CN105925683B - 迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，所述引物对包括上游引物hlyB‑III‑F和下游引物hlyB‑III‑R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法。本发明还公开了一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。本发明还公开了迟缓爱德华氏菌的检测方法。用本发明的方法可以快速准确地检测无鳞鱼体内或养殖水体是否含有致病菌，做到有针对性的防治鱼病。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类致病菌的检测领域，涉及一种鱼类致病菌检测试剂盒以及检测方法，尤其涉及一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒及其应用。
背景技术
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是革兰氏阴性短杆菌，爱德华氏菌属，由Hoshina在1962年首次报道，是当前水产养殖业中的有着极大危害的病原菌之一。该菌的宿主范围非常广泛，除可以感染多种鱼类外，也有感染两栖类、爬行类和哺乳类(包括人在内)的报道。因此，为了对E.tarda进行及时诊断、监控和防治，建立一种快速、准确、简便的E.tarda检测技术就具有重要意义。
常规细菌鉴定方法包括对病原形态、生理生化水平及蛋白质水平等的鉴定，但由于检测灵敏度不高，测试项目较多和费时费力等缺点，不能满足快速检测的要求。近年来随着分子生物学、生化技术的快速发展，新的E.tarda的检测方法得到了应用。目前分别建立了基于hemolysin、fimbrial、gyrB基因的polymerase chain reaction(PCR)检测技术以及E.tarda的间接ELISA检测方法。以上方法较传统的细菌常规鉴定具有快速、特异等优点，但以上方法在应用中受到诸如制备抗原及抗体、需要PCR仪和凝胶电泳等专用设备的制约，在生产中不能得到普及应用。荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chainreaction，PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在病原检测领域得到了广泛应用。目前对于迟缓爱德华氏菌的检测国内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养殖水体中是否存在致病菌的技术。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对。
本发明所要解决的第二个技术问题是一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种迟缓爱德华氏菌的检测方法。
本发明的目的是提供用于荧光定量基因扩增法快速检测E.tarda的引物及其应用。首先通过生物信息学手段，针对E.tarda核苷酸序列具有种间保守及科、属间特异的区域作为引物组的设计区间，最后通过PCR条件优选确定最优条件。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供了用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，所述引物对包括上游引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
上游引物hlyB-III-F：
5’-CTGCTGATGTCCACCCTACA-3’；
下游引物hlyB-III-R：
5’-CGCTGTAAATTCTCCAGCCC-3’。
作为优选，本发明所采用的上游引物hlyB-III-F和下游引物hlyB-III-R的浓度比是1:1。
一种迟缓爱德华氏菌的hlyB基因序列的扩增方法，包括以下步骤：
1)生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如所述的引物对：
2)迟缓爱德华氏菌的hlyB基因的荧光定量PCR检测：迟缓爱德华氏菌基因组DNA的提取，将基因组DNA进行常规PCR检测获得阳性DNA样品；
3)以上述的阳性DNA样品为模板，将所述的引物对扩增迟缓爱德华氏菌的基因组DNA序列得到PCR产物；
4)PCR扩增产物分析并测序。
上述步骤1)通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到所述的引物对。
一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，它包含所述的引物对。
所述试剂盒包括：
1)迟缓爱德华氏菌反应液和Taq聚合酶：迟缓爱德华氏菌反应液包括含有dNTPs、buffer、MgC12、SYBR green I、DEPC水及所述的引物对的混合液；
2)强阳性对照品：
3)临界阳性对照品；
4)DNA提取液；
5)阴性对照品。
其中，上述迟缓爱德华氏菌反应液是由10×buffer，dNTPs、10000×SYBR greenI、DEPC水、引物对的混合物配制而成。
本发明的DNA提取液为chelex-100。
所述的强阳性对照品是重组质粒pBlue-hlyB-I，所述重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
上述的迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。
迟缓爱德华氏菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR检测方法。
上述检测方法具体包括以下步骤：
1)提取鱼取样组织的DNA得到样品DNA；
2)建立反应体系进行实时荧光定量PCR；
3)通过比对标准品实时荧光定量PCR扩增曲线确定是否感染迟缓爱德华氏菌。
上述的检测方法，所述步骤2)中的反应体系为：5pmol/μL的上游引物hlyB-III-F1μL，5pmol/μL的下游引物hlyB-III-R 1μL，样品DNA5μL，5U Taq DNA聚合酶的0.6μL，3μLDEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5uL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μLDEPC水的混合物；所述PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃l0sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：
1、首次提供了迟缓爱德华氏菌hlyB荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR检测对待测样本中的迟缓爱德华氏菌hlyB基因进行检测成为可能。
2、本检测方法与迟缓爱德华氏菌其它常规检测方法如细菌的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高，并且有效的防止了污染。
3、本检测方法与迟缓爱德华氏菌的其它常规检测方法，如细菌的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用。
4、本检测方法不仅能够评价鱼体的迟缓爱德华氏菌感染状况，同时也可用于水体或环境中迟缓爱德华氏菌的检测。
综上所述，本发明能为快速、准确地检测出迟缓爱德华氏菌提供了保证，对预防疾病，科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本发明的专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼类主要患病组织(鳃，体表)及水体或环境中迟缓爱德华氏菌hlyB基因的核酸检测，应用前景广阔。
附图说明
图1是采用三对引物对分别对于迟缓爱德华氏菌的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图2是采用三对引物对对迟缓爱德华氏菌及六种非靶标鱼类致病菌的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图3是利用第三对引物hlyB-III-F/hlyB-III-R进行的标准品实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图4是利用第三对引物hlyB-III-F/hlyB-III-R对病鱼DNA样本进行检测PCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。本发明的实验方法均参照《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯等主编，科学出版社2005年出版)所建议的实验条件。
实施例1：用于对迟缓爱德华氏菌hlyB基因进行荧光定量PCR检测的引物设计及筛选
1.生物信息学方法设计引物及进行引物筛选
下载GenBank收录的迟缓爱德华氏菌的全序列(GeneBank：CP006664)，同时下载阴性对照菌hlyB基因，阴性对照菌包括黄杆菌、河弧菌、荧光假单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌相关物种，所有对照细菌均来自中科院水生所分离保存的细菌，请见下表。通过Clustal X进行比对后，选择合适区域设计引物，该区域在迟缓爱德华氏菌种内保守，但相对于阴性对照至少存在10％-30％的差异，选定区域后采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物。引物中允许同一变异位点允许2个及2个以下简并碱基。将所提取的备选引物满足以下要求进行筛选：①引物长度(L)在19-28bp之间；②Tm值在58-60℃之间；⑧GC％在25-75％之间；④polyN≤4bp；⑤Hairpin≤4bp；⑥覆盖率>90％；⑦扩增产物长度控制在50-250bp之间；⑧进行BLAST筛选，特异性分数>L×0.4。所用PCR引物由上海生工公司合成，引物要求PAGE纯化，到货时为引物干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，引物至100pmol/μL贮存液后备用。
针对迟缓爱德华氏菌hlyB基因，共设计了3组上下游引物，序列如下：
hlyB-I(160bp)
上游引物hlyB-I-F：5’-TGCCCTGCTTCCCTATTTCT-3’；
下游引物hlyB-I-R：5’-TGGTCGATAAGGCGGTTTTG-3’
hlyB-II(237bp)
上游引物hlyB-II-F：5’-TAACCTGCTGATGTCCACCC-3’；
下游引物hlyB-II-R：5’-TCCAGCCCCTGTTCGATATC-3’
hlyB-III(245bp)
上游引物hlyB-III-F：5’-CTGCTGATGTCCACCCTACA-3’；
下游引物hlyB-III-R：5’-CGCTGTAAATTCTCCAGCCC-3’
| 阴性对照物种名称(拉丁名) | GenBank |
| Flavobacterium psychrophilum | NZ_CP008883 |
| Aeromonas hydrophila | NZ_CP010947 |
| Aeromonas veronii | CP002607 |
| Pseudomonas aeruginosa | CP007224 |
| Vibrio tubiashii | KF270491.1 |
2.分子生物学实验进行引物检测
2.1、实验材料及试剂：
材料：鱼类常见致病菌黄杆菌、河弧菌、荧光假单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌。五个菌株均来自中科院武汉水生生物研究所。使用前均用相应的培养基活化，并分别用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取基因组DNA。将提取的基因组DNA10倍梯度稀释，用于评价PCR体系的特异性和灵敏度。
试剂：5U/μL Taq DNA polymerase(Promega，含10×reaction buffer和25mMMg2 +)、10mM dNTPs(Promega)、DNA marker I(Tiangen)；Millipore H2O高压灭菌后分装，于-20℃保存备用。
2.2引物、菌株测试
用常规PCR测试所设计的引物和购买的菌株，PCR反应体系根据各组分的浓度配制，扩增程序根据引物的TM值及产物的大小编写。常规PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物。
2.3结果
2.3.1迟缓爱德华氏菌
A.常规PCR测试购买的细菌及设计的引物
设计的三对引物序列如下：hlyB-I-F/hlyB-I-R、hlyB-II-F/hlyB-II-R、hlyB-III-F/hlyB-III-R；从图1可以看出，对于迟缓爱德华氏菌，所设计的三对引物对均可扩增出靶标条带，表明购买的迟缓爱德华氏菌、自行设计的引物以及使用的PCR扩增体系均可用于后续的实验。
B.常规PCR检测体系的特异性
对于常见的五种非靶标鱼类致病菌，使用建立的常规PCR检测体系均为检测阴性，对迟缓爱德华氏菌为检测阳性，这表明所建立的常规PCR检测体系具有极好的特异性，可以用于迟缓爱德华氏菌的快速检测(如图2所示)。
3.荧光定量检测引物扩增效率
3.1阳性对照物及标准模板的制备
用建立的常规PCR体系扩增迟缓爱德华氏菌的基因组，2％琼脂糖凝胶电泳分离得到特定的靶标条带。用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶标DNA。将回收的部分DNA加入到连接体系中(10μL，含线性克隆载体、连接酶和连接酶buffer)，16℃连接过夜。次日，将全部的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落。挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子。将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中培养过夜，并取1mL提取质粒DNA(普通质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，从而得到阳性对照物。测定提取的质粒DNA的浓度，稀释到一定倍数作为阳性对照用于PCR检测。
3.2引物PCR扩增效率检测
引物的筛选原则为：在目的保守区中选择PCR扩增效率较高的引物作为候选引物。
3.2.1梯度模板准备
将阳性对照物DNA(上述3.1所得)，用无菌水以10倍梯度稀释，作为荧光定量PCR反应体系优化用模板。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释度，编号依次对应为L1、L2、L3、L4、L5、L6。分装后于-70℃保存备用。
3.2.2荧光定量PCR缓冲液及PCR程序
PCR反应体系为：上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物1.5μL(5pmol/μL)，样品DNA5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，4μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的Takara公司的10×buffer，2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μLDEPC水的混合物配制而成；PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃lOsec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，结果如表1所示。
3.2.3结果
表1
| 引物 | 10<sup>-4</sup> | 10<sup>-5</sup> | 10<sup>-6</sup> | 10<sup>-7</sup> | 10<sup>-8</sup> | 扩增效率 |
| hlyB-I | 15.6 | 18.5 | 22.3 | 25.5 | 28.6 | 126.3％ |
| hlyB-II | 15.1 | 18.3 | 21.1 | 24.6 | 28.6 | 81.6％ |
| hlyB-III | 16.9 | 19.6 | 23.3 | 26.5 | 30.1 | 99.3％ |
注：表格中注明值为Ct值。
根据扩增效率来看，选择III号引物对hlyB-III-F/hlyB-III-R继续后续实验。
实施例2：荧光定量PCR引物用量的优化
1、荧光定量PCR引物用量的第一次优化
用稀释好的L1(10-4)和L2(10-5)阳性对照DNA作为引物量优化的模板，分别对引物的上下游的用量在5.0-12.5pmol范围内进行梯度稀释优化，PCR反应体系为：上下游引物量见表2，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(2.5μL的Takara公司的10×buffer，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃lOsec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果如表2所示，从结果可以分析出，PCR引物在5.0-12.5pmol/反应时均可以正常工作，其中引物组合(1.0μL×5pmole/μL、2.0μL×5pmole/μL)、(1.0μL×5pmole/μL、2.5μL×5pmole/μL)、(1.5μL×5pmole/μL、2.0μL×5pmole/μL)、(1.5μL×5pmole/μL、1.5μL×5pmole/μL)，(2.0μL×5pmole/μL、2.5μL×5pmole/μL)、(2.5μL×5pmole/μL、1.5μL×5pmole/μL)反应效率最高，将上游引物量1.5-2.0μL×5pmole/μL、下游引物量2.0-2.5μL×5pmole/μL作为引物用量进行第二次筛选。
表2：实时荧光定量PCR引物用量的第一次优化结果
注：表格中注明值为Ct值，“1.0,1.5,2.0,2.5”为25μLPCR体系中引物(浓度为5pmole/μL)的用量(μL)。
2、荧光定量PCR引物用量的第二次优化
为测试不同引物用量组合对于试剂灵敏度的影响，选用浓度更低的DNA模板进行测试。使用提取的DNA(实施例l中扩增得到)进行梯度稀释取L3(10-6)、L4(10-7)，L5(10-8)作为第二次引物量优化的模板，对各组引物在第一次优化基础上进一步进行优化。PCR反应体系为：上下游引物量见表3，样品DNA5μL，TaqDNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreen I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果如表3所示，本次优化上游引物在7.5pmol，下游引物在12.5pmol时检测结果较好，选择此浓度为本发明实时荧光定量PCR引物的使用浓度。
表3实时荧光定量PCR引物用量的第二次优化结果，
注：表格中注明值为Ct值，“1.0，1.5，2.0，2.5”为25μLPCR体系中引物(浓度为5pmole/μL)的用量(μL)以上优化结果表明，本发明迟缓爱德华氏菌实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量基本如表4所示。
表4迟缓爱德华氏菌实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量
| 组份 | 规格 | 用量 |
| 实时荧光定量PCR反应缓冲液 | 2X | 12.5μL |
| Taq DNA聚合酶 | 5U | 0.6μL |
| 引物用量 | 5pmol/μL | 上游1μL，下游1μL |
| 无菌水 | 补充至25μL | |
| DNA模板 | 5μL |
实施例3：迟缓爱德华氏菌hlyB基因荧光定量PCR检测
1.标准曲线的建立
1.1将阳性对照质粒pBlue-hlyB-I(按照《精编分子生物学实验指南》的流程制备的常规重组质粒)用为模板进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成I：1.0×1010拷贝/μL；II：1.0×109拷贝/μL；III：1.0×108拷贝/μL；Ⅳ：1.0×107拷贝/μL；V：1.0×106拷贝/μL；Ⅵ：1.0x105拷贝/μL；Ⅶ：1.0×104拷贝/μL；Ⅷ：1.0×103拷贝/μL；Ⅸ：1.0×102拷贝/μL；X：1.0×101拷贝lμL；XI：1.0×100拷贝/μL。每个稀释度重复平行试验3次。标准品检测PCR反应体系为：上游引物1μL(5pmol/μL)，下游引物1μL(5pmol/μL)，质粒DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示(图3，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值，1：1.0×1010拷贝/μL；2：1.0×109拷贝/μL；3：1.0×108拷贝/μL；4：1.0×107拷贝/μL；5：1.0×106拷贝/μL；6：1.0x105拷贝/μL；7：1.0×104拷贝/μL；8：1.0×103拷贝/μL；9：1.0×102拷贝/μL；10：1.0×101拷贝lμL；11：1.0×100拷贝/μL。)
1.2标准曲线的绘制
根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线(图3，横坐标为拷贝数的对数，纵坐标为Ct值)，由图3可知，实时荧光定量PCR检测的线性范围是1×108～1×102拷贝/反应体系，标准曲线的相关系数R平方值为1.003(y＝-3.1365x+36.201)，荧光定量PCR反应的扩增效率为99.6％。标准曲线显示：本发明建立的迟缓爱德华氏菌hlyB基因实时荧光定量PCR检测方法有9个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法的具有非常高的灵敏度。
2.实时荧光定量PCR法检测20份鱼类样本
2.1提取鱼取样组织的DNA
采集了10份患病及疑似患病的草鱼样品及10份健康草鱼样品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小块鳃组织块，加入200μL Millipore H2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12，000rpm离心1min，弃上清，加入200μLMillipore H2O重悬。充分混匀后取50μL加入到200μL6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12，000离心3min，取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。剩余的模板于-20℃保存以备复检。
2.2用实施例1，2中建立的方法检测病鱼DNA样本
病鱼检测PCR反应体系为：上游引物1μL(5pmol/μL)，下游引物1μL(5pmol/μL)，质粒DNA 5μL，5U Taq DNA聚合酶的0.6μL，3μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的Takara公司的10×buffer，2uL的10mMdNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μLDEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃10sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图4所示(图4，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值)，结果显示：以确诊的10份迟缓爱德华氏菌感染鱼标本DNA为模板时出现了目的模板时出现了目的荧光扩增曲线，以其余10份样本的DNA为模板时，均无扩增曲线。
实施例4：迟缓爱德华氏菌hlyB基因荧光定量PCR检测试剂盒
迟缓爱德华氏菌hlyB基因荧光定量PCR检测试剂盒包括各自独立包装的迟缓爱德华氏菌反应液1ml/管和Taq聚合酶(5U，每个反应0.6μL)30ul/管，两试剂管再共同组装在一外包装盒中。其中，迟缓爱德华氏菌反应液为含有dNTPs、MgCl2、SYBR green I及引物混合液，由12.5μL的2×buffer(用购自Takara公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)、实施例2确定的hlyB-III组合中1μL上游引物、1μL下游引物和1.9μL的DEPC水按比例混合，配制时将每一组分乘以一个系数(如10000，根据生产量定)，混匀后，分装，每支1mL为方便检测，试剂盒还可以包括另外各自独立包装的强阳性对照品(10-5稀释度的阳性对照品质粒L2)、临界阳性对照品(10-8稀释度的阳性对照品质粒L5)、DNA提取液(配方为：chelex-100)及阴性对照品(无菌水)，并与迟缓爱德华氏菌反应液和Taq聚合酶试剂管共同组装在外包装盒中。PCR反应体系：上游引物1.5μL(5pmol/μL)，下游引物2.5μL(5pmol/μL)，样品DNA5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000XSYBR green I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃l0sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果表明(表5，经过5次重复测定结果比较稳定，确定为本发明试剂盒的阳性对照。
表5阳性对照的测试结果
| 重复 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Ct值 | 22.3 | 22.9 | 22.2 | 23.0 | 22.5 |
实施例5：迟缓爱德华氏菌hlyB基因荧光定量PCR检测试剂盒的性能评估
为对本发明试剂盒的性能进行评估，按照产品优化后的工艺多次配制出产品小样对试剂盒的灵敏度、特异性、精确度、以及稳定性，以及用试生产的产品进行临床试验，以考查产品的性能。
1、试剂盒检测的线性范围和灵敏度测试将迟缓爱德华氏菌hlyB基因人工构建质粒pBlue-hlyB-I用DEPC水稀释液进行10倍系列梯度稀释至10-9，即灵敏度质控品(取L1(10-4稀释度)、L2(10-5稀释度)、L3(10-6稀释度)、L4(10-7稀释度)、L5(10-8稀释度)、L6(10-9稀释度)作为评价试剂盒灵敏度的质控品，编号L1-L6。分装后于-70℃保存备用)，使用本发明试剂盒进行检测。PCR反应体系：上游引物1μL(5pmol/μL)，下游引物2μL(5pmol/μL)，样品DNA5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自Takara公司的的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃l0ec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果(表6)显示，10-9稀释度(L6)样本不能检出，在10-8稀释度(L5)时候试剂盒多数情况下均可检出，所以本发明试剂盒最低可检出含10-8稀释度的迟缓爱德华氏菌hlyB基因人工构建质粒，具有较高的灵敏度。对不同批次的产品小样进行灵敏度及线性分析，结果显示引物均可稳定测出10-8稀释度的DNA样品，对于10-9稀释度样品，本发明试剂盒不能检出。故设10-8稀释度为最低检出值。
表6本发明试剂盒线性范围的测试结果
| 稀释梯度 | 10<sup>-4</sup> | 10<sup>-5</sup> | 10<sup>-6</sup> | 10<sup>-7</sup> | 10<sup>-8</sup> | 10<sup>-9</sup> |
| Ct值 | 19.6 | 22.2 | 26.1 | 29.3 | 32.5 | No Ct |
2、试剂盒检测的特异性分析
采用不同批次的产品小样对5种主要鱼类致病菌(鱼致病菌黄杆菌、河弧菌、荧光假单胞菌、维氏气单胞菌和嗜水气单胞菌)进行检测。PCR反应体系：上游引物1μL(5pmol/μL)，下游引物1μL(5pmol/μL)，样品DNA5μL，样品DNA5μL，5U Taq DNA聚合酶的0.6μL，3μLDEPC水，2×Takara实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×Takara实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的Takara公司TM的10×buffer，2μL的10mMdNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μLDEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：先防污染37℃5min；然后预变性95℃3min；最后扩增95℃l0sec，60℃40sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。结果(表7)N1-N5均未检出Ct值，证明本发明的试剂盒具有良好的特异性。
表7本发明试剂盒特异性的测试结果
| 样品 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 |
| Ct值 | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct | No Ct |
3、试剂盒的准确性测定
采用测序方法进行确认本发明试剂盒的准确性。对扩增产物进行测序，序列与预期结果完全一致，证明本发明试剂盒的检测结果是准确的。
4、试剂盒的稳定性测定
(1)试剂盒的稳定性
产品的稳定性取决于各个组成成份的稳定性。本发明中配制迟缓爱德华氏菌实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照品在实验室使用中，在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最长保存一周仍未见性能下降。
在为临床试验准备的产品运输中，全套产品(包括迟缓爱德华氏菌实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、试剂盒对照品)，在先后经历为期3天的-20℃冷冻、4℃长途运输、-20℃冷冻、复融等一系列往返过程，使用质控品检测，检测结果未见有显著差异。表明本发明试剂盒的各个组份相当稳定。
(2)对照品的稳定性
对照品的稳定性对试验结果的分析判断有很大影响，本试剂盒的对照品主要为了对反应体系进行质量控制。本试剂盒使用了一份强阳性对照、一份临界阳性和一份阴性对照，对其进行冻融检测。实验结果如表9所示，结果表明本发明试剂盒中的对照品也具有良好的稳定性。
表9阳性对照品的冻融试验结果
| 冻融次数 | 阳性对照的CT值 | 临界阳性对照的CT值 | 阴性对照的CT值 |
| 1 | 23.5 | 30.1 | No Ct |
| 2 | 22.8 | 30.6 | No Ct |
| 3 | 21.7 | 30.8 | No Ct |
| 4 | 22.6 | 30.5 | No Ct |
| 5 | 22.3 | 30.7 | No Ct |
| 6 | 21.8 | 30.1 | No Ct |
| 7 | 22.1 | 30.5 | No Ct |
| 8 | 22.4 | 30.3 | No Ct |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.用于迟缓爱德华氏菌的hlyB基因扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物hlyB-III-F 和下游引物hlyB-III-R，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示。
2.一种迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对；所述上游引物hlyB-III-F 和下游引物hlyB-III-R的浓度比是1:1。
3.根据权利要求2所述的迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
1）迟缓爱德华氏菌反应液和Taq聚合酶：迟缓爱德华氏菌反应液包括含有dNTPs、buffer 、MgC12、SYBR green I、DEPC水及权利要求1所述的引物对的混合液；
2）强阳性对照品；
3）临界阳性对照品；
4）DNA提取液；
5）阴性对照品。
4.根据权利要求3所述的迟缓爱德华氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述迟缓爱德华氏菌反应液是由10×buffer，dNTPs、10000×SYBR green I、DEPC水、引物对的混合物配制而成。
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