CN107513563B - 一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明针对鸡白痢沙门氏菌的特异性片段，设计了一种用于特异性扩增鸡白痢沙门氏菌的引物，并建立了一种能够直接从粪便和鸡肉样品中检测鸡白痢沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法，该方法特异性好、灵敏度高、检测时间短，可以快速准确的检测出鸡白痢沙门氏菌，与22种其他常见致病性沙门氏菌血清型和8种常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果均为阴性，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌。本发明的提出为鸡白痢沙门氏菌的检测提供了一种快速、有效的技术手段，且该方法操作简单、对设备的要求低，检测时间短，能够满足大部分家禽养殖厂对鸡白痢沙门氏菌快速检测的需求。

Description

一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的荧光定量PCR试剂盒，还涉及使用所述的试剂盒快速检测鸡白痢沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法，本发明属于生物技术检测领域，
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是主要的食源性致病菌之一，其血清型众多，目前已经确定的血清型有2600多种，但只有某些特定的沙门氏菌血清型会感染人和动物。其中，鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)是严重影响我国禽养殖业发展的宿主特异性病原菌，其传播范围广，致病性强，主要感染21日龄以内的雏鸡，可以引起白色下痢，并且雏鸡感染后死亡率几乎100％；然而成年鸡感染鸡白痢沙门氏菌后通常没有临床症状，但作为病原携带者，不仅可以水平传播，而且可以垂直传播。因此，鸡白痢沙门氏菌是一种传播快、危害大的致病性病原菌。及时准确地检测出鸡白痢沙门氏菌，做出相应的防控措施显得尤为重要。
传统的沙门氏菌血清学检测仍然是通过细菌与特异性抗体的凝集反应鉴别其O抗原和H抗原，根据White-Kauffmann-Le Minor抗原表确定沙门氏菌的血清型。但该方法对某些血清型的鉴别容易混淆，甚至无法鉴别，如鸡白痢、鸡伤寒和肠炎三种沙门氏菌血清型的抗原结构相似，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌没有运动性，H抗原检测结果为阴性，肠炎沙门氏菌H抗原容易发生变异，必须通过常规的生化鉴定才可以进一步确定这三种沙门氏菌血清型，这种常规的检测方法需要5至7天的时间，过程繁琐，耗时耗力。PCR作为病原检测的一种方法表现出巨大的潜力，它在检测病原菌时具有快速、灵敏、特异等优点。在我国，鸡白痢已经是我国家禽最主要的细菌病之一，并且被国家列为规定净化的细菌病，对鸡白痢沙门氏菌进行快速、准确的检测是净化和防治鸡白痢的关键。
张童利等[，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]公开了一组用于检测鸡白痢沙门氏菌的引物(SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG 3’；SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC 3’)，并建立了检测一种鸡白痢沙门氏菌的方法，实验证明该方法对于两株鸡白痢沙门氏菌均可以特异性地扩增出356bp的目的片段，但对于7株常见非沙门氏菌致病菌和29株其他常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性。但在后续实际应用中发现，使用该文献所建立的方法不能够有效区别大肠杆菌，极大影响了检测结果的准确性。
为此，急需建立一种能够快速准确的检测出鸡白痢沙门氏菌，并且区别其他常见致病性沙门氏菌血清型和常见非沙门氏菌致病菌，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌的PCR检测方法。
发明内容
针对鸡白痢沙门氏菌在检测过程中容易出现的问题，本发明的目的在于提供一种快速地、特异性地检测鸡白痢沙门氏菌的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，该方法不仅能够区别其他常见致病性沙门氏菌血清型和常见非沙门氏菌致病菌，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌。
为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：
本发明的一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂盒，包括用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物以及SYBR Green I荧光定量PCR扩增缓冲液，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明所述的试剂盒中，优选的，还包括阳性对照以及阴性对照。
其中，优选的，所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQID NO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。
使用本发明所述的试剂盒检测鸡白痢沙门氏菌时，包括以下步骤：
步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用所述的试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增；
步骤二，根据扩增曲线判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌，所述判断具体为：Ct值≤35且熔解温度为79.5℃，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；Ct值在35～40之间但熔解温度不是79.5℃，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。
其中，优选的，还包括在提取待检样品基因组DNA之前，使用增菌液对样本进行增菌培养的步骤，所述增菌液为亚硒酸盐胱氨酸增菌液或RV沙门氏菌增菌液体培养基。
其中，优选的，采用高温裂解法提取待检样品基因组DNA。
其中，优选的，步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL；所述PCR扩增所采用的扩增程序为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火59℃，30s，延伸72℃，15s，40个循环。
进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。
其中，优选的，所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌与其他致病性沙门氏菌血清型以及大肠埃希氏菌。
其中，优选的，所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。
与现有检测技术相比较，本发明的有益效果在于：
采用本发明的检测方法相比于其他检测方法具有明显优势。例如常规的细菌分离鉴定费时费力；平板凝集实验虽然快速简便，但容易出现假阳性，导致误淘，引起不必要的经济损失；免疫荧光、酶联免疫吸附等免疫学检测方法虽然比较准确，但由于这些方法的抗体制备困难，也不易于推广。但本发明建立的鸡白痢沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，并且可以很好的区分大肠埃希氏菌，能够有效防止对鸡只的误淘汰；而且该方法操作简单、快速，在普通的分子实验室均可以进行，整个检测过程只需一天就可以完成，在我国提倡净化养殖场鸡白痢沙门氏菌的背景下，本发明具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2中增菌液直接作为模板的PCR结果；
其中，M：DL2000DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照
图2为本发明施例2中按照(2)方法制备模板的PCR结果；
其中，M：DL2000DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照
图3为本发明施例2中按照(3)方法制备模板的PCR结果；
其中，M：DL2000DNA Marker；1：NB增菌液；2：LB增菌液；3：SC增菌液；4：RV增菌液；5：TTB增菌液；6：阴性对照；
图4和图5分别为不同浓度质粒标准品模板的荧光定量PCR扩增曲线与标准曲线；
其中图4中，1：1.8×109copies/μL；2：1.8×108copies/μL；3：1.8×107copies/μL；4：1.8×106copies/μL；5：1.8×105copies/μL；6：1.8×104copies/μL；7：1.8×103copies/μL；8：1.8×102copies/μL；9：阴性对照；
图6为44个菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增曲线；
图7为44个菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增的熔解曲线；
图8和图9分别为不同浓度基因组DNA模板的荧光定量PCR的扩增曲线结果和熔解曲线；
其中图8中，1：340ng/μL；2：34ng/μL；3：3.4ng/μL；4：340pg/μL；5：34pg/μL；6：3.4pg/μL；7：340fg/μL；8：34fg/μL；9：3.4fg/μL；10：阴性对照；
图10为采用文献的方法(a)以及本发明的引物(b)检测的特异性结果。
其中，图中的数字对应于表1中的菌株编号。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：引物设计
对GenBank中鸡白痢、鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型全基因组进行全面的生物信息学分析，最终确定SEEP17695基因(SEQ ID NO.1所示)为鸡白痢沙门氏菌的检测靶基因。
根据SEEP17695基因，使用Oligo 6软件设计特异性引物，引物由苏州金唯智公司合成。引物序列如下：
SEEP17695-idF10：5’TCTAGCACTGAACTTGGCGA 3’(SEQ ID NO.2所示)；
SEEP17695-idR10：5’TGTGTCGCCATTGTAGGTCA 3’(SEQ ID NO.3所示)。
实施例2：鸡白痢沙门氏菌PCR检测方法的建立
1、实验用菌株与试剂
实验菌株见表1，其中13株分离株为哈尔滨兽医研究所动物细菌病实验室分离鉴定。
Premix Ex Taq DNA聚合酶和Marker DL2000购自TaKaRa公司。
表1实验菌株
Figure BDA0001392372930000051
Figure BDA0001392372930000061
注：①：中国兽医微生物菌种保藏管理中心；②：中国医学细菌保藏管理中心；③：中国工业微生物菌种保藏管理中心；④：美国典型培养物保藏中心；⑤：天根生化科技(北京)有限公司；⑥：本室保存。
2、方法
2.1最适增菌液及模板制备方法的选择
以五种不同的增菌液对鸡白痢沙门氏菌进行扩增培养，并使用三种不同的处理方法制备模板，使用引物组SEEP17695-idF10和SEEP17695-idR10对模板进行PCR扩增，扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。
2.1.1增菌液的选择
在检测样品时，为了提高检测效率和排除休眠菌的影响，通常需要进行预增菌，再进行后续检测。增菌液的确定需要考虑其对目的菌的选择性，同时需要兼顾其增菌效率以及对后续检测的影响。采用3种选择性增菌液：亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、RV沙门氏菌增菌液体培养基、四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)和2种普通增菌液：营养肉汤(NB)、LB Miller肉汤，分别对鸡白痢沙门氏菌标准株527进行6小时增菌培养。
2.1.2模板制备
将一定量的鸡白痢沙门氏菌接种到增菌液中，于37℃的恒温振荡器中振荡培养，取生长对数期的增菌液培养物分别以下述三种方法处理后作为PCR反应的模板。
(1)以增菌液培养物作为模板直接进行PCR扩增。
(2)取增菌液培养物1mL置于1.5mL Eppendorf离心管中，1500rpm离心3min，吸出上清加入另一洁净的1.5mL Eppendorf离心管中，10000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，以此作为PCR反应的模板。
(3)高温裂解法提取基因组：取增菌液1mL置于1.5mL Eppendorf离心管中，1500rpm离心3min，吸出上清加入另一洁净的1.5mL Eppendorf离心管中，10000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，于沸水浴中加热10min，立即放入冰中，待其冷却后取出，10000rpm离心10min，取上清作为PCR反应模板。使用超微量紫外分光光度计测定核酸纯度，吸光值A260/A280的比值均在1.8至2.0之间，表明提取的基因组质量好。
2.2荧光定量PCR扩增方法的建立
2.2.1荧光定量PCR标准品的制备
以鸡白痢沙门氏菌527的基因组作为模板，以引物组SEEP17695-idF10/idR10对其进行PCR扩增。总反应体系包括PrimeSTAR Max Premix(2×)25μL，上下游引物(10μM)各1μL，模板DNA 1μL，ddH2O补足50μL。将反应体系各组分加入PCR反应管中，使用涡旋仪振荡使其充分混匀，低速离心数秒，PCR反应管放入PCR反应仪中，按照以下PCR循环参数进行：在95℃预变性5min，接着作30个循环，每个循环的程序包括95℃变性30s，退火温度59℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸7min，最后降温至4℃，结束所有操作程序。将扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化后，与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α内。提取过夜重组菌液的重组质粒，送哈尔滨新海基因生物有限公司进行测序，测序结果显示，该片段与GenBank中SEEP9120_017695基因中相应位置的序列完全相同。阳性质粒用做质粒标准品。
由图1、图2和图3结果结合比较显示，含有鸡白痢沙门氏菌的NB、LB、SC和RV四种增菌液培养物采用三种模板制备方法均可以扩增出219bp目的条带，但明显高温裂解法制备的模板扩增的条带比较亮。直接以TTB增菌液培养物为模板没有扩增到目的条带，经过(2)或(3)处理后扩增得到目的条带，且(2)处理后结果条带亮度很暗，只有(3)的高温裂解法制备的模板对PCR反应无影响。由以上结果结合实际检测中对选择性增菌液的需求，本发明确定以SC或RV增菌液作为检测过程中的样品增菌液，以高温裂解法作为模板制备方法。
2.2.2荧光定量PCR标准曲线的制备
使用超微量紫外分光光度计测定质粒标准品的浓度为58ng/μL，再根据其浓度计算出标准品的拷贝数为1.8×109copies/μL。拷贝数计算公式为：拷贝数(copies/μL)＝浓度(ng/μL)×NA×10-9/(660×碱基数)，其中NA为阿佛加德罗常数(6.02×1023)。
使用去离子水将制备好的标准品质粒进行10倍梯度稀释，稀释到10-9倍，以各个稀释梯度的稀释液作为模板进行SYBR Real-tinePCR反应，反应体系为25μL体积，体系内各组分加入量见表2。各组分加入荧光定量八联管中，充分混匀，放入实时荧光定量PCR仪(耶拿公司qTower 2.2型)中，开始程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火59℃，30s，延伸72℃，15s，40个循环。
表2荧光定量PCR反应体系
组分 加入体积(μL)
SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 12.5
SEEP17695-idF10(10μM) 0.5
SEEP17695-idF10(10μM) 0.5
DNA 1
ddH<sub>2</sub>O 10.5
图4和图5显示了不同浓度质粒标准品模板的荧光定量PCR扩增曲线与标准曲线，阳性标准品拷贝数浓度处在1.8×109copies/μL至1.8×102copies/μL之间时所得到标准曲线呈现良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9981，PCR的扩增效率为0.94，阳性标准品的扩增CT值与其拷贝数关系式为：CT＝39.67-3.48×(copies number)。
2.2.3荧光定量PCR特异性评价
取表1中所有菌株，用亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)培养后，用高温裂解法提取基因组DNA，测定各菌株基因组的浓度与纯度，确定其纯度良好，并稀释各基因组浓度使所有菌株的基因组浓度相同，以这些基因组为模板进行SYBR实时荧光定量PCR反应，反应体系和程序均参照2.2.1节中的反应条件。
高温裂解法提取基因组：取菌液1mL置于1.5mL Eppendorf离心管中，1500rpm离心3min，吸出上清加入另一洁净的1.5mL Eppendorf离心管中，10000rpm离心10min后弃掉上清，加入200μL去离子水将菌体重悬，于沸水浴中加热10min，立即放入冰中，待其冷却后取出，10000rpm离心10min，取上清作为PCR反应模板。
图6显示了44个菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增曲线，结果显示，只有两株鸡白痢沙门氏菌527和528在17个循环左右时起峰，并有明显的S型扩增曲线，其他42种菌株及阴性对照在接近40循环时开始有轻微起峰。
图7显示了44个菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增的熔解曲线，结果显示，两株鸡白痢沙门氏菌的熔解曲线呈现特征性的单一熔解峰，熔解温度约为79.5℃，而其他42个菌株没有明显的熔解峰，熔解曲线接近于与阴性对照的背景噪声。以上结果表明本发明的荧光定量PCR方法在检测鸡白痢沙门氏菌时的特异性良好。
2.2.4荧光定量PCR灵敏度评价
用高温裂解法提取高质量的鸡白痢沙门氏菌527的基因组，使用超微量紫外分光光度计测定其核酸浓度为340ng/μL，使用去离子水对其进行10倍梯度稀释至10-8倍，以此为模板按照步骤二中的体系和程序进行荧光定量PCR反应。
图8和图9显示了不同浓度基因组DNA模板的荧光定量PCR的扩增曲线结果和熔解曲线，结果显示，340ng/μL至3.4pg/μL之间6个浓度的扩增曲线均在35循环以内(Ct≤35)起峰，且S型明显；但更低浓度的扩增曲线和阴性对照在36至40循环内有轻微起峰，无法确定其准确性，结合熔解曲线结果，340fg/μL和34fg/μL两个浓度对应的熔解温度与340ng/μL至3.4pg/μL 6个浓度的熔解温度相同，但3.4fg/μL对应的熔解温度与其他浓度的熔解温度不同，而与阴性对照的熔解温度相同，表明扩增曲线结果中，3.4fg/μL与阴性对照对应的扩增曲线不代表目的基因的有效扩增。综上分析表明本发明的荧光定量PCR方法检测鸡白痢沙门氏菌的灵敏度为34fg/μL。
实施例3：人工污染样品检测
人工污染鸡粪便和鸡肉样品，使用实施例2建立的荧光定量PCR方法检测鸡白痢沙门氏菌，同时使用常规的细菌分离鉴定方法检测，对本研究建立的方法进行评价。
1、人工污染鸡粪便样品的检测
荧光定量PCR方法：无菌采集SPF级别饲养环境下的SPF鸡的粪便，取10g粪便加入90mL SC增菌液中，过夜培养。用无菌水10倍倍比稀释鸡白痢沙门氏菌过夜培养物，将适当稀释度的菌液分别接种于鸡粪混合液(10g粪便+90mL SC增菌液)中，使接种量分别为0cfu、1～10cfu、10～102cfu、102～103cfu。进行三个平行实验。将接菌的鸡粪混合液置于恒温振荡器中180rpm，37℃振荡培养6h，各浓度增菌液分别取出1mL，使用高温裂解法提基因组，以这些基因组为模板，无菌去离子水为阴性对照，用实施例2的2.2.1节中的反应体系和程序对上述模板进行荧光定量PCR反应。人工污染增菌后同时使用下述细菌分离鉴定方法进行检测。实验进行三次重复。
细菌分离鉴定方法：参考国标方法(GB/T4789.4-2003，GB/T-2002)13091或国际方法(BS EN12824-1998，ISO6785-2001)的原理，结合鸡白痢沙门氏菌生化反应特点，以下述方法分离鉴定鸡白痢沙门氏菌：
(1)取样品10g或10mL加入90mL的SC增菌液中(若样品为固体应该进行研磨后增菌)，使用恒温振荡器在37℃温度下，180rpm振荡培养16h～24h；
(2)取增菌液，使用接菌环在沙门氏菌筛选显色培养平板上四区划线，置于37℃恒温培养箱中，16h～24h后观察平板，若菌落过小可适当增加培养时间；
(3)挑取紫红色疑似沙门氏菌的单菌落，置于5mL体积的LB肉汤中增菌培养，使用恒温振荡器在37℃温度下，180rpm振荡培养16h～24h；
(4)使用接菌环蘸取一环菌液，在LB琼脂平板上四区划线，置于37℃恒温培养箱中培养16h～24h，当菌落大小适宜时取出进行后续试验；
(5)使用Salmonella Diagnostic Antisera Kit-60Vials(94820)血清学鉴定试剂盒检测细菌的O抗原，同时挑取单菌落进行穿刺试验：使用接种针挑取单菌落，在含0.5％琼脂的LB琼脂平板上进行穿刺，放于37℃恒温培养箱中培养16h～24h；
(6)取出穿刺试验的平板，使用Salmonella Diagnos tic Anti sera Kit-60Vials(94820)血清学鉴定试剂盒检测细菌的H抗原，结合(5)中检测出的O抗原，确定待检测菌的血清学抗原式，进而根据White-Kauffmann-Le Minor抗原表确定待检细菌的血清型。
(7)若待检菌的培养物与O9、O12因子血清呈阳性反应，且与所有H多价因子血清全呈阴性反应，则判定该菌为鸡白痢沙门氏菌或鸡伤寒沙门氏菌；
(8)使用细菌微量生化反应管，检测纯菌培养物对于卫矛醇、鸟氨酸和麦芽糖的三种生化反应结果判定。
表3显示了人工污染鸡粪便样品的荧光定量PCR检测结果，当鸡白痢沙门氏菌的初始污染量低至2cfu/10g鸡粪时，可以被本发明建立的方法全部检出。荧光定量PCR方法检测阳性率为24/27(88.9％)，细菌分离鉴定方法检测阳性率为24/27(88.9％)，荧光定量PCR方法与细菌分离鉴定方法检测的符合率为36/36(100％)。
表3人工污染鸡粪便样品的荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0001392372930000111
2、人工污染鸡肉样品的检测
无菌条件下解剖SPF鸡，取鸡胸肉10g，使用组织研磨器将鸡肉组织磨碎加入90mLSC增菌液中，过夜培养。用无菌水10倍倍比稀释鸡白痢沙门氏菌过夜培养物，将适当稀释度的菌液分别接种于鸡肉混合液(10g鸡胸肉+90mL SC增菌液)中，使接种量分别为0cfu、1～10cfu、10～102cfu、102～103cfu。进行三个平行实验。将接菌的鸡肉混合液置于恒温振荡器中180rpm，37℃振荡培养6h，各浓度增菌液分别取出1mL，使用高温裂解法提基因组，以这些基因组为模板，无菌去离子水为阴性对照，用实施例2的2.2.1节中的反应体系和程序对上述模板进行荧光定量PCR反应。人工污染增菌后同时使用下述细菌分离鉴定方法进行检测。实验进行三次重复。
表4显示了人工污染鸡肉样品的荧光定量PCR检测结果，当鸡白痢沙门氏菌的初始污染量低至2cfu/10g鸡肉时，可以被本发明建立的方法全部检出。荧光定量PCR方法检测阳性率为24/27(88.9％)，细菌分离鉴定方法检测阳性率为24/27
(88.9％)，Real-time PCR方法与细菌分离鉴定方法检测的符合率为36/36(100％)。
表4人工污染鸡肉样品的荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0001392372930000121
对比实验例1
同时使用本发明引物以及文献[张童利，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]所列的引物(SEEP17495-idF：5’CGATAATGGCAACCGCACTG3’；SEEP17495-idR：5’TGATGTCTGCCCCTTTCGAC 3’)和PCR反应参数对表1中的22个菌株的基因组进行PCR扩增，其中两株鸡白痢沙门氏菌527和528作为阳性对照。
采用本发明的引物进行PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×Premix Ex Taq 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL；扩增程序为：先95℃预变性10min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，循环共35个；循环结束后，72℃延伸7min，降温至10℃，结束。
图10显示了采用以上两种方法检测22个菌株的检测结果，从该结果可以看出本发明设计的引物对鸡白痢沙门氏菌可以扩增出特异性目的条带，但对9株常见致病性沙门氏菌血清型的扩增结果均为阴性；对其他11株常见非沙门氏菌致病菌的扩增结果也为阴性；而文献[张童利，王曼宇，曹俊，王忠星，刘思国*，于申业*.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立.中国预防兽医学报，39(3):215-219，2017]所列的引物用于扩增大肠杆菌DH5α(34号)时出现非特异性条带，说明本发明设计的引物相较于文献中公开的引物在扩增鸡白痢沙门氏菌时具有更好的特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
<120> 一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR试剂盒及其应用
<130> klpi170787
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1047
<212> DNA
<213> S. pullorum
<400> 1
gtgtttatta ataactatat ccaacaaaac ttctggatat cgtacttact tattataata 60
tatttaatat atatatacct tgaattatac ctatgcgtat caaaaaaagg ctttgacatg 120
gatgaaagac cattaacaag tcaatattta tttaaacaat cacttagaat acctgtattc 180
tcagcgatat actttggtat attttcttgg cttggacatt cacctcaatt tgatagtgat 240
ggctttaata attttattgc aattagcaaa ctccccatcg ccttgctttc tttgtccata 300
ccatttgttg ctgtcgtagc aaacatacac cgtacagttc agacaaaccg acagattgag 360
gaaacaaagc aaaagaacct atctgatagc cactatagcc atctaaagtt cgtcactgat 420
tatttcacca atttacctag taaaatcgtt aaacgcgatc gttattataa cactaaagag 480
gtgtgttata agattaacta cccaatacat ctatatagat acattttcaa acatagttcg 540
ccagagaatg gccgacctaa aaacacagat aaagaataca tacaggaagt aaataatcac 600
tggattggaa tattaaaaaa cctagagaag ataaattccc ctaatcgtgg ttctcaactt 660
cacgaagttt taatccgtca aatgcaatat cttcattcaa ttgaaaaaca tttatcaaaa 720
cttaatcgaa tgctttgcct aactccgata gagttaaatg aacatgcaac tttacactct 780
aagggatatg aaattaccac taatttcatg tctagcactg aacttggcga tactattgaa 840
acttatttta aatttaccat tgatattctt gacattaccg ataatttcct ttcattcaag 900
gatgatggca tgtccgggca aattattata cttgcaagat tactaaaaga taataatcca 960
gctatttttc atgagattat aacaaataaa gggaaggctg acccttcgct gacctacaat 1020
ggcgacacat tggcggcaga gcattaa 1047
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
tctagcactg aacttggcga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
tgtgtcgcca ttgtaggtca 20

Claims (10)

1.一种用于检测鸡白痢沙门氏菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物以及SYBR Green I荧光定量PCR扩增缓冲液，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDN O.2所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还包括阳性对照以及阴性对照。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照为鸡白痢沙门氏菌菌株的基因组DNA或是含有SEQ ID NO.1所示序列的载体；所述的阴性对照为无菌水。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于用于检测鸡白痢沙门氏菌时包括以下步骤：
步骤一，提取待检样品基因组DNA，使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增；
步骤二，根据扩增曲线判断样品是否含有鸡白痢沙门氏菌，所述判断具体为：Ct值≤35且熔解温度为79.5℃，则说明样品中含有鸡白痢沙门氏菌；Ct值在35～40之间但熔解温度不是79.5℃，则样品中不含有鸡白痢沙门氏菌。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括在提取待检样品基因组DNA之前，使用增菌液对样本进行增菌培养的步骤，所述增菌液为亚硒酸盐胱氨酸增菌液或RV沙门氏菌增菌液体培养基。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，采用高温裂解法提取待检样品基因组DNA。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于步骤一中所述PCR扩增所采用的检测体系为25μL反应体系包括：2×SYBR Premix Ex Taq II 12.5μL，10μM的上下游引物各0.5μL，模板溶液1μL，最后灭菌去离子水补足至25μL；所述PCR扩增所采用的扩增程序为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s，退火59℃，30s，延伸72℃，15s，40个循环。
8.权利要求1-7所述的试剂盒在制备检测鸡白痢沙门氏菌试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的试剂用于区别鸡白痢沙门氏菌与其他致病性沙门氏菌血清型以及大肠埃希氏菌。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的其他致病性沙门氏菌血清型包括鸡伤寒和肠炎沙门氏菌血清型。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834500A (zh) * 2017-03-03 2017-06-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用
KR101863458B1 (ko) * 2016-12-07 2018-06-01 대한민국 (관리부서 : 환경부 국립환경과학원장) 리얼타임 pcr을 이용한 살모넬라 감염증 원인균 검사 키트 및 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101863458B1 (ko) * 2016-12-07 2018-06-01 대한민국 (관리부서 : 환경부 국립환경과학원장) 리얼타임 pcr을 이용한 살모넬라 감염증 원인균 검사 키트 및 방법
CN106834500A (zh) * 2017-03-03 2017-06-13 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 用于检测鸡白痢沙门氏菌的特异性引物、含有该引物的试剂盒及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a multiplex qPCR in real time for quantification and differential diagnosis of Salmonella Gallinarum and Salmonella Pullorum;Marcela da Silva Rubio等;《Avian Pathology》;20170717;第46卷(第6期);表1、图1、第645页左栏第4段和右栏第2、4段 *
Marcela da Silva Rubio等.Development of a multiplex qPCR in real time for quantification and differential diagnosis of Salmonella Gallinarum and Salmonella Pullorum.《Avian Pathology》.2017,第46卷(第6期), *
鸡粪中沙门氏菌和大肠杆菌O78多重PCR检测方法的建立;胡茂秀等;《中国预防兽医学报》;20160131;第38卷(第1期);第59页第1.3节和摘要 *

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