CN114958837B - 一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents
一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供用于检测耳念珠菌的PCR引物组合物，包括上引物和下引物，所述上引物具有如序列1所示的核苷酸序列，下引物具有如序列2所示的核苷酸序列。本发明的有益效果是本发明可以快速、精准的检测出耳念珠菌，该检测体系的最低检测限可以达到1 CFU/PCR的反应，在样品处理后4小时内获得结果，显著缩短了检出时间，本发明的检测方法特异性更高，灵敏度更好。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，更具体地说涉及一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物、试剂盒及方法。
背景技术
耳念珠菌（Candida auris）一种新兴的在2009年发现的多重耐药酵母菌，出现和传播的确切机制目前尚不清楚，大多数耳念珠菌对至少一种抗真菌药物类具有抗性，超过三分之一的菌株对两种抗真菌药物具有抗药性，而部分菌株对所有三种抗真菌药物的最低抑菌浓度升高，因其具有多重耐药和致死率高的特征，也被称为“超级真菌。耳念珠菌感染通常会在医院等环境内传播，并可引起侵袭性感染，血液感染致死率高。
在通用、传统的生化鉴定、显微镜观察等微生物鉴别方法别中，耳念珠菌和普通的念珠菌几乎没有分别，致使鉴别困难，因此误诊可能性较大，而且传统培养鉴别时间一般要4-14天，鉴别周期时间长。
分子生物学技术，尤其是是PCR技术可以实现对耳念珠菌简单快速灵敏准确的有效检测。常用的检测方法是针对核糖体基因转录间隔区ITS2区域设计引物，但是鉴于ITS2区在真菌间的保守性高，针对耳念珠菌的序列特异性并不高。
因此，急需一种实时PCR检测方法，高效快速地检测耳念珠菌。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物，还提供了快速精准检测耳念珠菌的试剂盒以及其检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，包括上引物、下引物及探针，所述上引物具有如序列1所示的核苷酸序列，所述下引物具有如序列2所示的核苷酸序列，所述探针具有如序列3所示的核苷酸序列。
优选的，所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
由上述任一方案优选地是，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为TAMRA。
由上述任一方案优选地是，该试剂盒的检测最低检测限为1 CFU/PCR。
一种检测耳念珠菌的方法，包括如下步骤：
第一步，以待测样品DNA为模板，利用快速精准检测耳念珠菌的试剂盒对所述待测样品DNA进行PCR检测；
第二步，基于检测结果，该方法以非疾病诊断为目的，确定待测样品中是否含有耳念珠菌；
一种快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，包括上引物、下引物及探针，所述上引物具有如序列1所示的核苷酸序列，所述下引物具有如序列2所示的核苷酸序列，所述探针具有如序列3所示的核苷酸序列。
所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团；
所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为TAMRA；
该试剂盒的检测最低检测限为1 CFU/PC。
优选的，所述第一步中PCR检测的反应体系为反应酶混合液为13-14μL，引物和探针的混合物的加入量为2-3μL，DNA模板的加入量为5-6μL。
由上述任一方案优选地是，所述第一步中PCR的扩增条件为：
本发明的有益效果为：
1. 本发明可以快速、精准的检测出耳念珠菌。
2. 该检测体系的最低检测限可以达到1 CFU/PCR的反应，优于传统的PCR检测技术 (1 .02×104CFU/ml) 。
3. 本发明提供的高效、特异和可靠的检测方法，可用于耳念珠菌的鉴别，并能在4小时之内获得结果， 显著缩短了检出时间，本发明的检测方法特异性更高，灵敏度更好。
4. 探针与引物的组合效果对扩增效果有重要影响，本发明中的引物和探针特异性良好、覆盖度高并且灵敏度高，可以将其他干扰菌区别开，例如白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌及热带念珠菌。
附图说明
图1耳念珠菌10倍梯度浓度稀释的扩增曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实验材料和方法：
1实验材料
1.1菌株：耳念珠菌及特异性检测使用的5种干扰菌，来源于ATCC。菌株名称和ATCC编号见表1：
表1菌株名称和来源
1.2主要试剂和仪器：
酵母基因组DNA提取试剂盒（天根，DP307）。鲲鹏基因 Archimed X4 医用实时荧光定量PCR仪。
2实验方法
2.1靶标区域的筛选和引物探针设计
通过NCBI网站，从Genebank数据库中下载全部的耳念珠菌基因组序列和线粒体序列，使用CLUSTAL软件进行多重序列比对，选择耳念珠菌保守区。再利用BLAST核苷酸算法，对保守序列的特异性进行分析。根据BLAST比对结果，筛选出特异性最高的序列区域如序列4所示，分别设计引物和探针如表2所示。
表2 引物探针组
根据各种引物探针组合扩增相同浓度（1000 copies）耳念珠菌DNA的扩增结果见表3，最优的检测体系是P2-2引物探针组合。
表3 不同检测体系对相同浓度的耳念珠菌DNA模板扩增Ct值：
3. 用本发明的引物及TaqMan探针进行耳念珠菌的实时荧光定量PCR检测
3.1 DNA模板的准备
对检测菌株耳念珠菌和验证菌株见表1，均采用天根生化科技（北京）有限公司的酵母基因组DNA提取试剂盒（DP307）提取，提取方法完全按照试剂盒说明书进行。提取后的基因组DNA保存在-20 ℃。
3.2 荧光定量的条件优化
3.2.1 荧光定量PCR的条件：
针对PCR体系和反应中以下条件进行优化，引物浓度（100 nM，200 nM，500 nM），探针浓度（100 nM，200 nM，500 nM）退火温度（50 ℃，55 ℃，60 ℃），延伸时间（60 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s， 60 ℃ 30 s）40个循环。
3.2.2 最优反应条件
引物500 nM和探针100 nM，最优的扩增程序为见表4，在此反应条件下，能出现最高的荧光值，最小的Ct值，阴性对照不扩增。
表4 最优的PCR扩增条件
3.2.3反应体系：
反应酶混合液13μL，引物探针混合物2μL，DNA模板5 L，合计20μL。
3.3实验结果
3.3.1 灵敏度
使用105cfu耳念珠菌进行提取后的DNA进行10倍梯度稀释，6个梯度，稀释后系列为105、104、103、102、101、1cfu，每个梯度2个重复。以稀释后的DNA作为模板进行扩增，结果见图1。
结论：在1个cfu稀释度能有效检出，CT<38。
3.3.2 最低检测限
提取的耳念珠菌DNA，梯度稀释后以1cfu对应的DNA作为模版，20次重复检测，评估标准Ct≤38，检出率100%，Ct、CV均小于5%，结果见表5。
表5 最低检测限验证
3.3.3特异性
使用与耳念珠菌同源的103念珠菌基因组DNA混入相当于10cfu的耳念珠菌DNA中，对耳念珠菌的扩增都没有影响，结果见表6。
扩增方案，分别使用以下病原作为模版：
1）10cfu耳念珠菌；
2）10cfu耳念珠菌+1000cfu白色念珠菌；
3）10cfu耳念珠菌+1000cfu光滑念珠菌；
4）10cfu耳念珠菌+1000cfu近平滑念珠菌；
5）10cfu耳念珠菌+1000cfu克柔念珠菌；
6）10cfu耳念珠菌+1000cfu热带念珠菌；
7）1000cfu白色念珠菌；
8）1000cfu光滑念珠菌；
9）1000cfu近平滑念珠菌；
10）1000cfu克柔念珠菌；
11）1000cfu热带念珠菌。
按照确定的体系进行扩增。
表6 特异性检测
结论：本发明所设计的引物能够特异性检出耳念珠菌，最低检测限为1个cfu/反应。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司
<120> 一种快速精准检测耳念珠菌的引物组合物、试剂盒及方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tacgtagacg gaattggtct c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacttttgc ttaaccgctc t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcaccgat tccctcacga 20
<210> 4
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtcagat attccaagct tccattcaga gagcttgttc gtcattataa tgctgatatc 60
gtttatacgc cgatgatatt ggccagagag ttcgtgcgta acgatatcgc cagaatcagc 120
gatttttcaa caaaccaaac tgacagcccc gtaatagttc aagtgggctg taacaacgtt 180
caagatcttc ttaagtttgt cgagatgatg catccgtacg tagacggaat tggtctcaat 240
tgtggatgtc ccattcgaga gcaagttcgt gagggaatcg gtgctgccct tatgtctcaa 300
ccggaactag tttccgatat ggtaagagcg gttaagcaaa agtatggcga ttctatatgc 360
attgagacca aaatcaggat ccacagactt gaatga 396
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaactgacag ccccgta 17
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<211> 17
<212> DNA
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<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caagtgggct gtaacaacgt tc 22
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atatcgccag aatcagc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attgagacca attccgt 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aacaaaccaa actgacagcc 20
Claims (7)
1.一种快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于：包括上引物、下引物及探针，所述上引物具有如序列1所示的核苷酸序列，所述下引物具有如序列2所示的核苷酸序列，所述探针具有如序列3所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于：所述探针的5’端标记有荧光基团，所述探针的3’端标记有淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为TAMRA。
4. 根据权利要求1-3任一所述的快速精准检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于：该试剂盒的检测最低检测限为1 CFU/PCR。
5.一种检测耳念珠菌的方法，该方法以非疾病诊断为目的，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，以待测样品DNA为模板，利用权利要求1-4任一项所述的试剂盒对所述待测样品DNA进行PCR检测；
第二步，基于检测结果，确定待测样品中是否含有耳念珠菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一步中PCR检测的反应体系为反应酶混合液为13-14μL，引物和探针的混合物的加入量为2-3μL，DNA模板的加入量为5-6μL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一步中PCR的扩增条件为：
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