸序列。如本文所用的“SARS-CoV-2探针”是指与在SARS-CoV-2基因组中发现的核酸序列特异性退火的寡核苷酸探针。每个循环步骤包括扩增步骤、杂交步骤和检测步骤,其中使样品与一个或多个(一种或多种)可检测SARS-CoV-2探针接触以检测样品中SARS-CoV-2的存在或不存在。
如本文所用,术语“扩增”是指合成与模板核酸分子(例如,来自SARS-CoV-2基因组的核酸分子)的一条或两条链互补的核酸分子的过程。扩增核酸分子通常包括使模板核酸变性,在低于引物解链温度的温度将引物与模板核酸退火,以及从引物酶促延伸以产生扩增产物。扩增通常需要存在脱氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(例如,Taq)和适当的缓冲液和/或聚合酶最佳活性的辅助因子(例如,MgCl2和/或KCl)。
本文所用术语“引物”为本领域的熟练专家所知,且指能够引发通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA合成的寡聚化合物,主要指寡核苷酸,但也指经修饰的寡核苷酸,即例如引物的3'末端提供游离的3'-OH基团,另外“核苷酸”可以通过模板依赖性DNA聚合酶建立3'至5'磷酸二酯键与其连接,由此使用脱氧核苷三磷酸且由此释放焦磷酸盐。
术语“杂交”是指一种或多种探针与扩增产物的退火。“杂交条件”通常包括低于探针的解链温度但避免探针的非特异性杂交的温度。
术语“5'到3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性,通常与核酸链合成相关,由此从核酸链的5'末端去除核苷酸。
术语“热稳定的聚合酶”是指热稳定的聚合酶,即为催化与模板互补的引物延伸产物的形成并且当处于升高的温度经历实现双链模板核酸变性所需的时间时没有不可逆地变性的酶。通常,合成在每个引物的3'末端处起始,并且沿着模板链以5'至3'方向前进。已从黄栖热菌(Thermusflavus)、红栖热菌(T.ruber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermusfervidus)分离出热稳定的聚合酶。然而,非热稳定的聚合酶也可用于PCR测定中,条件是补充该酶(如果必要)。
术语“其互补序列”是指与给定核酸具有相同长度并且与其完全互补的核酸。
当用于核酸时,术语“延伸”或“伸长”是指额外的核苷酸(或其他类似分子)掺入核酸时。例如,核酸任选地被掺入核苷酸的生物催化剂延伸,例如通常在核酸的3'末端添加核苷酸的聚合酶。
如本文所用,术语“相同”或百分比“同一性”指在两个或更多核酸序列的背景下,当对最大对应性比较和对准(例如,使用熟练人员可用的序列比较算法或通过目测来测量)时,两个或更多序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同核苷酸。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的示例性算法是BLAST程序,其描述于例如,Altschul等人(1990)“Basic local alignment search tool”J.Mol.Biol.215:403-410,Gish等人(1993)“Identification ofprotein coding regions by database similarity search”Nature Genet.3:266-272,Madden等人(1996)“Applications of network BLAST server”Meth.Enzymol.266:131-141,Altschul等人(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration ofprotein database search programs”Nucleic Acids Res.25:3389-3402,以及Zhang等人(1997)“PowerBLAST:A new network BLAST application forinteractive or automated sequence analysis and annotation”Genome Res.7:649-656中。
寡核苷酸上下文中的“修饰的核苷酸”是指这样的改变,其中寡核苷酸序列的至少一个核苷酸被不同的核苷酸替换,为寡核苷酸提供所需的特性。在本文所述的寡核苷酸中,可被取代的示例性修饰的核苷酸包括例如叔丁基苄基、C5-甲基-dC、C5-乙基-dC、C5-甲基-dU、C5-乙基-dU、2,6-二氨基嘌呤、C5-丙炔基-dC、C5-丙炔基-dU、C7-丙炔基-dA、C7-丙炔基-dG、C5-炔丙基氨基-dC、C5-炔丙基氨基-dU、C7-炔丙基氨基-dA、C7-炔丙基氨基-dG、7-脱氮-2-脱氧黄嘌呤核苷、吡唑并嘧啶类似物、假-dU、硝基吡咯、硝基吲哚、2'-0-甲基核糖-U、2'-0-甲基核糖-C、N4-乙基-dC、N6-甲基-dA等。可以在寡核苷酸中取代的许多其他修饰的核苷酸在本文中提及或在本领域中另外已知。在某些实施例中,经修饰的核苷酸取代相对于对应的未经修饰的寡核苷酸的解链温度修饰寡核苷酸的解链温度(Tm)。核苷修饰还可包括增加杂交严格性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如,可以用连接2'和4'碳的额外桥来修饰核苷酸分子,从而产生对核酸酶裂解有抗性的“锁核酸(LNA)”核苷酸(如Imanishi等人在美国专利号6,268,490以及Wengel等人的美国专利号6,794,499中所描述的)。为了进一步说明,在一些实施例中,某些修饰的核苷酸取代可以减少非特异性核酸扩增(例如,最小化引物二聚体的形成等)、增加预期靶标扩增子的产率等。这些类型的核酸修饰的实例描述于例如美国专利号6,001,611中。其他修饰的核苷酸取代可以改变寡核苷酸的稳定性,或提供其他所需的特征。
SARS-CoV-2检测
本公开提供了通过扩增例如SARS-CoV-2S基因核酸序列的一部分来检测具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体的方法。SARS-CoV-2基因组的核酸序列是可用的(例如,GenBank登录号NC_045512,其中S基因位于核苷酸位置21563至25384)。具体地,通过本公开的实施例提供了用于扩增和检测SARS-CoV-2S基因突变和缺失的靶序列的引物和探针。
为了检测SARS-CoV-2VOC,提供了扩增S基因的引物和特异性检测S基因中突变和缺失的探针。除了本文例举的那些核酸之外的SARS-CoV-2核酸也可用于检测样品中的SARS-CoV-2变体。例如,本领域技术人员可使用常规方法来评价功能性变体的特异性和/或灵敏度。代表性的功能变体可以包括例如本文公开的SARS-CoV-2核酸中的一个或多个缺失、插入和/或取代。
更具体地,寡核苷酸的实施例各自包括具有选自SEQ ID NO:1-5、7-14和16-25、或SEQ ID NO:1-5、7-14和16-25的互补序列的序列的核酸。在一些实施例中,提供了阻断选自SEQ ID NO:37-39的野生型(例如野生型残基69-70、E484、N501)的检测的寡核苷酸探针。
表1:SARS-CoV-2正向引物
表2:SARS-CoV-2反向引物
表3:SARS-CoV-2探针
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表4:SARS-CoV-2阻断探针
在一个实施例中,使用上述SARS-CoV-2引物和探针组为了提供检测疑似含有SARS-CoV-2变体的生物学样品中的SARS-CoV-2变体(表1至表4)。引物和探针组可包含或由对SARS-CoV-2核酸序列具有特异性的引物和探针组成,这些引物和探针包含或由SEQ IDNO:1-5、7-14、16-25和37-39的核酸序列组成。
如上所述,引物(和/或探针)可以是经化学修饰的,即引物和/或探针可包括经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。探针(或引物)则是经修饰的寡核苷酸。“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然“核苷酸”的不同之处在于一些修饰,但仍由碱基或碱基样化合物、戊呋喃糖基糖或戊呋喃糖基糖样化合物、磷酸部分或磷酸样部分或它们的组合组成。例如,可将“标记”附接到“核苷酸”的碱基部分,由此获得“经修饰的核苷酸”。“核苷酸”中的天然碱基也可被例如7-去氮杂嘌呤替换,由此也获得“经修饰的核苷酸”。术语“经修饰的核苷酸”或“核苷酸类似物”在本申请中可互换使用。“经修饰的核苷”(或“核苷类似物”)与天然核苷的不同之处在于以如上文针对“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)概述的方式进行的一些修饰。
可使用例如计算机程序如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.,Cascade,Colo.)来设计扩增编码SARS-CoV-2靶标的核酸分子(例如编码SARS-CoV-2替代部分的核酸)的寡核苷酸,包括经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸类似物。当设计用作扩增引物的寡核苷酸时,重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如,通过电泳)、一对引物的成员的相似解链温度以及每个引物的长度(即,引物需要足够长以与序列特异性退火并启动合成,但不能太长以至于在寡核苷酸合成过程中保真度降低)。通常,寡核苷酸引物的长度为8至50个核苷酸(例如,长度为8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48个或50个核苷酸)。
除了一组引物之外,这些方法可使用一个或多个探针为了检测SARS-CoV-2变体的存在或不存在。术语“探针”是指合成或生物产生的核酸(DNA或RNA),其通过设计或选择而包含特定核苷酸序列,允许它们在定义的预定严格性下特异性(即优先性地)杂交到“靶标核酸”,在本例中为SARS-CoV-2(靶标)核酸。“探针”可以称为“检测探针”,意思是它检测靶核酸。
在一些实施例中,所述SARS-CoV-2探针可用至少一种荧光标记物进行标记。在一个实施例中,SARS-CoV-2探针可用供体荧光部分(例如,荧光染料)和对应的受体部分(例如,淬灭剂)标记。在一个实施例中,探针包含或由荧光部分和核酸序列组成,核酸序列包含或由SEQ ID NO:21-26组成。
设计用作探针的寡核苷酸可以以类似于设计引物的方式进行。实施例可以使用单个探针或一对探针来检测扩增产物。根据实施例,使用的探针可包含至少一种标记和/或至少一种猝灭剂部分。与引物一样,探针通常具有相似的解链温度,并且每个探针的长度必须足以发生序列特异性杂交,但不能太长以至于在合成过程中保真度降低。寡核苷酸探针的长度通常为15至40(例如,16、18、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
构建体可包括各自含有SARS-CoV-2引物和探针核酸分子中的一种的载体。构建体可用作例如对照模板核酸分子。适用的载体是市售的和/或通过本领域常规的重组核酸技术方法产生的。SARS-CoV-2核酸分子可以通过例如化学合成、从SARS-CoV-2直接克隆或通过核酸扩增获得。
除了SARS-CoV-2核酸分子(例如,包含一个或多个SEQ ID NO:1-5、7-14和16-25序列的核酸分子)外,适用于方法的构建体通常包括编码用于选择所需的构建体和/或转化体的可选择标志物(例如,抗生素抗性基因)的序列以及复制起点。载体系统的选择通常取决于若干因素,包括但不限于宿主细胞的选择、复制效率、选择性、诱导性和回收的容易性。
包含SARS-CoV-2核酸分子的构建体可在宿主细胞中繁殖。如本文所用,术语宿主细胞意在包括原核生物和真核生物,诸如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母(诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(诸如COS细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、昆虫细胞和植物细胞(诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Nicotiana tabacum))。可使用本领域普通技术人员公知的任何技术将构建体引入宿主细胞中。例如,磷酸钙沉淀、电穿孔、热激、脂质转染、显微注射和病毒介导的核酸转移是将核酸引入宿主细胞中的常用方法。另外,可以将裸DNA直接递送至细胞(参见例如美国专利号5,580,859和5,589,466)。
聚合酶链式反应(PCR)
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规的PCR技术。PCR通常采用两个寡核苷酸引物,其与所选核酸模板(例如DNA或RNA)结合。在一些实施例中有用的引物包括能够充当所描述的SARS-CoV-2核酸序列(例如,SEQ ID NO:1-20)内的核酸合成的起始点的寡核苷酸。引物可以通过常规方法从限制性消化物中纯化,或它可以合成产生。为了扩增中的最大效率,引物优先为单链的,但引物可以是双链的。首先将双链引物变性即处理以分离链。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。
如果模板核酸是双链的,则必须在它可以用作PCR中的模板前分离两条链。链分离可以通过任何合适的变性方法完成,包括物理、化学或酶促方法。分离核酸链的一种方法涉及加热核酸直至其多数变性(例如,变性大于50%、60%、70%、80%、90%或95%)。用于使模板核酸变性必需的加热条件将取决于例如缓冲液盐浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成,但通常范围在约90℃至约105℃范围内持续一段时间,这取决于反应特征,例如温度和核酸长度。变性通常进行约30秒至4分钟(例如,1分钟至2分钟30秒、或1.5分钟)。
如果双链模板核酸通过加热变性,则允许反应混合物冷却至促进每个引物退火至其靶序列的温度。退火温度通常为约35℃至约65℃(例如,约40℃至约60℃;约45℃至约50℃)。退火时间可为约10秒至约1分钟(例如,约20秒至约50秒;约30秒至约40秒)。然后将反应混合物调整至聚合酶的活性得到促进或最佳化的温度,即足以使延伸从退火引物发生,以生成与模板核酸互补的产物的温度。温度应足以从与核酸模板退火的每个引物合成延伸产物,但不应高到使延伸产物从其互补模板中变性(例如用于延伸的温度通常范围为约40℃至约80℃(例如约50℃至约70℃;约60℃)。延伸时间可为约10秒至约5分钟(例如,约30秒至约4分钟;约1分钟至约3分钟;约1分钟30秒至约2分钟)。
逆转录病毒或RNA病毒(诸如SARS-CoV-2以及其他黄病毒)的基因组由核糖核酸(即RNA)组成。在这种情况下,模板核酸RNA必须首先通过逆转录酶的作用转录成互补DNA(cDNA)。逆转录酶使用RNA模板和与RNA 3'末端互补的短引物来指导第一链cDNA的合成,其然后可以直接用作聚合酶链式反应的模板。
PCR测定可采用SARS-CoV-2核酸诸如RNA或DNA(cDNA)。模板核酸不需要纯化;其可以是复杂混合物的一小部分,例如人类细胞中包含的SARS-CoV-2核酸。SARS-CoV-2核酸分子可通过常规技术从生物学样品中提取,例如描述于Diagnostic MolecularMicrobiology:Principles and Applications(Persing等人(编),1993,AmericanSociety for Microbiology,Washington D.C.).核酸可以从许多来源获得,例如质粒,或天然来源,包括细菌、酵母、病毒、细胞器或高等生物,例如植物或动物。
寡核苷酸引物(例如,SEQ ID NO:1-20)在诱导引物延伸的反应条件下与PCR试剂组合。例如,链延伸反应通常包括50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2、0.001%(w/v)明胶、0.5-1.0μg变性模板DNA、每个寡核苷酸引物50pmol、2.5U Taq聚合酶和10%DMSO)。反应通常包含150至320μM dATP、dCTP、dTTP、dGTP中的每一种或者其一种或多种类似物。
新合成的链形成双链分子,可用于反应的后续步骤。链分离、退火和伸长步骤可根据需要重复多次,以产生所需数量的与靶标SARS-CoV-2核酸分子相对应的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定酶和核苷三磷酸的量。循环步骤(即变性、退火和延伸)优先重复至少一次。对于在检测中的使用,循环步骤的数目将取决于例如样品的性质。如果样品是核酸的复杂混合物,则将需要更多循环步骤以扩增足以检测的靶序列。通常,循环步骤重复至少约20次,但可以重复多达40、60或甚至100次。
荧光共振能量转移(FRET)
FRET技术(例如,参见美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)基于这样一个概念:当供体荧光部分和相应的受体荧光部分位于彼此相距一定距离内时,能量转移发生在两个荧光部分之间,这可以可视化或以其他方式检测和/或定量。当供体被具有合适波长的光辐射激发时,供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。在某些系统中,非荧光能量可以通过包括基本上非荧光供体部分的生物分子在供体和受体部分之间转移(参见,例如,美国专利第7,741,467号)。
在一个实例中,寡核苷酸探针可以包含供体荧光部分(例如,HEX)和相应的猝灭剂(例如,BlackHole QuenchersTM(BHQ)),其可以是或可以不是荧光的,并以光以外的形式耗散传递的能量。当探针完整时,能量转移通常发生在供体和受体部分之间,使得来自供体荧光部分的荧光发射被受体部分猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间,结合至扩增产物的探针由例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割,使得供体荧光部分的荧光发射不再猝灭。为此目的的示例性探针在例如美国专利号5,210,015、5,994,056和6,171,785中有所描述。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)、BlackBerryTM Quencher650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。
在另一个实例中,两个寡核苷酸探针(各自包含荧光部分)可在由寡核苷酸探针与SARS-CoV-2靶核酸序列的互补性决定的特定位置与扩增产物杂交。在寡核苷酸探针在适当位置与扩增产物核酸杂交后,产生FRET信号。杂交温度可在约35℃至约65℃的范围内,持续约10秒至约1分钟。
荧光分析可以使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(包含适当的二向色镜和用于监测特定范围的荧光发射的滤光片)、光子计数光电倍增管系统或荧光计来进行。可以使用氩离子激光器、高强度汞(Hg)弧光灯、氙气灯、光纤光源或其他适当过滤以在所需范围内激发的高强度光源进行激发,以启动能量转移或允许直接检测荧光团。
如本文所用的关于供体和相应受体部分的“对应”是指受体荧光部分或暗猝灭剂,其吸收光谱与供体荧光部分的发射光谱重叠。受体荧光部分的发射光谱的最大波长应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长至少大100nm。因此,可以在它们之间产生有效的非辐射能量传递。
通常选择荧光供体和相应的受体部分用于(a)高效Foerster能量转移;(b)大的最终斯托克斯位移(>100nm);(c)将发射尽可能迁移到可见光谱的红色部分(>600nm)中;(d)将发射迁移至比在供体激发波长激发产生的拉曼水荧光发射更高的波长。例如,可以选择在激光线附近具有最大激发(例如,氦-镉442nm或氩气488nm)、高消光系数、高量子产率和其荧光发射与相应受体荧光部分的激发光谱的良好重叠的供体荧光部分。可选择具有高消光系数、高量子产率、其激发与供体荧光部分的发射的良好重叠以及在可见光谱的红色部分(>600nm)中的发射的对应的受体荧光部分。
可在FRET技术中与各种受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸酯、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4'-异硫基-氰酸茋-2,2'-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺1-芘丁酸酯和4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸衍生物。代表性受体荧光部分,取决于所用的供体荧光部分,包括LC Red 640、LC Red 705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明x异硫氰酸酯、异硫氰酸赤藓红、荧光素、二亚乙基三胺五乙酸盐或其他镧系离子的螯合物(例如铕或铽)。供体和受体荧光部分可以从例如Molecular Probes(Junction City,Oreg.)或Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)获得。
供体和受体荧光部分可以通过接头臂连接到合适的探针寡核苷酸上。每个接头臂的长度很重要,因为接头臂会影响供体和受体荧光部分之间的距离。接头臂的长度是以埃为单位的从核苷酸碱基到荧光部分的距离。通常,接头臂为约/>至约/>接头臂可以是WO 84/03285中所述的种类。WO 84/03285还公开用于将接头臂连接至特定核苷酸碱基,以及用于将荧光部分连接至接头臂的方法。/>
受体荧光部分,例如LC Red 640,可以与包含氨基接头的寡核苷酸(例如,可从ABI(Foster City,Calif.)或Glen Research(Sterling,VA)获得的C6-氨基亚磷酰胺)组合以生产,例如LC Red 640标记的寡核苷酸。经常使用的将供体荧光部分(诸如荧光素)偶联至寡核苷酸的接头包括硫脲接头(FITC-衍生的,例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland,Mass.)的荧光素-CPG's)、酰胺接头(荧光素-NHS-酯衍生的,诸如来自BioGenex(San Ramon,Calif.)的CX-荧光素-CPG)、或需要在寡核苷酸合成后偶联荧光素-NHS-酯的3'-氨基-CPGs。
SARS-CoV-2检测
本公开提供了用于检测生物学样品或非生物学样品中具有刺突蛋白突变(包括缺失和插入)的SARS-CoV-2变体的存在或不存在的方法。提供的方法避免了样品污染、假阴性和假阳性的问题。方法包括进行逆转录步骤和至少一个循环步骤以及FRET检测步骤,该循环步骤包括使用一对或多对SARS-CoV-2引物从样品扩增SARS-CoV-2S基因核酸分子的一部分。进行多个循环步骤,优选在热循环仪中。这些方法可使用SARS-CoV-2S基因引物和探针以特异性地检测SARS-CoV-2S基因突变的存在来进行,并且检测到SARS-CoV-2指示样品中SARS-CoV-2变体的存在。
如本文所述,可以使用利用FRET技术的标记杂交探针检测扩增产物。一种FRET形式利用技术来检测扩增产物的存在或不存在,并且因此检测SARS-CoV-2变体的存在或不存在。/>技术利用一种单链杂交探针,该杂交探针标记有例如一种荧光染料(例如HEX)和一种猝灭剂(例如BHQ),其可以是或可以不是荧光的。当第一荧光部分用合适波长的光激发时,吸收的能量根据FRET原理转移至第二荧光部分或暗猝灭剂。第二荧光部分通常是猝灭剂分子。在PCR反应的退火步骤中,标记的杂交探针与靶标DNA(即扩增产物)结合,并在随后的延伸阶段被例如Taq聚合酶的5'至3'核酸酶活性降解。因此,荧光部分和猝灭剂部分变得彼此空间上分离。因此,在不存在猝灭剂的情况下的第一荧光部分激发后,可以检测到来自第一荧光部分的荧光发射。举例来说,ABI/>7700序列检测系统(美国应用生物系统公司,Applied Biosystems)使用/>技术,并且适用于进行本文所描述的用于检测样品中SARS-CoV-2变体的存在或不存在的方法。
也可以使用与FRET缀合的分子信标来检测使用实时PCR方法的扩增产物的存在。分子信标技术使用被第一荧光部分和第二荧光部分标记的杂交探针。第二荧光部分通常是猝灭剂,且荧光标记一般位于探针的每个末端处。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探针寡核苷酸。作为在探针内的二级结构形成的结果,当探针在溶液中时,两个荧光部分空间接近。在与靶核酸(即扩增产物)杂交以后,探针的二级结构被破坏,并且荧光部分变得彼此分离,从而使得在用合适波长的光激发后,可以检测第一荧光部分的发射。
FRET技术的另一种常见形式是使用两个杂交探针。每个探针都可以用不同的荧光部分标记,并且通常设计为在靶标DNA分子(例如,扩增产物)中彼此非常接近地杂交。供体荧光部分,例如荧光素,在470nm处被仪器的光源激发。在FRET期间,荧光素将其能量转移到受体荧光部分,诸如/>640(LC Red 640)或/>705(LC Red 705)。然后受体荧光部分发出更长波长的光,由/>仪器的光学检测系统检测。只有当荧光部分直接局部接近,并且当供体荧光部分的发射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时,有效的FRET才发生。发射信号的强度可与原始靶DNA分子的数量(例如,SARS-CoV-2基因组的数量)相关。如果SARS-CoV-2靶核酸发生扩增并产生扩增产物,则杂交步骤产生基于探针对成员之间的FRET的可检测信号。
通常,FRET的存在指示样品中存在SARS-CoV-2,并且FRET的不存在指示样品中不存在SARS-CoV-2。然而,样本采集不足、运输延迟、运输条件不当或使用某些采集拭子(海藻酸钙或铝轴)都是会影响测试结果的成功和/或准确性的条件。
可用于实践所述方法的代表性生物样品包括但不限于呼吸道标本(鼻咽和口咽拭子)、尿液、粪便标本、血液标本、血浆、皮肤拭子、伤口拭子、血培养物、皮肤和软组织感染物。生物学样品的收集和储存方法是本领域技术人员已知的。可对生物学样品进行处理(例如,通过本领域已知的核酸提取方法和/或试剂盒)以释放SARS-CoV-2核酸,或者在一些情况下,可使生物学样品直接与PCR反应组分和适当的寡核苷酸接触。
解链曲线分析是可包含在循环曲线中的附加步骤。解链曲线分析基于DNA在称为解链温度(Tm)的特征温度下解链的事实,该解链温度被定义为一半DNA双链体分离成单链时的温度。DNA的解链温度主要取决于其核苷酸组成。因此,富含G和C核苷酸的DNA分子具有丰富的A和T核苷酸的DNA分子具有更高的Tm。通过检测信号丢失的温度,可以确定探针的解链温度。类似地,通过检测产生信号的温度,可以确定探针的退火温度。来自SARS-CoV-2扩增产物的SARS-CoV-2探针的解链温度可证实样品中SARS-CoV-2的存在或不存在。
在每个热循环仪运行中,也可以循环控制样品。阳性对照样品可以使用例如对照引物和对照探针扩增靶核酸对照模板(不同于所述靶标基因的扩增产物)。阳性对照样品也可以扩增,例如,含有靶核酸分子的质粒构建体。此类质粒对照可在内部(例如,在样品内)扩增,或在与患者样品并排运行的单独样品中使用与用于检测预期靶标的相同的引物和探针进行扩增。此类对照是扩增、杂交和/或FRET反应成功或失败的指标。每个热循环仪运行还可以包括一个阴性对照,例如,缺少靶标模板DNA。阴性对照可以测量污染。这确保系统和试剂不会产生假阳性信号。因此,对照反应可以很容易地确定,例如,引物以序列特异性退火和启动延伸的能力,以及探针以序列特异性杂交和发生FRET的能力。
在一个实施例中,该方法包括避免污染的步骤。例如,美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313中描述了一种利用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶促方法,以减少或消除一次热循环仪运行和下一次运行之间的污染。
可以使用结合FRET技术的常规PCR方法来实践这些方法。在一个实施方案中,使用仪器。以下专利申请描述了如/>技术中使用的实时PCR:WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。
可使用PC工作站操作,并且可利用Windows NT操作系统。当机器将毛细管按顺序放置在光学单元上时,可以获得来自样品的信号。软件可以在每次测量后立即实时显示荧光信号。荧光采集时间为10-100毫秒(msec)。在每个循环步骤之后,荧光与循环次数的定量显示可以针对所有样品不断更新。生成的数据可以存储以供进一步分析。
作为FRET的替代,使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合染料(例如,Green或/>(Molecular Probes)),可以检测扩增产物。在与双链核酸相互作用时,这样的荧光DNA结合染料在用合适波长的光激发后发射荧光信号。还可以使用双链DNA结合染料(诸如核酸)嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时,通常进行解链曲线分析用于证实扩增产物的存在。
本领域技术人员会理解,也可以采用其他核酸或信号放大方法。此类方法的实例包括但不限于分支DNA信号扩增、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自持序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)或智能放大过程版本2(SMAP 2)。
应当理解,本公开的实施例不受一种或多种市售仪器的配置的限制。
制品/试剂盒
本公开的实施例进一步提供了制品或试剂盒以检测具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体。制品可包括用于检测SARS-CoV-2S基因靶标的引物和探针,以及合适的包装材料。用于SARS-CoV-2基因突变的特异性检测的代表性引物和探针能够与SARS-CoV-2靶核酸分子杂交。此外,试剂盒还可包括适当包装的DNA固定、杂交和检测所需的试剂和材料,例如固体支持物、缓冲剂、酶和DNA标准品。本文公开了设计引物和探针的方法,并且提供了扩增SARS-CoV-2S基因靶核酸分子并与之杂交的引物和探针的代表性实例。
制品还可以包括一种或多种用于标记探针的荧光部分,可替代地,可以标记随试剂盒提供的探针。例如,制品可包括用于标记SARS-CoV-2探针的供体和/或受体荧光部分。上文提供了合适的FRET供体荧光部分和对应的受体荧光部分的实例。
制品还可包含包装说明书或包装标记,其上具有使用SARS-CoV-2引物和探针来检测样品中具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体的使用说明书。制品可另外包括用于实施本文公开的方法的试剂(例如,缓冲液、聚合酶、辅因子、或防止污染的试剂)。此类试剂可以专用于本文所述的市售仪器之一。
本公开的实施例将进一步在以下实例中描述,这些实例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实例
提供以下实例和附图以帮助理解本发明,本主题的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解,在不脱离本发明的精神的情况下,可对所阐述的程序进行修改。
实例1测定描述
在6800/8800系统上开展了实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测试,用于定性和区分在例如来自已知SARS-CoV-2感染的患者的鼻拭子标本和鼻咽拭子标本中的SARS-CoV-2突变N501Y、del 69-70和E484K,以支持对人口健康管理的变体流行病学的理解。突变特异性PCR测定可用作SARS-CoV-2阳性样品的反射测试,以识别已知的关注突变,作为SARS-CoV-2变体的监测策略的一部分。测定经过策略性设计,以实现使用水解探针进行单碱基突变检测,该探针掺入了锁核酸(LNA)化学成分以提高解链温度(Tm)并且促进针对点突变E484K和N501Y的检测的特异性。del 69-70中6碱基缺失的检测可以使用传统的/>探针进行。测定还包括用于del69-70、E484K和N501Y的三种无染料野生型(wt)探针,用作阻断寡核苷酸探针。测定是在荧光标记突变体探针和wt无染料探针两者都存在的竞争条件下进行的,所以由于精确匹配探针的稳定结合,将阻止不匹配的探针的结合。在一个实施例中,阻断寡核苷酸探针掺入了LNA以进一步增加完全匹配的序列与单碱基(或更多)错配序列之间的Tm差异。测试还包括使用香豆素标记探针进行的SARS-CoV-2野生型特异性ORF1a/b测定作为对照。
同时提取来自患者样品的核酸和添加的RNA-内部对照分子(与现有的RNA QS试剂相同)。通过向样品中添加蛋白酶和裂解试剂来释放病毒核酸。释放的核酸与添加的磁性玻璃颗粒的二氧化硅表面结合。利用随后的洗涤试剂步骤去除未结合的物质和杂质,诸如变性蛋白质、细胞碎片和潜在的PCR抑制剂,并在升高的温度下使用洗脱缓冲液从磁性玻璃颗粒洗脱纯化的核酸。
实例2:引物和探针寡核苷酸的选择
主混合物包含荧光标记的检测探针,其对S基因突变E484K、N501Y、del 69-70还和野生型ORF 1a/b基因具有特异性。RNA内部对照检测探针还用Cy5.5染料标记,充当报告物。每个探针还含有充当猝灭剂的第二染料。用于扩增感兴趣区域的PCR引物被设计成靶区域。因此,以使用以下检测包含S基因突变的SARS-CoV-2变体的单孔测定设计启动研究:(I)香豆素通道中SARS-CoV-2的基因组中的非结构开放阅读框(ORF1a/b);(ii)FAM通道中的S基因E484K突变;(iii)HEX通道中的S基因N501K突变;(iv)JA270通道中S基因69-70缺失。对可与用于过程对照的检测的RNA内部对照寡核苷酸多重结合的各种测定进行了生物信息学分析,以筛选性能的初始测定。E484、N501、wt 69-70的主混合物中包含竞争性未标记野生型寡核苷酸(即阻断探针),为了提高测定特异性。引物和探针的选择组合组示于表5中。
表5:SARS-CoV-2变体测试配置
实例3:PCR测定试剂和条件
使用6800/8800系统平台(Roche Molecular Systems,Inc.,Pleasanton,CA)进行SARS-CoV-2(野生型和变体两者)的实时PCR检测。扩增试剂的最终浓度如下所示:
表6:PCR扩增试剂
下表示出了用于PCR扩增反应的典型温度曲线:
表7:PCR温度曲线
Pre-PCR程序包括初始变性以及在55℃、60℃和65℃下温育,以对RNA模板进行逆转录。在三种温度下温育同时具有以下有利效果:在较低温度下,轻微错配的靶序列(诸如生物体的遗传变体)也被转录,而在较高温度下,RNA二级结构的形成受到抑制,从而使转录更有效。将PCR循环分成两次测量,其中两次测量应用一步设置(结合退火和延伸)。55℃下的前5个循环允许通过预扩增轻微错配的靶序列来增加包容性,而第二次测量的45个循环通过使用58℃的退火/延伸温度提供了增加的特异性。
实例4:性能评估
使用6800试剂对SARS-CoV-2变体测试的组分、工作流程和测定试剂进行了评估。用测定寡核苷酸测试线性化重组质粒以评估性能。还生成了体外转录物以评价使用合成RNA的测定的性能。使用带有DNA和RNA标准的Qubit进行核酸定量。将质粒DNA和转录物在MultiPrep标本稀释缓冲液(也称为散装通用标本稀释剂)中连续稀释并用于测定性能研究。内部对照寡核苷酸(通用内部对照,GIC)包括在具有线性化DNA和RNA转录物两者的评价中。实验在/>6800系统中的分析循环仪上进行。使用絮凝拭子从表现出上呼吸道症状的患者获得鼻咽(NSP)样品,并收集在通用病毒转运培养基(3mL)中。在/>6800系统上使用了改进的样品制备工作流程(Process and Elute,PnE),其中处理300或400μLNSP样品以制备核酸洗脱液。这些洗脱液含有gIC装甲RNA(QS RNA对照),遵循/>6800上相同的NSP样品制备过程,并用作内部样品处理对照。然后将洗脱液用于在LC480和/或/>6800分析循环器上进行扩增和检测的SARS-CoV-2测定研究。
然后进行多重PCR测定,其中在单个反应中测试表5中描述的引物和探针寡核苷酸。测试样品(n=2)包括以1e6–1e1拷贝/PCR的浓度测试的Zeptometrix SARS-CoV-2野生型基因组RNA,以1e10–1e1拷贝/PCR的浓度测试的包含E484K和N501Y突变两者的突变体转录物,以及以1e6–1e1拷贝/PCR的浓度测试的携带N501Y突变和69-70缺失两者的Twist合成对照转录物。所有实验均在人工NPS中进行,并且这些测试的结果在图2、3和4中示出。数据指示在宽的动态范围内具有稳健的生长曲线和PCR效率,对于所有靶标,检测到的转录物低至每个PCR反应10个拷贝。
实例5:分析灵敏度(检测限)的确定
为了确定分析灵敏度,使用了六种SARS-CoV-2病毒原液。在苏黎世大学分别制备了两种分离株(分离株UZ1:P.2谱系,具有E484K的进化枝20B;分离株UZ2:B.1谱系,具有N501Y的进化枝20A),并且在法兰克福大学分别制备了两种分离株(分离株UF1:B.1.351谱系,具有E484K和N501Y的进化枝20H/501Y.V2;和分离株UF2:B.1.1.7谱系,具有N501Y和del69/70的进化枝20I/501Y.V1)。柏林实验室(Labor Berlin)使用了柏林夏里特医科大学病毒学研究所国家冠状病毒咨询实验室友情提供的两种分离株(分离株LB1:B.1.351谱系,具有E484K和N501Y的进化枝20H/501Y.V2;和分离株LB2:B.1.1.7谱系,具有N501Y和del 69/70的进化枝20I/501Y.V1)。
使用在6800/8800系统上使用的/>SARS-CoV-2测定确定病毒原液的滴度,该系统报告循环阈值(Ct)值。在此测定中,还以两种不同浓度(3.7和5.7log IU/ml)对首个世界卫生组织(WHO)SARS-CoV-2核糖核酸国际标准品(RNA;NIBSC英国国家生物标准品与对照研究所代码20/146)进行了测试,允许基于标准曲线的线性回归将针对未知样品的Ct转换为国际单位(IU)(log10 IU/mL=12.66–0.297*Ct)。在CPM(/>PCR介质)或基于UTM的模拟矩阵(UTM,50,000个人外周血单核细胞/mL,0.05%粘蛋白)中,制备六种不同病毒分离株中每种病毒分离株的四到七种稀释液,以生成包括至少以下四种浓度的检测组:约为预期检测限(LoD)的3倍;等于预期检测限;预期检测限的0.3倍;和预期检测限的0.1倍。对每个检测组成员都进行了21次重复测试。LoD使用命中率分析(产生至少95%阳性结果的浓度)确定,并且以IU/mL为单位报告。
表8示出:针对每个基因座给出至少95%阳性结果的所测试的最低病毒浓度;以及针对SCI对照的对应平均循环阈值值。对于测试的三种不同分离株,通过该方法针对E484K确定的检测限(LoD)在180与620IU/mL之间。对于N501Y,LoD在270与720IU/mL之间(五种分离株),然而对于密码子69和70的缺失,检测限为80或92IU/mL。针对SCI阳性对照靶标的LoD在18与80IU/mL之间。
表8:测定灵敏度(检测限)
a示出导致≥95%阳性结果的最低测试浓度
SCI:样品检验指标Ct:循环阈值
实例6:使用临床标本准确性的确定
为了确定SARS-CoV-2变体测试的准确性,在四个地点对含有或不含有三个目标位点中的一个或多个的SARS-CoV-2的标本进行了测试。通过使用基于桑格的标准方法(苏黎世大学)或下一代方法(柏林实验室、雷根斯堡大学医院和Bioscentia,Ingelheim;参见补充方法)对S进行测序,建立突变存在或不存在。总共包括273个分离株。苏黎世大学使用的基于桑格的标准方法不覆盖密码子69-70处的缺失,所以这些样品被排除在该基因座的分析之外。使用各种商业或实验室开展的测试,所有样品均呈RT-PCR阳性。各种标本类型,包括鼻、鼻咽和口咽拭子、支气管肺泡灌洗液、气管分泌物和不同介质(水、盐水、通用传输介质、cobas PCR介质等)中的呼吸道冲洗液(表9)。
表9:用于准确性评估的标本
aNS:鼻拭子;NPS:鼻咽拭子;OPS:口咽拭子
所有273个分离株的SCI对照反应均为阳性,指示样品中存在病毒RNA。根据测序测试了总共20个存在E484K的标本(表10);所有这些都与E484K探针发生反应(灵敏度:100%)。相反,252个标本中不存在与E484K的反应性,在位置484处没有取代(特异性:100%)。1个样品缺少位置484的序列数据。N501Y(108个标本有取代,164个没有;1个样品缺少序列数据)以及密码子69和70的缺失(99个标本有缺失,157个没有;17个样品缺少该区域的序列数据)也获得了类似的结果,并且总结在表10中。没有观察到假阳性或假阴性结果。
表10:测定准确性
a1个样品缺少位置484和501的序列数据
b17个样品缺少位置69-70的序列数据
实例7:分析特异性的确定(干扰生物体)
使用包含17种不同病毒之一的人工样品评估特异性(靶标浓度:基于UTM的模拟矩阵中每mL 105个单位)、八种细菌(每mL 106个单位)或耶氏肺孢子菌(每mL 106个单位)。检测的17种病毒分别是腺病毒、肠道病毒、人冠状病毒229E、HKU1、NL63和OC43、人偏肺病毒、甲型和乙型流感病毒、MERS冠状病毒、副流感病毒1、2、3和4、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、和SARS冠状病毒。这8种细菌分别是百日咳杆菌、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、结核分枝杆菌、肺炎支原体、酿脓链球菌、肺炎链球菌。没有观察到SCI信号或任何包含潜在交叉反应生物体的标本的任何靶向突变信号。
虽然为了清楚和理解的目的已经对前述发明进行了一些详细的描述,但是本领域技术人员通过阅读本公开将清楚,可在形式和细节上进行各种改变。例如,上述所有技术和设备可以以各种组合使用。
序列表
<110> 罗氏公司 (F. Hoffmann-La Roche AG)
罗氏诊断有限公司 (Roche Diagnostics GmbH)
罗氏分子系统公司 (Roche Molecular Systems, Inc.)
<120> 用于检测具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒 2
(SARS-COV-2) 变体的组合物和方法
<130> P36783-WO-HS
<150> US 63/161398
<151> 2021-03-15
<150> US 63/168718
<151> 2021-03-31
<160> 39
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 D69-70_21690_F
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 1
tcagatcctc agttttacat tcaactca 28
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 E484K_23004F
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (20)..(20)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 2
gccggtagca caccttgtaa 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 Y144_F
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 3
gaagacccag tccctactta ttgttaa 27
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 K417_N439_L452_F1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (22)..(22)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 4
tgaagtcaga caaatcgctc ca 22
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 K417_N439_L452_F2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (19)..(19)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 5
acaaatcgct ccagggcaa 19
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物 NCOV-1-FN1.A
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (30)..(30)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 6
ctttgattgt tacgatggtg gctgtattaa 30
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 D69-70_21690_R
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (28)..(28)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 7
accatcatta aatggtagga cagggtta 28
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 D69-70_21859R
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (31)..(31)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 8
gttagacttc tcagtggaag caaaataaac a 31
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 E484K_23004R
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (24)..(24)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 9
accaacacca ttagtgggtt ggaa 24
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 N501Y_23124AR
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (34)..(34)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 10
ggtgcatgta gaagttcaaa agaaagtact acta 34
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 N501Y_23007_R
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (27)..(27)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 11
gctggtgcat gtagaagttc aaaagaa 27
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 Y144_R
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (33)..(33)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 12
caattattcg cactagaata aactctgaac tca 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 K417_N439_L452_R1
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (33)..(33)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 13
gcctgataga tttcagttga aatatctctc tca 33
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 K417_N439_L452_R2
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (30)..(30)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 14
cggcctgata gatttcagtt gaaatatcta 30
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物 NCOV-1R.A
<220>
<221> 修饰的_碱基
<222> (25)..(25)
<223> 叔丁基苄基 dA
<400> 15
agtgcatctt gatcctcata actca 25
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 D69-70-2_PRB
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 16
ttccatgcta tctctgggac caatggtact aagagg 36
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 D69-70-2_PRB_SHT
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 17
ttccatgcta tctctgggac caatggtac 29
<210> 18
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 E484K_ML_PRB1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 18
tgttaaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat ggtttcc 47
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 N501Y_HEX_PRB1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 19
cacttatggt gttggttacc aaccatacag 30
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 E484K_ML_FAM1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 20
tgttaaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat ggtttcc 47
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 Y144_PRB
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 21
tttgggtgtt taccacaaaa acaacaaaag ttggatgg 38
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 K417N4d
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> D-锁核酸
<400> 22
tggaaatatt gctgattata attataaatt accagatg 38
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 L452R2-zx1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> D-锁核酸
<400> 23
taccggtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaac 37
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 K417N4cs_J270
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(32)
<223> D-锁核酸
<400> 24
actggaaata ttgctgatta taattataaa ttaccagatg 40
<210> 25
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 N439K_e3mC
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` HEX
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(7)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 2`-O甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> D-锁核酸
<400> 25
ctaaaaatct tgattctaag gttggtggta attat 35
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 D69-70_WT1_PRB
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 26
tccatgctat acatgtctct gggaccaatg gtactaag 38
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 E484K_WT2L_PRB2
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 27
tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat gg 42
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 N501Y-WT_PRB
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 28
cactaatggt gttggttacc aaccatacag 30
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 E484K_WT2L_COU1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 29
tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat gg 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 N501Y-WT_COU1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 30
tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat gg 42
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 K417N_wt8c
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(30)
<223> D-锁核酸
<400> 31
tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatg 38
<210> 32
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 K417N_wt8a1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> D-锁核酸
<400> 32
tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatg 38
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 L452R_wt1-zx1
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> D-锁核酸
<400> 33
tacctgtata gattgtttag gaagtctaat ctcaaac 37
<210> 34
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 K417N_wt8cs_J270
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` JA270
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(25)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(32)
<223> D-锁核酸
<400> 34
actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg 40
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 N439K_wte2
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` FAM
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2` O甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> D-锁核酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 2` O甲基
<400> 35
ctaacaatct tgattctaag gttggtggta at 32
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针 WUHAN-4P_COU6QC3
<220>
<221> misc_feature
<223> 5` 香豆素
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> BHQ-2 猝灭剂
<400> 36
tcatcgtcaa caacctagac aaatcagctg gttttc 36
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阻断探针 E484K_WT2L_NO_DYE
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<400> 37
tgttgaaggt tttaattgtt actttccttt acaatcatat gg 42
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阻断探针 N501Y-WT_NO_DYE
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(6)
<223> D-锁核酸
<400> 38
cactaatggt gttggttacc aaccatacag 30
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阻断探针 LNAD69-70_WT1_NO_DYE
<220>
<221> misc_feature
<223> 3` 间隔区 C3 阻断剂
<400> 39
tccatgctat acatgtctct gggaccaatg gtactaag 38
Claims (22)
1.一种检测生物学样品中的具有刺突蛋白突变的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)变体的方法,所述方法包括:
-进行扩增步骤,所述扩增步骤包括使所述样品与一组引物和具有5'到3'核酸酶活性的聚合酶接触以产生扩增产物,如果SARS-CoV-2核酸存在于所述样品中的话;
-进行杂交步骤,所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测探针接触;以及
-检测所述扩增产物的存在,其中所述扩增产物的检出指示所述样品中所述SARS-CoV-2变体的存在;
其中所述一组引物包含第一引物和第二引物,所述第一引物包含选自由SEQ ID NO:1-5或其互补序列组成的组的第一寡核苷酸序列,所述第二引物包含选自由SEQ ID NO:7-14或其互补序列组成的组的第二寡核苷酸序列;
其中所述一种或多种可检测探针包含选自由SEQ ID NO:16-25或其互补序列组成的组的第三寡核苷酸序列;并且
其中所述刺突蛋白突变选自69-70缺失(del 69-70)、N501Y突变、或E484K突变、或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述杂交步骤或所述扩增步骤和所述杂交步骤两者在一种或多种阻断寡核苷酸探针的存在下进行;其中一种或多种阻断探针包含SEQ IDNO:37、38或39或它们的任意组合的寡核苷酸序列。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述杂交步骤包括使所述扩增产物与所述一种或多种可检测探针接触,所述可检测探针用供体荧光部分和对应的受体部分进行标记;并且检测步骤包括检测所述探针的所述供体荧光部分与所述受体部分之间的荧光共振能量转移(FRET)的存在或不存在,其中荧光的存在指示所述样品中SARS-CoV-2变体的存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述生物学样品是鼻咽样品或口咽样品。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其进一步包括提供一组引物和可检测探针,所述一组引物扩增来自SARS-CoV-2的非结构开放阅读框(ORF1a/b)的特异性核酸序列,所述可检测探针与由所述一组引物生成的ORF1a/b扩增产物杂交并检测所述ORF1a/b扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述一组引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQ ID NO:15的寡核苷酸序列;并且所述可检测探针包含SEQ ID NO:36的寡核苷酸序列。
7.一种用于检测生物学样品中的具有刺突蛋白突变的SARS-CoV-2变体的多重方法,其包括:
-进行扩增步骤,所述扩增步骤包括使所述样品与至少两组引物接触以产生第一扩增产物和第二扩增产物,如果SARS-CoV-2核酸存在于所述样品中的话;
-进行杂交步骤,所述杂交步骤包括使所述扩增产物接触与由所述至少两组引物产生的所述第一扩增产物和所述第二扩增产物杂交的至少两种可检测探针;以及
-检测所述第一扩增产物和所述第二扩增产物中至少一者的存在,其中至少一种扩增产物的存在指示所述样品中所述SARS-CoV-2变体的存在;
其中第一组引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物包含SEQID NO:1的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQ ID NO:7或8的寡核苷酸序列;并且第二组引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQ IDNO:9、10或11的寡核苷酸序列;
其中与由所述第一组引物产生的所述第一扩增产物杂交的第一可检测探针包含选自由SEQ ID NO:16-17或其互补序列组成的组的寡核苷酸序列;并且其中与由所述第二组引物产生的所述第二扩增产物杂交的第二可检测探针包含选自由SEQ ID NO:18-20或其互补序列组成的组的寡核苷酸序列;并且
其中所述刺突蛋白突变选自69-70缺失(del 69-70)、N501Y突变、或E484K突变、或它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述杂交步骤或所述扩增步骤和所述杂交步骤两者在一种或多种阻断寡核苷酸探针的存在下进行;其中一种或多种阻断探针包含SEQ IDNO:37、38或39或它们的任意组合的寡核苷酸序列。
9.根据权利要求7至8中任一项所述的方法,其进一步包括提供一组引物和可检测探针,所述一组引物扩增来自SARS-CoV-2的非结构开放阅读框(ORF1a/b)基因的特异性核酸序列,所述可检测探针与由所述一组引物生成的ORF1a/b扩增产物杂交并检测所述ORF1a/b扩增产物。
10.根据权利要求9所述的方法,其中扩增所述ORF1a/b基因的所述一组引物包括正向引物和反向引物,所述正向引物包含SEQ ID NO:6的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQID NO:15的寡核苷酸序列;并且所述可检测探针包含SEQ ID NO:36或其互补序列的寡核苷酸序列。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法,其中用于所述SARS-CoV-2核酸的扩增的所述第一组引物包括所述正向引物和所述反向引物,所述正向引物包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸序列,并且其中所述第一可检测探针包含SEQ ID NO:17或其互补序列的寡核苷酸序列。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法,其中用于所述SARS-CoV-2核酸的扩增的所述第二组引物包括所述正向引物和所述反向引物,所述正向引物包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸序列,所述反向引物包含SEQ ID NO:10的寡核苷酸序列;并且其中所述第二可检测探针包含SEQ ID NO:19或其互补序列的寡核苷酸序列。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法,其中提供与由所述第二组引物产生的所述第二扩增产物杂交的第三可检测探针。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述第三可检测探针包含SEQ ID NO:20或其互补序列的寡核苷酸序列。
15.一种用于检测来自SARS-CoV-2变体的一个或多个刺突蛋白(S)基因突变的试剂盒,其包括:
-第一引物,所述第一引物包含选自由SEQ ID NO:1-5或其互补序列组成的组的第一寡核苷酸序列;
-第二引物,所述第二引物包含选自由SEQ ID NO:7-14或其互补序列组成的组的第二寡核苷酸序列;和
-可检测地标记的探针,所述可检测地标记的探针包含选自由SEQ ID NO:16-25或互补序列组成的组的寡核苷酸序列,所述可检测地标记的探针配置成与由所述第一引物和所述第二引物生成的扩增子杂交,并且其中所述可检测地标记的探针包含供体荧光部分和对应的受体部分。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其中
-所述第一引物包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列;
-所述第二引物包含SEQ ID NO:7或8的寡核苷酸序列;并且
-所述可检测地标记的探针包含SEQ ID NO:16或17或其互补序列的寡核苷酸序列。
17.根据权利要求15所述的试剂盒,其中
-所述第一引物包含SEQ ID NO:2的寡核苷酸序列;
-所述第二引物包含SEQ ID NO:9、10或11的寡核苷酸序列;并且
-所述可检测地标记的探针包含SEQ ID NO:18、19或20或其互补序列的寡核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的试剂盒,其进一步包括
-第一引物,所述第一引物包含SEQ ID NO:1的寡核苷酸序列;
-第二引物,所述第二引物包含SEQ ID NO:8的寡核苷酸序列;以及
-可检测地标记的探针,所述可检测地标记的探针包含SEQ ID NO:17或其互补序列的寡核苷酸序列。
19.一种对靶序列进行等位基因特异性扩增的方法,所述靶序列以多种变体序列的形式存在于样品中,所述方法包括:
-提供包含5'末端、3'末端和至少一个核苷酸的阻断寡核苷酸,
所述至少一个核苷酸为锁核酸(LNA),所述阻断寡核苷酸与野生型(WT)序列完全互补,当杂交时形成具有第一解链温度(Tm)的第一复合体;所述阻断寡核苷酸在一个或多个核苷酸处与靶突变体(MT)序列部分不互补,当杂交时形成具有第二解链温度(Tm)的第二复合体,其中所述第一Tm高于所述第二Tm,所述阻断寡核苷酸在3'末端处被阻断从而阻止延伸;以及
-利用核酸聚合酶在高于所述第二Tm但低于所述第一Tm的温度下进行扩增步骤,所述扩增步骤包括使所述样品与一组引物接触以产生扩增产物,如果所述WT序列和/或所述靶MT序列存在于所述样品中的话,其中所述阻断寡核苷酸在所述扩增步骤期间变得不与所述靶MT序列杂交,但保持与所述WT序列杂交从而抑制所述WT序列的扩增。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述阻断寡核苷酸包含SEQ ID NO:37、38或39或它们的任意组合的寡核苷酸序列。
21.一种用于对靶序列进行等位基因特异性扩增的试剂盒,所述靶序列以多种变体序列的形式存在,所述试剂盒包括:
-一组引物;和
-阻断寡核苷酸,所述阻断寡核苷酸包含5'末端、3'末端和至少一个核苷酸,所述至少一个核苷酸为锁核酸(LNA),所述阻断寡核苷酸与野生型(WT)序列完全互补,当杂交时形成具有第一解链温度(Tm)的第一复合体;所述阻断寡核苷酸在一个或多个核苷酸处与靶突变体(MT)序列部分不互补,当杂交时形成具有第二解链温度(Tm)的第二复合体,其中所述第一Tm高于所述第二Tm。
22.根据权利要求21所述的试剂盒,其中所述阻断寡核苷酸包含SEQ ID NO:37、38或39或它们的任意组合的寡核苷酸序列。
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