JP7478734B2 - カンジダ・アウリス（ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）の検出のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本開示は、分子診断の分野に関し、より詳しくは、カンジダ・アウリス（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｕｒｉｓ）の検出に関する。
カンジダ・アウリス（Ｃ．アウリス、ＣＡ）は、深刻な世界的健康の脅威を呈する新興真菌である。Ｃ．アウリスは日本では２００９年に最初に同定されたが、カンジダ株コレクションの遡及的検討により、Ｃ．アウリスの最も初期の既知の株は韓国では１９９６年のものであることが分かった。Ｃ．アウリスは２００９年に認識されたばかりであるが、急速に出現し、米国を含む２０を超える国から報告されている。いくつかの国の医療施設は、Ｃ．アウリスが入院患者に深刻な病気を引き起こしていると報告している。一部の患者では、この酵母が血流に入り、全身に広がり、重篤な侵襲性感染症を引き起こす可能性がある。
カンジダ・アウリスは、主にいくつかの理由で懸念される：１）しばしば多剤耐性であり、カンジダ感染症を治療するために一般的に使用される複数の抗真菌薬に耐性であることを意味する；２）標準的な研究室の方法で同定することは困難であり、特定の技術がなければ研究室で誤って同定される可能性がある。誤認は不適切な管理につながる可能性があり、３）医療現場でのアウトブレイクを引き起こしている。このため、医療施設がその拡散を止めるために特別な予防措置を講じることができるように、入院患者のＣ．アウリスを迅速に同定することが重要である。
Ｃ．アウリスの症例の約５４％が血液から同定されている、症例の残りの４６％は、尿、創傷、痰および胆汁を含むがこれらに限定されない他の身体部位で同定された。一部の臨床検査室は、通常、非無菌部位からの分離株の種を決定しないが、これは、これらの部位にカンジダが存在することは、感染ではなくコロニー形成を表す可能性があり、処置を必要としないからである。しかしながら、Ｃ．アウリスは、どの身体部位でも、Ｃ．アウリスが存在する場合には、より広いコロニー形成を示す可能性があり、伝播のリスクをもたらし、感染制御予防策の実施を必要とするため、非無菌の身体部位からでも同定することが重要である。
他のカンジダ感染症と同様に、Ｃ．アウリス感染症は、通常、血液または他の体液の培養によって診断される。しかしながら、Ｃ．アウリスは、他のより一般的なタイプのカンジダよりも培養物から同定するのが困難である。例えば、他の種類の酵母、特にカンジダ・ヘムロニイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）と混同される場合がある。Ｃ．アウリスを同定するためには、特殊な臨床検査が必要である。
限られたデータは、カンジダ・アウリス感染の危険因子が一般に他のタイプのカンジダ感染の危険因子と類似していることを示唆している。これらの危険因子には、最近の手術、糖尿病、広域抗生物質および抗真菌剤の使用が含まれる。
長い間医療施設に入院している患者、体内に入るラインおよびチューブを有する患者（呼吸管、栄養管および中心静脈カテーテル等）、または抗生物質もしくは抗真菌薬を以前に受けたことがある患者は、Ｃ．アウリスによる感染のリスクが最も高いようである。感染は、早産児から高齢者までのすべての年齢の患者に見られている。Ｃ．アウリス感染の危険因子についてより多くを知るためには、更なる研究が必要である。
培養中のカンジダ・アウリスコロニーの外観および色は種の同定に役立つ可能性があるが、Ｃ．アウリスは他の方法を使用しなければ他のより一般的なカンジダ種と区別することができないので、Ｃ．アウリスの唯一の同定方法として使用することはできない。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）に基づく診断装置は、Ｃ．アウリスを他のカンジダ種と区別することができるが、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ装置に含まれるすべての参照データベースが検出を可能にするわけではない。したがって、当技術分野では、Ｃ．アウリスを特異的に検出するためのより良好で完全な方法が必要とされている。
本開示の特定の実施形態は、生物学的または非生物学的試料中のカンジダ・アウリス（ＣＡ）の存在または非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管内でのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によるＣＡの多重検出のための方法に関する。実施形態は、増幅工程およびハイブリダイズ工程を含み得る少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含むＣＡの検出方法を含む。更に、実施形態は、単一チューブ内のＣＡの検出のために設計されたプライマー、プローブおよびキットを含む。検出方法は、最近傍のカンジダ・ヘムロニイおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を同定することができるカンジダ・アウリスゲノムの特定の遺伝子を標的とするように設計されている。
試料中のカンジダ・アウリス（ＣＡ）を検出する方法であって、試料中にＣＡが存在する場合、特定のＣＡ遺伝子を標的として増幅産物を産生するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーのセットと試料とを接触させることを含む増幅工程を実施すること、標的ＣＡ遺伝子に対する１つ以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと、増幅産物とを接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること、および増幅産物の存在または非存在を検出することを含み、増幅産物の存在は試料中のＣＡの存在を示し、増幅産物の非存在は試料中のＣＡの非存在を示し、標的ＣＡ遺伝子は５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子である、方法を提供する。
一態様では、試料中のカンジダ・アウリス（ＣＡ）を検出する方法であって、試料中にＣＡ核酸が存在する場合、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットと試料とを接触させて増幅産物を産生することを含む増幅工程を実施すること、増幅産物を１種以上の検出可能な５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブと接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること、および増幅産物の存在または非存在を検出することを含み、増幅産物の存在が試料中のＣＡの存在を示し、増幅産物の非存在が試料中のＣＡの非存在を示し、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットが、配列番号１～３からなる群から選択される第１の核酸配列またはその相補体を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号５～６および８からなる群から選択される第２の核酸配列またはそれらの相補体を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、を含み、１種以上の検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号９～１１からなる群から選択される第３の核酸配列またはそれらの相補体を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイズ工程は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識された検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブと増幅産物とを接触させることを含み、検出工程は、プローブのドナー蛍光部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光の存在または非存在は、試料中のＣＡの存在または非存在を示す。いくつかの実施形態では、増幅工程およびハイブリダイズ工程が繰り返される。ここで、繰り返し回数は、例えば、試料の性質に依存する。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くの増幅およびハイブリダイズ工程が必要となる。いくつかの実施形態では、増幅およびハイブリダイズ工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも２５回、３０回、４０回、５０回、６０回または更には１００回繰り返されてもよい。更に、増幅産物の存在または非存在の検出は、各増幅およびハイブリダイズ工程の間もしくは後に、１つおきの増幅およびハイブリダイズ工程の間もしくは後に、特定の増幅およびハイブリダイズ工程の間もしくは後に、または特定の増幅およびハイブリダイズ工程の間もしくは後に行うことができ、存在する場合、検出に十分な増幅産物が期待される。いくつかの実施形態では、増幅工程は、５’～３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。いくつかの実施形態では、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分は、プローブ上で互いに８～２０ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、アクセプター部分はクエンチャーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１～３、５～６、８、９～１１から選択されるヌクレオチドの配列、またはそれらの相補体を含むかまたはそれらからなり、１００個以下のヌクレオチド、５０個以下のヌクレオチド、４０個以下のヌクレオチドまたは３０個以下のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーおよび検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡプローブは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチドなど）を有する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２の核酸配列を含むかまたはそれからなり、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５の核酸配列を含むかまたはそれからなり、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１０の核酸配列を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドのいずれかは、４０個以下のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、本開示は、配列番号１～３、５～６、８、９～１１のいずれかまたはその相補体と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％など）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。必要に応じて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識および／または少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に修飾された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」または単に「保存的変異」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当業者であれば、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少量のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％または１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、修飾がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的修飾変異」であることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、第１および第２の標的ＣＡ遺伝子プライマー、ならびに検出可能な標的ＣＡ遺伝子プローブの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、増幅（増幅工程）は、５’～３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いることができる。したがって、ドナー蛍光部分およびアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、８または１０）以内であり得る。別の態様では、検出可能なプローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、一般に、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらす。該方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
本開示は、個体由来の生物学的試料中のＣＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。そのような方法は、一般に、増幅工程および色素結合工程を含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含む。典型的には、増幅工程は、標的ＣＡ遺伝子核酸分子が試料中に存在する場合、１つ以上の標的ＣＡ 遺伝子増幅産物を生成するために特定のＣＡ遺伝子を標的とするように設計された複数のプライマー対と試料を接触させることを含み、色素結合工程は、標的ＣＡ遺伝子増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。一実施形態では、標的ＣＡ遺伝子はＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子である。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在または非存在を検出することを含み、結合の存在は試料中のＣＡの存在を示し、結合の非存在は試料中のＣＡの非存在を示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。更に、そのような方法はまた、標的ＣＡ遺伝子増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含むことができ、融解温度はＣＡの存在または非存在を確認する。
更に別の態様では、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのキットが提供される。キットは、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に特異的なプライマーの１つ以上のセットと、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なプローブとを含み得る。
特に、本発明による方法に関連して上に開示されるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、本発明によるキットに含めるのに適している。本明細書では、配列番号１～３からなる群から選択される第１の核酸配列またはその相補体を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号５～６および８からなる群から選択される第２の核酸配列またはその相補体を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号９～１１からなる群から選択される第３の核酸配列またはその相補体を含む蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、検出可能に標識されたプローブとを含む、カンジダ・アウリス（ＣＡ）の５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子を検出するためのキットが提供される。一態様では、キットは、ドナー部分および対応するアクセプター部分、例えば別の蛍光部分またはダーククエンチャーで既に標識されているプローブを含むことができ、またはプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含むことができる。キットはまた、少なくとも１種の核酸ポリメラーゼの機能に必要なヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼおよび緩衝液を更に含むことができる。キットはまた、添付文書ならびにプライマー、プローブおよびフルオロフォア部分を使用して試料中のＣＡの存在または非存在を検出するための説明書を含むことができる。幾つかの実施形態では、第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む。いくつかの実施形態では、アクセプター部分はクエンチャーである。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２の核酸配列を含むかまたはそれからなり、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号５の核酸配列を含むかまたはそれからなり、オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１０の核酸配列を含むかまたはそれからなる。特定の実施形態では、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドのいずれかは、４０個以下のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつか実施形態では、第１、第２および第３のオリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチドを有する。
別の態様では、上に開示される標的ＣＡ遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーのセットを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットは、配列番号１～３またはその相補体からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第１のプライマーと、配列番号５～６および８またはその相補体からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる第２のプライマーとを含む。特定の実施形態では、組成物は、配列番号９～１１またはその相補体からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる１つ以上の検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブを更に含む。
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料が本主題の実施または試験で使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。矛盾する場合は、定義をも含む本明細書が優先する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的および利点は、図面および発明を実施するための形態、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
核酸増幅によるＣＡ感染の診断は、真菌感染を迅速かつ正確に検出する方法を提供する。試料中のＣＡを検出するためのリアルタイムアッセイを本明細書に記載する。ＣＡを検出するためのプライマーおよびプローブが提供され、そのようなプライマーおよびプローブを含有する製造品またはキットも提供される。他の方法と比較してＣＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲの感度の増加、ならびに試料の封じ込めおよび増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの改善された特徴は、臨床検査室におけるＣＡ感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施を実現可能にする。
本開示は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅および検出の技術を用いてＣＡを特異的に同定するために、ＣＡゲノムの特定の遺伝子座にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーおよび蛍光標識加水分解プローブを含む。ＣＡの標的選択には、公開配列データベースの包括的検索、ならびに最近傍のカンジダ・ヘムロニイおよびサッカロミセス・セレビシエを同定することができるＣＡ標的の文献検索が必要であった。公開配列データベースからの複数の標的を標的選択プロセスで分析したが、多くはＣ．ヘムロニイおよびＳ．セレビシエとの交差反応性を示した。更に、公開データベース内の配列は、マルチコピー標的からの「バルク」配列データによって複雑化される。分析の結果、選択した標的ＣＡ遺伝子はＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ３７５７７２）であった。
開示される方法は、１種以上のプライマー対を使用して試料からの核酸分子遺伝子標的の１種以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施することを含み得る。本明細書で使用される「プライマー（複数可）」は、ＣＡ中の標的遺伝子に特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。検討されるプライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、それぞれの標的核酸分子内またはそれに隣接する標的にアニーリングする。標的ＣＡ遺伝子核酸の１つ以上が試料中に存在すれば、１つ以上の増幅産物が生成され、したがって１つ以上の標的ＣＡ遺伝子増幅産物の存在が試料中のＣＡの存在を示す。増幅産物は、標的ＣＡ遺伝子の１つ以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。本明細書で使用される「プローブ（複数可）」は、標的ＣＡ遺伝子をコードする核酸配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリング工程は、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程および検出工程を含み、試料を、試料中のＣＡの存在または非存在を検出するために１つ以上の検出可能なプローブと接触させる。
本明細書で使用される「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子の一方または両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、および増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）ならびにポリメラーゼ酵素（例えば、ＭｇＣｌ2および／またはＫＣｌ）の最適な活性のための適切な緩衝液および／または補因子の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドだけでなく、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される３’～５’ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更に「ヌクレオチド」が結合され得ることを指す。したがって、おそらく意図された機能を除いて、「プライマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「プローブ」の間に基本的な違いはない。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。ハイブリダイゼーション条件は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離される。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」または「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（または他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼなどの生体触媒を組み込むヌクレオチドによって必要に応じて伸長される。
２つ以上の核酸配列の状況における「同一」または「パーセント同一性」という用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して、または目視検査によって測定された最大の一致について、比較またはアラインした場合、同一であるか、または同一のヌクレオチド特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列または部分配列を指す。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドに関して「修飾ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドにおいて置換され得る例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシキサントシン、ピラゾロピリミジン類縁体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボーＵ、２’－０－メチルリボーＣ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡなどが挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の修飾ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、または当技術分野で知られている。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド置換は、対応する修飾されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を修飾する。更に説明すると、特定の修飾ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）を減少させ、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらのタイプの核酸修飾の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。
ＣＡの検出
本開示は、例えばＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子核酸配列の一部を増幅することによってＣＡを検出する方法を提供する。該遺伝子の核酸配列は公的に入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ３７５７７２）。具体的には、特定のＣＡ核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
本開示は、例えばＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子核酸配列の一部を増幅することによってＣＡを検出する方法を提供する。該遺伝子の核酸配列は公的に入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ３７５７７２）。具体的には、特定のＣＡ核酸分子標的を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブが本開示の実施形態によって提供される。
ＣＡの検出のために、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのプライマーおよびプローブが提供される。本明細書に例示される核酸以外の核酸も、試料中のＣＡを検出するために使用することができる。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を使用して当業者によって特異性および／または感度について評価され得る。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書に開示される標的ＣＡ遺伝子核酸における１つ以上の欠失、挿入および／または置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～１２から選択される配列を有する核酸、配列番号１～１２の１つと少なくとも、例えば８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体、または配列番号１～１２の相補体および変異体を含む。
一実施形態では、ＣＡを含有すると疑われる生物学的試料中のＣＡの検出を提供するために、上記のプライマーおよびプローブのセットが使用される。プライマーおよびプローブのセットは、配列番号１～１２の核酸配列を含むか、またはそれからなるＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーおよびプローブを含むか、またはそれからなり得る。別の実施形態では、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子のプライマーおよびプローブは、配列番号１～１２のプライマーおよびプローブのいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、またはそれからなる。
配列番号１～１２のプライマーおよび／またはプローブのいずれかの機能的に活性な変異体は、開示される方法においてプライマーおよび／またはプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～１２のいずれかのプライマーおよび／またはプローブの機能的に活性な変異体は、配列番号１～１２のそれぞれの配列と比較して、記載の方法またはキットにおいて、類似するまたはより高い特異性および感度を提供するプライマーおよび／またはプローブに関する。
変異体は、例えば、配列番号１～１２のそれぞれの配列の５’末端および／または３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換などの１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失または置換によって、配列番号１～１２の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（および／またはプローブ）は化学的に修飾されていてもよく、すなわち、プライマーおよび／またはプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（またはプライマー）は修飾オリゴヌクレオチドである。「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの修飾によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基もしくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖もしくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分もしくはリン酸様部分、またはそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「修飾ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば７－デアザプリンで置き換えられてもよく、そのようにしても「修飾ヌクレオチド」が得られる。「修飾ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類縁体」という用語は、本出願では互換的に使用される。「修飾ヌクレオシド」（または「ヌクレオシド類縁体」）は、「修飾ヌクレオチド」（または「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの修飾によって天然のヌクレオシドとは異なる。
標的ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子をコードする核酸分子を増幅する修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．、コロラド州カスケード）などのコンピュータプログラムを使用して設計することができる。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、および各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に忠実度が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチド長）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、４０ヌクレオチド長以下である。
プライマーのセットに加えて、本方法は、ＣＡの存在または非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的または生物学的に生成された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指し、これは、設計または選択により、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）「標的核酸」、この場合は標的ＣＡ遺伝子核酸にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、記載されるＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブを、少なくとも１種の蛍光標識で標識することができる。一実施形態では、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブは、ドナー蛍光部分、例えば蛍光色素、および対応するアクセプター部分、例えばクエンチャーで標識することができる。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むか、またはそれからなり、核酸配列は配列番号９～１２を含むか、またはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブまたは一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（複数可）は、少なくとも１種の標識および／または少なくとも１種のクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常同様の融解温度を有し、各プローブの長さは配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長である。
コンストラクトは、それぞれがＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーおよびプローブ核酸分子のうちの１つを含有するベクターを含むことができる。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されている、および／または当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子核酸分子は、例えば、化学合成、ＣＡからの直接クローニング、またはＰＣＲ増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適したコンストラクトは、典型的には、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子核酸分子（例えば、配列番号１～１２の１つ以上の配列を含む核酸分子）に加えて、所望のコンストラクトおよび／または形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、ならびに複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性および回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
標的ＣＡ遺伝子核酸分子を含有するコンストラクトを、宿主細胞内で増殖させることができる。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物および真核生物、例えば酵母、植物および動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれ得る。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、ならびにアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）およびニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。コンストラクトを、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクションおよびウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。更に、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載される標的ＣＡ遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～７）を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号および同第４，９６５，１８８号には、従来のＰＣＲ技術が開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載される標的ＣＡ遺伝子核酸配列内の核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～７）を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、または合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、ならびに変性される核酸の長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度および核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、または１．５分）行われる。
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物を、記載される標的ＣＡ遺伝子核酸分子上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却させる。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進または最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な生成物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長生成物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長生成物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれる核酸などの複合混合物の微量画分であり得る。核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤ．Ｃ．）に記載されているような常用の手法によって生物学的試料から抽出され得る。核酸は、プラスミドなどの任意の数の供給源、または細菌、酵母、原虫ウイルス、細胞小器官、または植物もしくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマーを、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇのプロトタイピングされた鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼおよび１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、またはそれらの１種以上の類縁体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。標的核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、および伸長の工程を必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、およびヌクレオシドトリホスフェートの量である。サイクリング工程（すなわち、変性、アニーリング、および伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリング工程の数は、例えば、試料の性質に応じる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリング工程が必要となる。一般に、サイクリング工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、または１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および／または定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同大５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号）は、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、可視化できるかまたは他の方法で検出および／または定量することができる、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が起こるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で移動されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャーとを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、および同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬおよびＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラーおよび特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、または蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、または蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、光ファイバー光源、または所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分および対応するアクセプター部分「対応する」に関して本明細書で使用される場合、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分またはダーククエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行うことができる。
蛍光ドナー部分および対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；および（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、およびその蛍光発光に対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するドナー蛍光部分を選択することができる。高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、および可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有する対応するアクセプター蛍光部分を選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、および４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、またはランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、またはテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー蛍光部分およびアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、および蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、またはオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
ＣＡの検出
本開示は、生物学的または非生物学的試料中のＣＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、試料汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。上記方法は、１つ以上のプライマー対を使用して試料からの標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、およびＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。上記方法を、ＣＡの存在を検出するためにプライマーおよびプローブを使用して行うことができ、標的ＣＡ遺伝子の検出は、試料中のＣＡの存在を示す。
本開示は、生物学的または非生物学的試料中のＣＡの存在または非存在を検出する方法を提供する。提供される方法は、試料汚染、偽陰性、および偽陽性の問題を回避する。上記方法は、１つ以上のプライマー対を使用して試料からの標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリング工程を実施すること、およびＦＲＥＴ検出工程を含む。複数のサイクリング工程は、好ましくはサーモサイクラーで行われる。上記方法を、ＣＡの存在を検出するためにプライマーおよびプローブを使用して行うことができ、標的ＣＡ遺伝子の検出は、試料中のＣＡの存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在または非存在、したがってＣＡの存在または非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１種の蛍光色素および１種のクエンチャーで標識された１種の１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、そうなくてもよい。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分またはダーククエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリング工程中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部位を励起すると、第１の蛍光部位からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、試料中のＣＡの存在または非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部位および第２の蛍光部位で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部位は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）ｏｒ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に移動する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部位が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部位の発光スペクトルがアクセプター蛍光部位の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＣＡゲノムの数）と相関させることができる。標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズする工程は、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在は試料中のＣＡの存在を示し、ＦＲＥＴの非存在は試料中のＣＡの非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、または特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウムまたはアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功および／または精度に影響を及ぼし得る条件である。本明細書に開示される方法を使用すると、例えば４５サイクリング工程内のＦＲＥＴの検出はＣＡ感染を示す。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的試料としては、限定されないが、呼吸器検体、糞便検体、血液検体、皮膚スワブ、鼻スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚および軟部組織感染が挙げられる。生物学的試料の収集および保存方法は、当業者に知られている。生物学的試料を（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法および／またはキットによって）処理してＣＡ核酸を放出させることができ、またはいくつかの場合、生物学的試料をＰＣＲ反応成分および適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させることができる。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加の工程である。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、ＧおよびＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。増幅産物からのプローブの融解温度（複数可）は、試料中のＣＡの有無を確認することができる。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照試料も同様にサイクルすることができる。陽性対照試料は、例えば、対照プライマーおよび対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照試料はまた、例えば標的核酸分子を含むプラスミドコンストラクトを増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマーおよびプローブを使用して、内部で（例えば、試料内で）または患者の試料と並んで実行される別々の試料で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび／またはＦＲＥＴ反応の成功または失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システムおよび試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、ならびにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
一実施形態では、本方法は、汚染を回避する工程を含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減または排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号および同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号および国際公開第９７／４６７１２号。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。試料からのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリング工程の後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、すべての試料について連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮまたはＳＹＢＲ（登録商標）ＧＯＬＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
本開示の実施形態は、１種以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施形態は、ＣＡを検出するための製造品、組成物またはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＣＡ遺伝子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含むことができる。組成物は、標的ＣＡ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを含むことができる。特定の実施形態では、組成物はまた、標的ＣＡ遺伝子を検出するためのプローブを含むことができる。ＣＡを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
本開示の実施形態は、ＣＡを検出するための製造品、組成物またはキットを更に提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＣＡ遺伝子を検出するために使用されるプライマーおよびプローブを含むことができる。組成物は、標的ＣＡ遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを含むことができる。特定の実施形態では、組成物はまた、標的ＣＡ遺伝子を検出するためのプローブを含むことができる。ＣＡを検出するための代表的なプライマーおよびプローブは、標的核酸分子にハイブリダイズすることができる。更に、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素およびＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーションおよび検出に必要な適切に包装された試薬および材料を含み得る。プライマーおよびプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅して標的核酸分子にハイブリダイズするプライマーおよびプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１種以上の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、プローブを標識するためのドナーおよび／またはアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分および対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製造品はまた、試料中のＣＡを検出するプライマーおよびプローブを使用するための説明書を有する添付文書または包装ラベルを含むことができる。製造品および組成物は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、または汚染を防止するための薬剤）を更に含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１種に特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例において更に説明される。
以下の実施例、表および図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
実施例１
ＣＡの標的選択は、公開配列データベースの包括的検索、ならびに最近傍のカンジダ・ヘムロニイおよびサッカロミセス・セレビシエを同定する可能性のあるＣＡ標的の文献検索の結果であった。公開配列データベースからの複数の標的を設計段階の標的選択プロセスで分析したが、すべてがＣ．ヘムロニイおよびＳ．セレビシエとの交差反応性を示した。公開データベース内の配列は、マルチコピー標的からの「バルク」配列データによって複雑化される。選択されたオリゴヌクレオチドのＢＬＡＳＴ分析は、唯一の有意な交差反応性がカンジダ・ヘムロニイによるものであることを示した。
ＣＡの標的選択は、公開配列データベースの包括的検索、ならびに最近傍のカンジダ・ヘムロニイおよびサッカロミセス・セレビシエを同定する可能性のあるＣＡ標的の文献検索の結果であった。公開配列データベースからの複数の標的を設計段階の標的選択プロセスで分析したが、すべてがＣ．ヘムロニイおよびＳ．セレビシエとの交差反応性を示した。公開データベース内の配列は、マルチコピー標的からの「バルク」配列データによって複雑化される。選択されたオリゴヌクレオチドのＢＬＡＳＴ分析は、唯一の有意な交差反応性がカンジダ・ヘムロニイによるものであることを示した。
ＣＡのリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）４８００システムまたはｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州プレザントンの）のいずれかを使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：
以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：
Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性およびＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５°Ｃ、６０°Ｃおよび６５°Ｃでのインキュベーションを含んでいた。３種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（生物の遺伝的変異体など）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２つの測定に分け、いずれの測定も１段階の設定を適用する（アニーリングと伸長を組み合わせる）。５５℃での最初の５サイクルは、わずかにミスマッチした標的配列を予備増幅することによって包括性の増加を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異性を高める。
ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅および検出を、上記の条件を用いて行った。ＰＣＲ反応当たり１０万、１万および１，０００ゲノム（ｇｅ／ＰＣＲ）当量の濃度で存在するゲノムＣＡ ＤＮＡに対するいくつかの選択されたオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、ならびに両方ともＰＣＲ反応当たり１０万ゲノム（ｇｅ／ＰＣＲ）当量の濃度で存在するゲノムカンジダ・アウリス（ＣＡ）およびカンジダ・ヘムロニイ（ＣＨ）を用いた実験の結果を、増幅反応のＣｔ値（閾値サイクル）として以下に示す。
ＣＡに対する最良の感度およびＣＨに対する最良の排他性を示したアッセイは、ＡＵＲ１、ＡＵＲ２およびＡＵＲ５であったが、ＡＵＲ４およびＡＵＲ６アッセイは、ＣＨに対するいくらかの交差反応性を示した。ＡＵＲ２アッセイ（すなわち、フォワードプライマー配列番号２、リバースプライマー配列番号５およびプローブ配列番号１０）を、１０万、１万および１，０００ｇｅ／ＰＣＲの濃度で存在するゲノムＣＡ ＤＮＡ、および１０万ｇｅ／ＰＣＲの濃度で存在するゲノムＣＨ ＤＮＡで更に試験し、この実験のＰＣＲ増殖曲線を図１に示す。非修飾プライマー（ＡＵＲ２）と３’末端にｔｅｒｔ－ブチル－ベンジル部分で修飾されたプライマー（ＡＵＲ２ＴＢＢ）との間の増殖曲線に差は観察されなかった。修飾プライマーまたは非修飾プライマーを使用したＣＨ鋳型（Ｃ．ヘムロニイ／Ｃ．ヘムロニイＴＢＢ）および鋳型なし対照（ＡＵＲ２ ＮＴＣ／ＡＵＲ２ＴＢＢ ＮＴＣ）については、シグナルは検出されなかった。
前述の発明を明確化および理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細の様々な変更を行うことができることが当業者には明らかであろう。例えば、上述したすべての技術および装置を、様々な組み合わせで使用することができる。本出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献は、あたかも各個別の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。
略式の配列表
配列番号１：ＣＡＵＲ００１フォワードプライマー TGAGCGTGATGTCTTCTCAC
配列番号２：ＣＡＵＲ００３フォワードプライマー GAGCGTGATGTCTTCTCACC
配列番号３：ＣＡＵＲ００５フォワードプライマー ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAA
配列番号４：ＣＡＵＲ００７フォワードプライマー AACTAACCCAACGTTAAGTTCAAC
配列番号５：ＣＡＵＲ００２リバースプライマー CCTGATTTGAGGCGACAACAA
配列番号６：ＣＡＵＲ００４リバースプライマー CGTCTGCAAGTCATACTACGTA
配列番号７：ＣＡＵＲ００６リバースプライマー CGATGATTCACGTCTGCAAGTC
配列番号８：ＣＡＵＲ００８リバースプライマー CAACGCCACCGCGAA
配列番号９：ＣＡＵＲ１０１ＨＱ６プローブ CTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号１０：ＣＡＵＲ１０３ＨＱ６プローブ TTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号１１：ＣＡＵＲ１０５ＨＱ１０プローブ ACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATG
配列番号１２：ＣＡＵＲ１０７ＨＱ８プローブ CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA
略式の配列表
配列番号１：ＣＡＵＲ００１フォワードプライマー TGAGCGTGATGTCTTCTCAC
配列番号２：ＣＡＵＲ００３フォワードプライマー GAGCGTGATGTCTTCTCACC
配列番号３：ＣＡＵＲ００５フォワードプライマー ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAA
配列番号４：ＣＡＵＲ００７フォワードプライマー AACTAACCCAACGTTAAGTTCAAC
配列番号５：ＣＡＵＲ００２リバースプライマー CCTGATTTGAGGCGACAACAA
配列番号６：ＣＡＵＲ００４リバースプライマー CGTCTGCAAGTCATACTACGTA
配列番号７：ＣＡＵＲ００６リバースプライマー CGATGATTCACGTCTGCAAGTC
配列番号８：ＣＡＵＲ００８リバースプライマー CAACGCCACCGCGAA
配列番号９：ＣＡＵＲ１０１ＨＱ６プローブ CTTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号１０：ＣＡＵＲ１０３ＨＱ６プローブ TTCGCGGTGGCGTTGCATTCACA
配列番号１１：ＣＡＵＲ１０５ＨＱ１０プローブ ACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATG
配列番号１２：ＣＡＵＲ１０７ＨＱ８プローブ CTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA
Claims (15)
- 試料中のカンジダ・アウリス（ＣＡ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ）を検出する方法であって、
－ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ核酸が前記試料中に存在する場合、ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットと前記試料とを接触させて増幅産物を生成することを含む増幅工程を実施すること、
－１種以上の検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プローブと前記増幅産物とを接触させることを含むハイブリダイズ工程を実施すること、および
－前記増幅産物の存在または非存在を検出することであって、前記増幅産物の存在が前記試料中のＣＡの存在を示し、前記増幅産物の非存在が前記試料中のＣＡの非存在を示す、検出すること、を含み、
ここで、
前記ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットが、配列番号１または配列番号２の第１の核酸配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号５の第２の核酸配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、かつ、
前記１種以上の検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号９または配列番号１０の第３の核酸配列またはその相補体を含む；あるいは、
前記ＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子プライマーのセットが、配列番号３の第１の核酸配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、配列番号８の第２の核酸配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを含み、かつ、
前記１種以上の検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号１１の第３の核酸配列またはその相補体を含む；
方法。 - 前記ハイブリダイズ工程が、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分で標識された検出可能なＣＡ ５．８ｓ／ＩＴＳ２ ｒＲＮＡ遺伝子オリゴヌクレオチドプローブと前記増幅産物とを接触させることを含み、検出工程が、前記オリゴヌクレオチドプローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在または非存在を検出することを含み、蛍光の前記存在または非存在が、前記試料中のＣＡの存在または非存在を示す、請求項１に記載の方法。
- 前記増幅工程が、５’～３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ドナー蛍光部分および前記対応するアクセプター部分が、前記プローブ上で互いに８～２０ヌクレオチド以内にある、請求項２または３に記載の方法。
- 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号２の核酸配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号５の核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１０の核酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに前記第３のオリゴヌクレオチドプローブが４０個以下のヌクレオチドを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに前記第３のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つが、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- カンジダ・アウリス（ＣＡ）の核酸を検出するためのキットであって、
－配列番号１または配列番号２の第１の核酸配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
－配列番号５の第２の核酸配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
－配列番号９または配列番号１０の第３の核酸配列またはその相補体を含む蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ；あるいは、
－配列番号３の第１の核酸配列を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマー、
－配列番号８の第２の核酸配列を含む第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに
－配列番号１１の第３の核酸配列またはその相補体を含む蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブ；
を含む、キット。 - 蛍光検出可能に標識された前記オリゴヌクレオチドプローブが、ドナー蛍光部分および対応するアクセプター部分を含む、請求項９に記載のキット。
- 前記アクセプター部分がクエンチャーである、請求項１０に記載のキット。
- ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、および核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液の少なくとも１つを更に含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに前記第３のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つが、少なくとも１種の修飾ヌクレオチドを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１および前記第２のオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに前記第３のオリゴヌクレオチドプローブが４０個以下のヌクレオチドを有する、請求項９～１３のいずれか一項に記載のキット。
- 前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号２の核酸配列を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドプライマーが配列番号５の核酸配列を含み、前記オリゴヌクレオチドプローブが配列番号１０の核酸配列を含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載のキット。
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Non-Patent Citations (3)
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