CN110878365A - 多重pcr检测鱼类结节病病原菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PCR检测鱼类结节病病原菌的方法，包括：提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA；对病原菌的基因组DNA进行引物设计；利用设计的引物和PCR方法同时对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA进行扩增和检测。本发明的方法能够同时检测多种结节病病原菌，且特异性和灵敏度高。

Description

多重PCR检测鱼类结节病病原菌的方法
技术领域
本发明涉及基因检测领域，更具体地，涉及多重PCR检测鱼类结节病病原菌的方法。
背景技术
鱼类结节病是水产养殖中的常见多发疾病，以内脏出现白色结节为主要症状，组织病理诊断为肉芽肿。该病病程长，传染速度快，死亡率高达100％，夏秋季节为发病高峰期，水温在25～27℃时易发病。主要危害乌鳢(Ophiocephalus argus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、鲈(Lateolabrax japonicus)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)等20多种经济鱼类。该病在我国内地以及东南沿海地区经常暴发，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
流行病学调查显示，虽然都会出现肉芽肿的类似临床症状，但结节病的病原呈现多样化，即异菌同症。据报道，越冬罗非鱼会流行一种病因不明的爆发性疾病，常引起大批死亡，临床表现为缺氧状，濒死鱼眼球突出或混浊发白，腹部膨胀,鳃丝水肿。解剖观察,腹腔有腹水,脾、肝、肾肿大,有白色结节状病灶，实验鉴定其病原为嗜水气单胞菌。随后，研究人员相继从患结节病的卵形鲳鲹、革胡子鲶和加州鲈中相继分离出鰤鱼诺卡氏菌，其症状也都表现为肝脏、脾脏、肾脏和鳃发生不同程度的慢性炎性肉芽肿病变。近年来，研究人员又先后从患内脏结节病的卵形鲳鲹、五条鰤和条石鲷中分离出美人鱼发光杆菌杀鱼亚种。此外，舒氏气单胞菌，星状诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌也可能会导致鱼类发生结节病。
由于结节病从发生到死亡的延续时间长且早期体表无明显的症状,给预防和治疗带来较大的困难，研究早期快速检测技术就显得尤为重要和迫切。目前针对某个结节病病原菌的检测已有一些研究，然而由于结节病病原较多，现有的检测方法成本较高且通量小，本项目拟通过多重PCR检测方法，在同一反应管中实现对六种结节病病原菌的同时检测，以便在发病早期即可确定是哪种病原菌导致的结节病，从而制定有针对性的防控策略，减少养殖过程的损失。
病原菌的检测经历了从传统培养法、免疫学检测方法和分子生物学检测的发展历程。但是目前的检测方法尚不能完全令人满意，仍存在改进空间。
发明内容
为弥补现有技术的不足，解决现有技术中病原菌检测周期长、一次性检测种类少的问题，本发明提供了一种同时检测六种鱼类结节病病原菌的引物组和方法。可以同时检测嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌。针对以上病原菌的特性，设计了六对特异性引物，利用普通的PCR仪即可完成检测。通过琼脂糖电泳即可判断是哪种病原菌导致鱼体产生了结节病。整个过程操作简单，特异性强，检测成本低。
本发明提供了一种PCR检测鱼类结节病病原菌的方法，包括：
提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA；
对病原菌的基因组DNA进行引物设计，引物如下：
嗜水气单胞菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.1所示，
嗜水气单胞菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.2所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.3所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.4所示，
星状诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.5所示，
星状诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.6所示，
舒氏气单胞菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.7所示，
舒氏气单胞菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.8所示，
鰤鱼诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.9所示，
鰤鱼诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.10所示，
杀鲑诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.11所示，
杀鲑诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.12所示；
利用上述引物和PCR方法同时对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA进行扩增和检测。
在上述方法中，其中，上述引物分别以嗜水气单胞菌的hlyA、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16S rRNA、星状诺卡氏菌的16S-23S rRNA、舒氏气单胞菌的gyrB、鰤鱼诺卡氏菌的16S-23S rRNA、杀鲑诺卡氏菌的16S-23S rRNA为靶基因而设计。
在上述方法中，其中，所述PCR方法的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 25μL，
10μmol/L嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L舒氏气单胞菌上下游引物0.5μL,
10μmol/L鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
质粒模板0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL。
在上述方法中，其中，所述PCR方法的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1.同时快速鉴定多个结节病病原菌
本发明建立的多重PCR方法可以同时检测嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌六种结节病病原菌，相对于现有技术所建立的方法，增加了检测的通量，只需一步实验即可确定是哪种病原菌引起的结节病，有利于及时制定有针对性的防控策略，同时具有节省人力成本和时间成本的优势。
2.特异性和灵敏度高
本发明的多重PCR检测引物组具备高度特异性，所有引物都经过primer Blast比对分析，都具有高度的保守性和特异性；同时能够在混合模板或模拟样品中，仅目的片段产生扩增，证明该检测方法具有高度的特异性。本发明所建立的检测方法能够实现六种病原菌的同时检测，最低检出限可达100pg/μL，为养殖的临床检测中对上述6种结节病病原菌的检测提供一种准确快速、经济有效的手段，对结节病的早期防控具有重要意义。
附图说明
图1为引物的特异性分析电泳图，模板为6种病原菌的基因组DNA:M：Marker2000bp；N：阴性对照，模板为无菌双蒸水；1:嗜水气单胞菌；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌；5：鰤鱼诺卡氏菌；6：杀鲑诺卡氏菌。
图2为多重PCR检测6种结节病病原菌的电泳图：1:嗜水气单胞菌；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌；5：鰤鱼诺卡氏菌；6：杀鲑诺卡氏菌；7:2×rTaq PCR Mix扩增的6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，星状诺卡氏菌，舒氏气单胞菌，鰤鱼诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌)；8:2×Ex Taq PCRMix扩增的6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，星状诺卡氏菌，舒氏气单胞菌，鰤鱼诺卡氏菌，杀鲑诺卡氏菌)；M:Marker 2000bp。
图3为混合质粒模板的多重PCR灵敏度电泳图：M：Marker 2000bp；1:1000ng/μL；2:100ng/μL；3:10ng/μL；4:1ng/μL；5:100pg/μL；6:10pg/μL；7:1pg/μL；8:100fg/μL；9:10fg/μL。
图4为模拟样品的检测电泳图：1:杀鲑诺卡氏菌；2:美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和鰤鱼诺卡氏菌；3:舒氏气单胞菌；4:星状诺卡氏菌；5:嗜水气单胞菌；M:Marker 2000bp。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明提供了一种同时检测六种结节病病原菌的多重PCR检测用的引物组和方法，具体方案如下：
提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA。
引物的设计与筛选，所述引物如下：
嗜水气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.1所示，
嗜水气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.2所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.3所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.4所示，
星状诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示，
星状诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.6所示，
舒氏气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.7所示，
舒氏气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.8所示，
鰤鱼诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.9所示，
鰤鱼诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.10所示，
杀鲑诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.11所示，
杀鲑诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.12所示。
所述引物为分别以嗜水气单胞菌的hlyA，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16S rRNA，星状诺卡氏菌的16S-23S rRNA，舒氏气单胞菌的gyrB，鰤鱼诺卡氏菌的16S-23S rRNA，杀鲑诺卡氏菌的16S-23S rRNA为靶基因而设计的6对引物。
利用上述引物扩增嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的全基因组DNA，将PCR产物进行胶回收，连接T载体后，转化至DH5α感受态细胞，挑取单克隆送至上海生工测序，将测序正确的菌液扩大培养，利用OMEGA质粒提取试剂盒提取相应的重组质粒。
建立一种多重PCR的检测方法，分别以上述重组质粒作为模板，利用所设计的引物进行多重PCR扩增，并对反应条件进行优化，得到最佳反应条件。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中所述的引物筛选方法为：利用所设计的引物进行扩增，筛选最佳引物组合如下。
嗜水气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.1所示，
嗜水气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.2所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.3所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.4所示，
星状诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.5所示，
星状诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.6所示，
舒氏气单胞菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.7所示，
舒氏气单胞菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.8所示，
鰤鱼诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.9所示，
鰤鱼诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.10所示，
杀鲑诺卡氏菌上游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.11所示，
杀鲑诺卡氏菌下游引物，其核苷酸序列如SED ID NO.12所示。
多重PCR的反应体系如下：2×Taq PCR Mix 25μL，10μmol/L嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μL，10μmol/L星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L舒氏气单胞菌上下游引物0.5μL,10μmol/L鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，质粒模板0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
多重PCR检测结节病病原菌的引物组，包括嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌上下游引物共6对引物对，分别是序列表SED ID NO.1和2、SED ID NO.3和4、SED ID NO.5和6、SED ID NO.7和8、SEDID NO.9和10、SED ID NO.11和12的碱基序列；所述6对引物对分别扩增嗜水气单胞菌的hlyA，美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16S rRNA，星状诺卡氏菌的16S-23S rRNA，舒氏气单胞菌的gyrB，鰤鱼诺卡氏菌的16S-23S rRNA，杀鲑诺卡氏菌的16S-23S rRNA；所述6对引物对的浓度比为1:1:1:1:1:1。
多重PCR检测结节病病原菌的方法，其采用6对引物对目标基因的重组质粒进行扩增，电泳检测扩增的目的条带大小分别为：1409bp,988bp,520bp,350bp,250bp,150bp。
根据多重PCR检测结节病病原菌中的六种病原菌的方法，所述PCR扩增的反应体系为：包括：2×rTaq PCR Mix或2×Ex Taq PCR Mix 25μL，10μmol/L嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μL，10μmol/L星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L舒氏气单胞菌上下游引物0.5μL,10μmol/L鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL；
扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
一、材料与方法
1.材料
1.1样本
嗜水气单胞菌、星状诺卡氏菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种，舒氏气单胞菌购自广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)。
1.2试剂
细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根公司，PCR mix，Marker 2000，pMD18-T载体购自TaKaRa公司，胶回收试剂盒购自Thermo公司，DH5α感受态细胞购自北京全式金，质粒提取试剂盒购自OMEGA公司，引物由上海生工生物合成。
2.方法
2.1引物设计
从GenBank上下载六种结节病病原菌的多条基因序列进行比对，设计引物，引物序列见序列表。
2.2单一引物的特异性实验
1)DNA提取：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的DNA，然后置于-20℃保存；
2)PCR反应：取上述DNA样品，进行PCR反应。其中PCR反应的体系为：2×Taq PCRMix 25μL，10μmol/L的上下游引物均为1μL，模板0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL；
3)PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min；
4)电泳检测：取5μL PCR产物，利用1％琼脂糖凝胶中进行电泳，条件为200mA、120V，电泳时间为25min，电泳完成后，放入凝胶成像系统中进行拍照；
5)检测结果分析：将电泳带与阴性对照进行对比，判定被检样品中是否含有嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌；如果检测样品在1409bp,988bp,520bp,350bp,250bp,150bp出现相应的条带，则判为阳性，否则为阴性。
实验结果参见图1，其中M：Marker 2000bp；N：阴性对照，模板为无菌双蒸水；1:嗜水气单胞菌阳性；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种阳性；3：星状诺卡氏菌阳性；4：舒氏气单胞菌阳性；5：鰤鱼诺卡氏菌阳性；6：杀鲑诺卡氏菌阳性。
结果表明，引物特异性良好，在混合模板下，只有相应的靶基因产生扩增。
2.3多重PCR方法的建立
与2.2不同之处在于：PCR反应的模板还包括6种含有结节病病原菌靶基因的重组质粒混合物。
PCR反应：取上述质粒DNA1:1混合，进行PCR反应。其中PCR反应的体系为：包括：2×rTaq PCR Mix或2×Ex Taq PCR Mix 25μL，10μmol/L嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，10μmol/L美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μL，10μmol/L舒氏气单胞菌上下游引物0.5μL，质粒模板0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL；
1)扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
2)实验结果参见图2，其中1:嗜水气单胞菌阳性；2：美人鱼发光杆菌杀鱼亚种阳性；3：星状诺卡氏菌；4：舒氏气单胞菌阳性；5：鰤鱼诺卡氏菌阳性；6：杀鲑诺卡氏菌阳性；7：6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌)；8：6种结节病病原菌(从上到下依次为嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌)；M:Marker 2000bp。
结果表明，所用引物不仅特异性良好，而且相互之间无交叉反应。此外，利用2×ExTaq PCR Mix的扩增效果更好。
2.4灵敏度分析
将含有靶基因的重组质粒稀释至1000ng/μL,然后1:1混匀后，将混合物进行10倍梯度稀释后进行多重PCR检测，PCR反应的体系和条件如2.3。
实验结果参见图3，M：Marker 2000bp；1:1000ng/μL；2:100ng/μL；3:10ng/μL；4:1ng/μL；5:100pg/μL；6:10pg/μL；7:1pg/μL；8:100fg/μL；9:10fg/μL。
结果表明，本发明所用的引物组及检测方法，嗜水气单胞菌的最低检出限为10fg/μL；美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的最低检出限为10fg/μL；星状诺卡氏菌的最低检出限为10fg/μL；舒氏气单胞菌的最低检出限为100pg/μL；鰤鱼诺卡氏菌的最低检出限为100fg/μL；杀鲑诺卡氏菌的最低检出限为1pg/μL；6种病原菌的最低检出限为100pg/μL。
2.5模拟样品的检测
取培养过夜的嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌阳性、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌菌液与乌鳢的脾脏组织混合均匀，制备模拟样品，提取DNA后按照2.3的反应条件进行PCR扩增，结果显示本发明的引物组和检测方法可以正确的检出杀鲑诺卡氏菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和鰤鱼诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、星状诺卡氏菌和嗜水气单胞菌。
序列如下所示：
SED ID NO.1：CACCGCACTCAGACCA
SED ID NO.2：TGCAATCCGAACAGG
SED ID NO.3：GAGTCGCTAGTAATCGCAG
SED ID NO.4：CTGTGCAGTTCTCAAACAAC
SED ID NO.5：CTAGTAATCGCAGATCAGCA
SED ID NO.6：TTACTAACAAAGATGCTCGC
SED ID NO.7：AGTGGAACGACGCCTAT
SED ID NO.8：TTGTTGACCACGATTTTG
SED ID NO.9：CTGCAACTCGACCTCGT
SED ID NO.10：TCGAAGAGTTTGCGTAGA
SED ID NO.11：ATGGTGTCGGCTCAGTC
SED ID NO.12：CCGAAATCATGTTCCAA
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本申请的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
Figure BDA0002284895380000111
Figure BDA0002284895380000121
Figure BDA0002284895380000131
Figure BDA0002284895380000141
Figure BDA0002284895380000151
序列表
<110> 广东海洋大学深圳研究院；深圳义海生物科技有限公司
<120> 多重PCR检测鱼类结节病病原菌的方法
<130> HP191211LZ
<141> 2019-11-21
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
caccgcactc agacca 16
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tgcaatccga acagg 15
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
gagtcgctag taatcgcag 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ctgtgcagtt ctcaaacaac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ctagtaatcg cagatcagca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ttactaacaa agatgctcgc 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
agtggaacga cgcctat 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ttgttgacca cgattttg 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ctgcaactcg acctcgt 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
tcgaagagtt tgcgtaga 18
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
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atggtgtcgg ctcagtc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ccgaaatcat gttccaa 17

Claims (4)

1.一种PCR检测鱼类结节病病原菌的方法，包括：
提取嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA；
对病原菌的基因组DNA进行引物设计，引物如下：
嗜水气单胞菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.1所示，
嗜水气单胞菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.2所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.3所示，
美人鱼发光杆菌杀鱼亚种下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.4所示，
星状诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.5所示，
星状诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.6所示，
舒氏气单胞菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.7所示，
舒氏气单胞菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.8所示，
鰤鱼诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.9所示，
鰤鱼诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.10所示，
杀鲑诺卡氏菌上游引物，核苷酸序列如SED ID NO.11所示，
杀鲑诺卡氏菌下游引物，核苷酸序列如SED ID NO.12所示；
利用上述引物和PCR方法同时对嗜水气单胞菌、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种、星状诺卡氏菌、舒氏气单胞菌、鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌的基因组DNA进行扩增和检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，上述引物分别以嗜水气单胞菌的hlyA、美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的16S rRNA、星状诺卡氏菌的16S-23S rRNA、舒氏气单胞菌的gyrB、鰤鱼诺卡氏菌的16S-23S rRNA、杀鲑诺卡氏菌的16S-23S rRNA为靶基因而设计。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR方法的反应体系为：
2×Taq PCR Mix 25μL，
10μmol/L嗜水气单胞菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L美人鱼发光杆菌杀鱼亚种上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L星状诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L舒氏气单胞菌上下游引物0.5μL,
10μmol/L鰤鱼诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
10μmol/L杀鲑诺卡氏菌上下游引物均为0.5μL，
质粒模板0.5μL，灭菌双蒸水补足至50μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR方法的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。
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