CN117551799A - 用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重pcr鉴定方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重PCR鉴定方法及应用，属于微生物领域。本发明公开了引物组合I用于扩增ORF3336、ORF4608、ORF5389基因片段，灵敏度达125pg/μL；引物组合II用于扩增ORF3335、ORF4608、ORF5389基因片段，灵敏度达500pg/μL；引物组合III用于扩增ORF3334、ORF4608、ORF5389基因片段，灵敏度达500pg/μL。还公开了用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的多重PCR鉴定方法，为水产病例鰤鱼诺卡氏菌分离菌株的快速分型提供新方法，助力于鱼类诺卡氏菌病的防控。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重PCR鉴定方法及应用。
背景技术
鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）是鱼类诺卡氏菌病的主要病原，为好气菌、革兰氏阳性菌，大部分无气丝，部分有气生菌丝体，基丝分枝，横隔断裂成杆状体和球状体，分类学上属细菌域（Bacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌纲（Actinobacteria）、放线菌目（Actinobacterales）、诺卡氏菌科（Nocardiaceae）、诺卡氏菌属（Nocardia）。鱼类诺卡氏菌病主要的病理变化为内脏器官形成直径1-5 mm黄色或白色结节（肉芽肿），有的病鱼鳃盖内缘或鳃丝上出现结节、腹腔内有纤维瘤、皮肤溃疡。鰤鱼诺卡氏菌感染的早期无明显发病病症，在感染的中后期，病鱼的脾、肝脏和肾形成白色结节。据统计分析，鱼类感染该病后死亡率可高达90％，未及时发现鱼类患病前兆并采取有效措施，很难控制鱼类死亡引起的经济损失。
鰤鱼诺卡氏菌于1968年首次由Kariya等在日本五条鰤（Seriola quinqueradiata）和褐紫鰤（S. purpurascens）身上分离出来，随着水产养殖业集约化程度的提高，养殖过程中的鱼类诺卡氏菌病也日趋严重，据不完全统计，发病的鱼种包括乌鳢（Channa argus）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、石斑鱼（Epinephelusspp.）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、鳗（Anguilla japonica）、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)等约42种淡水与海水鱼类。
近年来，鱼类诺卡氏菌病越来越引起学者的关注，而鰤鱼诺卡氏菌的菌株分型未建立有效方法。常见的菌株分型方法包括生化分型、血清学分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）等。Xu等人指出生化分型是一种有效的细菌分型参考工具，由于该方法需要耗费大量的时间与人工成本，因此无法实现对细菌菌株的快速分型。血清分型一直被认为是识别环境和临床样本中的致病菌及对其进行流行病监测和追踪的“黄金标准”，在细菌分型鉴定中发挥着巨大的作用，该方法虽然被广泛和长期应用，但也存在诸多缺陷，主要包括：制备抗血清的步骤复杂、检测过程耗时长、容易出现交叉反应等。PFGE是20世纪80年代首次被开发的细菌分型技术，用于分离大分子DNA或染色体，一直以来被认为是临床重要细菌分子分型的“金标准”，然而，PFGE需要贵重的仪器且操作步骤较为复杂，没有足够的分辨率来区分大小几乎相同的谱带，分析结果受人为因素影响较大，容易产生一定的主观性。而多重PCR检测技术能够在亚种水平上识别和区分同种的不同类型菌株，且每个样本最少可以只使用一个PCR管。因此，利用多重PCR对鰤鱼诺卡氏菌进行分型，在对快速准确的鉴定鰤鱼诺卡氏菌的需求日益增加的背景下就显得尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是提供用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重PCR鉴定方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用所筛选的引物组合确定的多重PCR分型鉴定方法，为水产病例鰤鱼诺卡氏菌分离菌株的快速分型提供新方法，有利于选用同类型的鰤鱼诺卡氏菌菌株制备防控鱼类诺卡氏菌病的疫苗，助力于鱼类诺卡氏菌病的防控。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型鉴定的引物组合，所述引物组合包括引物组合I、引物组合II和引物组合III中的任意一项；
所述引物组合I为：SEQ ID NO：11-12所示的引物对I、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III，具体序列如下所示：
3336-F: CTGATCGAAACCCAAGACC；
3336-R: CTGTCGAAGGAATCGGTAAG；
4608-F: GAGGGCTCGGACTGGAT；
4608-R: GGAAGTGGTCGGGATGG；
5389-F: TGCTGGTGGAATGCGTGTC；
5389-R: CTTCGAGAATGGCGATGGA；
所述引物组合II为：SEQ ID NO：9-10所示的引物对IV、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III，具体序列如下所示：
3335-F: ATATCGTGCTGGAAGGGACG；
3335-R: GGGTTGGTGAAGTTCTTGCG；
4608-F: GAGGGCTCGGACTGGAT；
4608-R: GGAAGTGGTCGGGATGG；
5389-F: TGCTGGTGGAATGCGTGTC；
5389-R: CTTCGAGAATGGCGATGGA；
所述引物组合III为：SEQ ID NO：7-8所示的引物对V、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III，具体序列如下所示：
3334-F: CTCCTATGCTCATCTGGCCG；
3334-R: GGGTTGATCTCCACACTCGG；
4608-F: GAGGGCTCGGACTGGAT；
4608-R: GGAAGTGGTCGGGATGG；
5389-F: TGCTGGTGGAATGCGTGTC；
5389-R: CTTCGAGAATGGCGATGGA。
本发明还提供用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型鉴定的试剂盒，包括所述的引物组合。
本发明还提供一种用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的多重PCR鉴定方法，包括如下步骤：
以待测鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板，利用所述的引物组合进行多重PCR扩增反应，根据所述引物组合中各引物对所对应PCR产物的扩增情况，检测所述PCR扩增产物组合条带呈现的类型以对所述待测鰤鱼诺卡氏菌的菌株分型进行鉴定。
优选的是，当所述引物组合为引物组合I时，引物对I、引物对II和引物对III的质量浓度比为2:1:2；
当所述引物组合为引物组合II时，引物对IV、引物对II和引物对III的质量浓度比为1:1:1；
当所述引物组合为引物组合III时，引物对V、引物对II和引物对III的质量浓度比为1:2:2。
优选的是，所述多重PCR扩增反应的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min、30个循环；72℃延伸10min。
优选的是，所述多重PCR扩增反应的反应体系为：预混液25μL、引物组合15μL和DNA模板5μL，加ddH2O补至总体积为50μL。
优选的是，所述鉴定的方法包括：
若所述PCR扩增产物满足如下（1）：所述引物对I、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（2）：所述引物对I和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（3）：所述引物对I和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（4）：所述引物对I未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（5）：所述引物对I扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（6）：所述引物对I和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（7）：所述引物对I和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（8）：所述引物对I、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（9）：所述引物对IV、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（10）：所述引物对IV和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（11）：所述引物对IV和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（12）：所述引物对IV未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（13）：所述引物对IV扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（14）：所述引物对IV和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（15）：所述引物对IV和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（16）：所述引物对IV、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（17）：所述引物对V、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（18）：所述引物对V和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（19）：所述引物对V和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（20）：所述引物对V未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（21）：所述引物对V扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（22）：所述引物对V和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（23）：所述引物对V和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（24）：所述引物对V、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌。
本发明还提供所述的引物组合或其所述引物组合中的任意一条引物在制备鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的产品中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明对已公布的20个鰤鱼诺卡氏菌全基因组数据进行对比分析，筛选获得鰤鱼诺卡氏菌种内差异基因并设计相应引物，优化多重PCR体系反应条件，再对24株鰤鱼诺卡氏菌进行菌株分型，可以应用于水产病例鰤鱼诺卡氏菌分离菌株的分型中。本发明通过实验发现：所筛选的ORF 3334、ORF 3335、ORF 3336、ORF 4608、ORF 5389基因片段具有种内差异，利用所筛选的基因片段设计的引物进行引物组合，并确立了鰤鱼诺卡氏菌菌株的多重PCR分型方法。实验结果显示引物组合I（ORF 3336、ORF 4608、ORF 5389）能产生清晰的扩增条带，引物最优配比为3336-F/R:4608-F/R:5389-F/R=2:1:2，灵敏度达125pg/μL；引物组合II（ORF 3335、ORF 4608、ORF 5389）引物最佳配比为3335-F/R:4608-F/R:5389-F/R=1:1:1，灵敏度达500pg/μL；引物组合III（ORF 3334、ORF 4608、ORF 5389）引物最佳配比为3334-F/R:4608-F/R:5389-F/R=1:2:2，灵敏度达500pg/μL。本发明建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR分型方法，为水产病例鰤鱼诺卡氏菌分离菌株的快速分型提供新方法，有利于通过分型结果进行鱼类诺卡氏菌病疫苗的研究，助力于鱼类诺卡氏菌病的防控。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为引物组合I的多重PCR扩增电泳图；M为DL2000DNA分子标准；N为阴性对照；1-24分别对应的鰤鱼诺卡氏菌菌株为分别为HB202008、FS201912、WL-2021-1、N-2、N-1、WL-2020-1、N-4、JZL-2019-1、SZ0214、N-3、N-6、N-5、N-8、N-9、N-12、N-13、N-14、N-15、N-16、N-17、N-18、N-19、N-20和N-21；
图2为多重PCR引物浓度配比优化电泳图；M为DL2000 DNA Marker；N为阴性对照；1为鰤鱼诺卡氏菌菌株FS201912；2为鰤鱼诺卡氏菌菌株N-14；A为引物组合I 3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：1；B为引物组合I 3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：2；C为引物组合I 3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：2：2；D为引物组合I 3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 2：1：2；E为引物组合II 3335-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：1；F为引物组合III 3334-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：1；G为引物组合III 3334-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：2：2；
图3为多重PCR灵敏度电泳图；M为DL2000 DNA Marker；N为阴性对照；A为FS201912菌株利用引物组合I进行多重PCR分型检测灵敏性的结果；B为N-14菌株利用引物组合I进行多重PCR分型检测灵敏性的结果；C为FS201912菌株利用引物组合II进行多重PCR进行分型检测的灵敏性的结果；D为N-14菌株利用引物组合II进行多重PCR分型检测灵敏性的结果；E为FS201912菌株利用组合III进行多重PCR分型检测灵敏性的结果；F为N-14菌株利用引物组合III进行多重PCR分型检测灵敏性的结果；图中，1-8分别是鰤鱼诺卡氏菌DNA的浓度30ng/μL、6 ng/μL、1 ng/μL、500 pg/μL、250 pg/μL、125 pg/μL、62.5 pg/μL和31.3 pg/μL；
图4为多重PCR鉴定鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的应用；M为DL2000DNA分子标准；N为阴性对照；1-29分别对应从病鱼中分离的鰤鱼诺卡氏菌菌株HB202008、FS201912、WL-2021-1、N-2、N-1、WL-2020-1、N-4、JZL-2019-1、SZ0214、N-3、N-6、N-5、N-8、N-9、N-12、N-13、N-14、N-15、N-16、N-17、N-18、N-19、N-20、N-21、N-11、N-22、N-23、WL-2023-11、ZJ0503
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中涉及的研究样品与主要试剂：
（1）研究样品：鰤鱼诺卡氏菌的29个菌株及其来源见表1。
表1 29株鰤鱼诺卡氏菌及其来源
（2）主要试剂
DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。Premix TaqTM PCR预混液购自TaKaRa公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR仪为耶拿分析仪器公司。
以下实施例中涉及的主要基因片段：ORF 3334、ORF 3335、ORF 3336、ORF 4608、ORF 5389对应的基因分别为ArsC、AraC、ISOPREN、ALAT、IclR，核苷酸序列分别如SEQ IDNO：23-27所示。
ArsC基因（SEQ ID NO：23）：
GTGATCGTGGACCAGTCGAGTCTGGATGCCGCCGCCGCGCGGCTGGGGCAGGAGTTCGCCGGGATTCTGGATGGCGCGATGGTCGGGTCGATTCTCGACAGCTCCTATGCTCATCTGGCCGCGATCTCGATCCCGGACCGGCTG CCCGATCATGCCGAGCGGTATGCGCGGGAACGGTTGGTGGCCTTGGCCAGAGCCGAGGGACGGGCGGTGCGGAGCG GGCCGGCGGTGTTGTTCGTGTGCACGCACAATGCGGGGCGCTCGCAGATGGCGCTGGGGTTCTTCACGCGGCTGGC CGGGGGACGGGCGTCGGCGTGGTCGTGCGGATCGAAACCGAGTGTGGAGATCAACCCGGTGGTGGCCTCGGCCATGGCGGAGGTGGGAGTCGATATCTCCGAGGAGTTTCCGAAGCCGTGGAGCGATGAGCTCATGCGGGCGGCCGACGTGATCATCGATATGGGGTGCGGGGATACCGATCCGATCATCGCGGGGCATCGGTTCGAGCAGTGGCCGCTGCCCGACCCGGCCGAAGAGGACATCGAGGAGATCCGGGCCATTCGCGACCAGATCGAGGTGCGGGTGCGACGCCTGGTCGCCAATCTCGGGTTGGCGGGTTAG.
AraC基因（SEQ IDNO：24）：
ATGGTGGCGCAGTCCGCCGGTGAGTTCCTGCTGGTGAATATCGTGCTGGAAGGGACGAATTGGACCGA GCAGGCCGGCAGGGTGGCCGAATGCAAGCCCGGTTCCATCTCCTTCTTCGACAGCGGTGTGCCGCTGGAGAGCCGG ACCACCGACAATTGTCTGTCGACGCTGGTCCGCGCCCCGCTGCAACTGGTGCTCGAGCATTCCGGCCTGACCCGTG AGCAACTGCCCACCGCCAGCGCGGTCCCCGCGACCGGCGCACTGGGCGTGGTCACCAACTTCTTCCGCGGCCTGGC CGAACTCGCGCCCGACGACATCACCCAGGCGGTCACCGTCTTCGGCACCGATGCCGCGGGCATGATGGCCTCGGCC CTGCTGCTGGCCAATGGCGAAACCTCACCGGCGCCCTCCGATTCGCTCTACACCCGCCAGCAGGTGCTGGCCTACA TCCGCAAGAACTTCACCAACCCCGACCTCACCGTCGACGAGATCGCCCACGCCTGCCTGATCTCCCGCCGCACCCTCTACCGCGTCTGCGAGGGCTTCGGCGAGCCCGGCGCGATCGTGCGCCGCACCCGAATCGCCCACGCCCGCCGCCTGATCCGCGCCGACCCCGCCCGCTCCCTGGCCGCCGTCGCAGCCGCCGCCGGTTTCTCCACCGACCGCCACTTCTACCGCGCCTTCCGCGAGGAAACCGGCCTCACCCCCGGCCAATTCCGCGACCAGGTCGGCCCGCGCGGGCGGACGCAGTAA.
ISOPREN基因（SEQ ID NO：25）：
GTGAACGAGAAATCCGTCGGCACGGTTCGCAGGCGCGCCCTGATGTCGTTGTGGCAGTTGATCAGGCTGGTCGACGAGGATGCCGACGGCATGATCACCGGGTCGCCGTATGCCACCGCGGGGGTGGTCGCGCGACTCTGGCAAACACCCCGGCTACTGCCCGTTTCGCTGGCGCGGCTGGGCCTGAACGCGTTGGCGCGCAGTCGGAACGGCGACGGCAGCTGGGGCAGCCCGCACGCGCCGCGGCCCTATCGGGTGGTGCCGACGCTGGCGGTGGTGTGCGCCCTGGCGGGCCTGCCCGCCGACGCGCCGATCGAACGGGAGTGGGTGCGCGGCGCGGCGCGGCGGGGGAGCGGGTTCCTGTTCGAGGATCCGGAAGTCTTTGTGCCGGACCGACTGCCCAGTCTGGAGGCGGTCGATCGGACCGTGCCCGTGCTGCTGGAACAGCTCGCGCAGTCCCCGGAGTTCGACGCCGAGCAATACGGTCCGGCACTGCTGCGGGCCCGAATGGCGCAGCGGGCCAACGCCGACCGTTGCGCACGGCTGCGGGCCCGTGCCGCGGCCGGTGATCGTGCGGCGTGGCGGGCTTTTCCGCTGGAGCTGCTGGCCACCGCGCCCGGGGGCTGGCGATCCGAGACGGCCGTGCGCGGGGGCGCGGTGGCCTGCTCGCCGGTGTTGACCGCGGCCGCGGTCCGCTGGCACGGCGCCGAATTGGCCGGGATCGAGCGCTATCTGCGCCGCGAGGGCGTGCGCAGGCAGGGCCTGTGGCCACCCCTCGCTCCGGCCGTGAACCACGAAAGGGCCATGGCCGCGGCGCTTTTCGTCCGCCTGGGGTTCCCGCTGCCGCCGGGATTCACGGCATCGCTGAGCGCGTCGCTGCGCTCGGCGCTGGGCGCGGACGGCATGTCGTTCGCCCCCGGACTGCCACCCGACGCGGAGCACACCGCGCTGGCGATCTTCGTGCTGAACTCGTGGGACGACGCCGTGGATTCCCGCTGTCTGCTGGACTTTCCCGCACCGGCCACGCCCTTGGCGACCGCCCACGTGCTCGAGGCCTGGACCACCGTCGCGGCGATGGCCGGGACCGGTGCGGTGCGCGATCGGGCGACCGCGGCGGTGCGCGCACTGATCG AAACCCAAGACCCGGACGGTCATTGGGACGATCGCACGGTCGCCTCGGCGTGCCTGCCGACCGCCGTCGCGGCCAT GGCGCGCGTCATGGAATCGGAGTTCTCCGCCGACGCCCTGCTCGCGGTCTCGCGGGCGATCGGGTGGCTGCTGGCC AACCAGCGGTCCGACGGTTCCTGGGGTGTCTGGCACCCGGGTACGGAGGAGACCGCGTACGCGGTGCACGCGCTGG GCATTTGCGCGAGTCCGGCGGTAGAGCGGTTGGTGGCCGCCGCGCTGCGGCGGGCCCACATATTTCTTACCGATTC CTTCGACAGCGCGATGACGGATTCGGTGCGAACACCATTGTGGCACTACAAAGATCTCGCTGCACCGCTGCGAATCGAGCGTCTCTACACATTGACGGCGCTGCTGATGAGCGGTTCGCCCGTTCCGTGA.
ALAT基因（SEQ ID NO：26）：
GTGTGCGGCAACCACACCGAGAAGGGGTCGTTCATGCAGGTGAAGCAGTCGAGCAAGCTGGCGGGCGTGTCCTATGAGATCCGCGGGCCGGTCGCCGAGCACGCCGCCCGGCTGGAGGTGGAGGGGCATCACATCGTGAAGCTCAACACCGGCAACCCGCTCACCTTCGGCTTCGAAGCGCCCCCCGAGCTGCTCCAGGACATGGTCCGCAACCTGCCGCAGTCCAGCGGCTACTCCTCCTCCAAGGGCCTGCTCTCGGCGCGGCGCGCGGTGGTGCAGTACTACGAGACCCTCGGCCTCGCCGAACTCGATGTCGAACAGGTCTTCCTGGGCAACGGCGTCTCCGAGCTCATCATGATGGCCATGACCGCGCTGCTGGAGAACGGCGACGAAGTCCTGGTCCCCGCACCGGATTTCCCGCTCTGGACCGCCGCCACCGCGCTCAACGGCGGCCGCCCGGTGCACTACATCTGCGACGAGGGCTCGGACTGGATGCCGGACCTGGCCGATATCGAGTCCAAGAT CACCGACCGCACCCGCGCGCTGGTCATCATCAACCCGAACAACCCGACCGGCGCGGTGTATTCGCCCGAGGTGGTG CGCCAGATGCTCGAGCTGGCCCGCCGCCACAACCTGGTGGTGTTCTCCGACGAGATCTACGACAAGATCCTCTACG ACGGCCTGACCCACACCGCCACCGCGTCGCTGGCCCCGGATCTGTTGTGCCTCACCTTCTCCGGCCTGTCCAAGTC CTACCGCGCCGCCGGCTTCCGCGGCGGCTGGCTGGTGGTCTCCGGCCCCGTCGAGCACGCCGAGAACTACCTCGAG GGCCTGACCATGCTGGCCGGGCTGCGCCTGTGCGCGAATGTCCCCGCGCAGCAGGCGATTCAAGCCGCCCTCGGCG GCCACCAGAGCATCTACGACCTGACCCTGCCCGGCGGCCGCCTGCGCGAGCAGCGTGACCGGGCGTTCGAAGCGCT CAACGCCGTCCCGGGCATCTCGTGTGTGAAGCCCAAGGGCGCGCTGTACGCCTTCCCTCGCATCGACCTCGGCATG TACAAGATCCACAGTGACGAGCAGTTCGTCCTGGATCTGCTGCTGCGCGAGAAGATCCACATCGTCCAGGGCACCG GCTTCAACTGGCCCCATCCCGACCACTTCCGCATCGTGACGCTGCCGCACGCCGATGAGCTCGAGGCCATCATCGAACGCATCGGCCGGTTCCTGGCGACCTACAAGCAGGAGGTCCTCAGACCGGACGGCCCGCCGTCATGCCCCCGTCGACCACGAATTCCGCGCCATTGCAGTAGCTGGATTCGTGGCTGGCGAGGAACACGACCAGCGCCGTCACCTCCTCGGGCCCGCCGAGCCTGGCGAGGGTGTTCGCTTCGCGATTCGCGGTCGAACCCTCGGGCACGCCGATCATGGGCGTCAGAATCCCGCCCGGGTGAACGGAATTCACGCGCACCCCGTGCGGGGCGAGCTCGAGCGCGGCGGACTTGGTGA.
IclR基因（SEQ ID NO：27）：
GTGGCCGAACGGCCGCCCCTGCGCGGATTGACCCGGCGCGAACTGCCTTTCGTGCCGGTGTTCGCACAGTCGGTCGCGGCCATCGCGCCCTCGGGGACGGCGGTGGTCACCCCGGCCTTCGTGATCGGCGCGGCCGGGGGCGGGGCGAGTGTGGCCGCGTTCCTGGCGGCGGCGCTGCTGGCCTGGGCGGTGGCCCTGGTGATCCGGCCCATGGCGCAGCGGCTGGCGGTGACCGGCGGGCTGTACACATACGTGGCGAAGGGGCTCGGTCCGTTCGTCGCAGTACCGACCGGGTGGTCGGCGATTGTGGGGTACGCGAGCGTCAGTGTGGCGGGGCTGCTCGCGGTCGGCACCTATCTGGATCAGCTCGCGGTCACGGCCGGGCTGGCCGGTTTCGGTGGGACCGCAACGATTGTCGGCCTGCTGCTGGTCGCGGCGGTGGTGGAGGCGGTGCTCATGGTGCGCGGCATCCGGCTGTCGGCGTCGGCGACGCTGCTGGTGGAATGCGTGTCCGTGGTGACGGT GCTCGCGCTCATGGGCTACCTGCTGACCCGCGACGCGCACGCTCCGCGTCCGGCCCCGGTCTTCGAATGGCACGGC GGCACCGGCACTCTCGCCATGAGCGCGGTGGTGGCGGTCAGCGCCTTCGTCGGATTCGAGAGTGCGACCACCCTGT CCGCCGAGGCCTACCGGCCGTTCCGTTCGGTGCCGCGGACCTTGGTCTGGACACCGCTGGCCGCCGCCGTCATCTA CCTGATCGCGGTGACCGCGCAGGCCGTGGCCCTGGCCGCCGCGCCCCCGGGCACCGCCTCGAGCTCGACACCGGTC ACCGATCTGCTCATGCGGGGCGATTCCGGATTCCTCGGCGCGGTCCTGGATCTCGGGGTCGCGGCATCGTTCTTCG CCTGCACCGTCGCCTCGATCAACGCGCTGGTGCGGGTGCTGTTCACCATGGGCCGCGAGCGCATCGCCCCGGCGGC GGCCGGGCGCGCGCACTCCCGTTTCCACACCCCGGCCCCCGCCATTGTCGCGGCGGTGGGCGCGGTGACCGCCTGC GCGCTGTGGTACCTGCTCTCCGGAGCCGAACCCCAGGACGGCATCCGCAGCTTCCTGACCCTGAGCGCGCTCGGAT ACCTCGGCTCGTACCTGCCCGCCTGTCTGGCCACCCCGGCGCTGCTGCGCCGCATCGGCGAACCCAGCCGCGCCAT CGCGATCCTCGGCTCGGTGACCGCGCTGCTGCTCGGCGTGCTCATGGTCGGCGCGGCGGTCTCGGCCCGCAATGAC AATGTCACCGTGGTGATCGCCTACGCCGCGATCCTGGCGGCGGCCGTGGCATTCACCGTCGGCCTGCGCGTGCTCG CGCCGGATCGGTTGCGCGGCATCGGCATCTACGACGAGCCGCGCCGCGAAGACCTGCTGCCCGTCGTGACCTTCCG GGAGCCGCCATGCAGGATTCCCGCCGCACCAATACGGTCTCGAACTCCATCGCCATTCTCGAAGCGGTCGCCGACTGCGGGGTGGGCGTCACCGCCAAGGAGATCGCGCAGCGTCTGGGCATCGCGCCCGCCACCACCTACCGGCTGCTGA.
上述序列中标下划线的碱基为下述实施例中对应基因扩增的基因片段。
实施例1 筛选种内差异的基因组DNA片段并设计PCR引物
1、设计PCR引物
使用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLAST程序对已公布的鰤鱼诺卡氏菌20个菌株的全基因组数据（见表2）进行序列比对分析，筛选获得的10个在上述20株鰤鱼诺卡氏菌中具有种内差异的基因片段（ORF 362、ORF 2083、ORF 3334、ORF 3335、ORF 3336、ORF 3691、ORF 4608、ORF 4884、ORF 5389、ORF 7220）作为待检目标片段，即存在于部分鰤鱼诺卡氏菌菌株、但不存在于所有鰤鱼诺卡氏菌菌株的基因片段，针对各目的片段设计特异性PCR引物（见表3）。此外，文献报道的在鰤鱼诺卡氏菌不同菌株中具有种内差异的dop毒力基因及其PCR引物（见表3），一并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
表2 NCBI公布的20株鰤鱼诺卡氏菌全基因组数据
表3 11对候选引物对信息
上表中“罗愿等文献”为“罗愿,邓玉婷,赵飞,等. 9株鱼源鰤诺卡氏菌生物学特征和致病性比较[J]. 微生物学通报,2021,48(8):2733-2749.”
2、引物筛选、多重PCR引物组合筛选
通过单重PCR，可确定11对引物的扩增条带是否具备单一性、能否体现不同来源的差异性。PCR反应条件为95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。设置20μL PCR反应体系：Premix TaqTMPCR预混液10μL、表2中的引物对(浓度100ng/μL)各1μL、DNA模板1μL、用ddH2O补足至20μL。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
筛选出可以扩增出单一、种内差异的PCR引物对后，设置50μL PCR反应体系PremixTaqTMPCR预混液25μL，总引物1 μL（多对候选引物等比例加入），DNA模板为5μL，用ddH2O补足至50μL。PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。将扩增片段长度具有差异的引物进行组合，根据扩增效果进行筛选，既能体现不同来源鰤鱼诺卡氏菌菌株的差异性，又不能出现不合理的扩增条带缺失。
3、多重PCR反应条件参数优化
根据上述筛选的实验结果，选定扩增效果较好的多重PCR候选引物对组合，设置50μL PCR反应体系：Premix TaqTMPCR预混液25μL，总引物为15μL（引物对1：引物对2：引物对3= 1:1:1，比例为质量浓度比），DNA模板为5 μL，用ddH2O补足50μL。PCR反应程序为95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，检测引物对1、引物对2和引物对3的质量浓度比为1:1:1时的扩增效果。根据等比例引物配比的扩增效果，适当增加弱带的引物配比比例后，再次进行扩增。以目的片段都能扩增出单一清晰条带、不产生非特异性条带作为优化引物配比的指标。
4、多重PCR分型鉴定的灵敏程度检测
用ddH2O稀释鰤鱼诺卡氏菌DNA，制成8个鰤鱼诺卡氏菌DNA浓度梯度，即鰤鱼诺卡氏菌DNA浓度分别为30ng/μL、6ng/μL、1ng/μL、500pg/μL、250pg/μL、125pg/μL、62.5pg/μL、31.3 pg/μL。按照优化后的引物配比，使用不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌DNA模板，以ddH2O为空白对照，检测多重PCR的灵敏度。
5、多重PCR分型鉴定的应用检测
取感染鱼类诺卡氏菌病鱼样中分离到的鰤鱼诺卡氏菌菌株，提取基因组DNA后，按照优化后的多重PCR反应条件参数，应用建立的多重PCR鰤鱼诺卡氏菌菌株分型方法对病例菌株进行分型鉴定。
6、结果与分析
6.1 筛选单重PCR的引物
使用引物dop-F/R、引物362-F/R、引物ORF 2083-F/R、引物ORF 3334-F/R、引物ORF3335-F/R、引物ORF 3336-F/R、引物ORF 3691-F/R、引物ORF 4608-F/R、引物ORF 4884-F/R、引物ORF 5389-F/R、引物ORF 7220-F/R分别以本实验室保存的24株鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板进行单重PCR扩增，结果显示，本实验室保存的24株菌株均携带ORF 362、ORF 2083、ORF3691、ORF 4884、ORF 7220、dop基因片段，而ORF 3334、ORF 3335和ORF 3336基因片段均只在HB202008、FS201912及N-14三个菌株中检测到，ORF 4608只在18株菌株中检测到，ORF5389只在17株菌株中检测到（见表4）。
表4 24株菌株单重PCR扩增结果
注：+：目的基因检测阳性；−：目的基因检测阴性
6.2 多重PCR体系的引物组合筛选
根据上述单重PCR实验结果，ORF 3334、ORF 3335、ORF 3336、ORF 4608、ORF5389基因片段具有鰤鱼诺卡氏菌种内差异。根据其引物扩增片段在各菌株的扩增情况及扩增片段长度差异，以引物ORF 3336-F/R、引物ORF 4608-F/R、引物ORF 5389-F/R作为多重PCR分型方法建立的引物组合I。分别以本实验室保存的24株鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板进行多重PCR的扩增，检测结果如图1所示，各菌株均能扩增出合理的条带，即在单重PCR体系中检测呈阳性的基因片段在多重PCR体系中均能扩增出相应的条带，在单重PCR体系中目的基因检测阴性的基因片段在多重PCR体系中均未扩增出条带。各菌株对应的菌株分型如表5所示，如表中的FS201912、N-14经引物组I扩增后对应基因片段均能扩增出条带，表达这两株菌判定为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌。由于ORF 3334、ORF 3335和ORF 3336的PCR扩增呈现相同的菌株分布，引物组合II（ORF 3335、ORF 4608、ORF5389）和引物组合III（ORF 3334、ORF4608、ORF5389）的多重PCR扩增结果与引物组合I相同。表明所设计的3组引物组合均可用于建立鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的多重PCR鉴定方法。
表5 24株鰤鱼诺卡氏菌菌株对应的菌株分型
注：“菌株分型”栏从左至右依次代表ORF 333、ORF 460、ORF 5389基因片段扩增情况，“＋”表示有扩增片段，“－”表示无扩增。
6.3 多重PCR反应条件参数的优化结果
6.3.1多重PCR引物配比的优化结果
根据上述多重PCR实验结果，使用引物组合I（ORF 3336、ORF 4608、ORF5389）、引物组合II（ORF 3335、ORF 4608、ORF5389）和引物组合III（ORF 3334、ORF 4608、ORF5389），两株鰤鱼诺卡氏菌FS201912和N-14均能扩增出3条目的基因片段，因此选定上述两个菌株作为优化多重PCR体系引物配比的菌株。多重PCR反应体系与反应条件见“3、多重PCR反应条件参数优化”。结果显示，当引物组合I（ORF3336、ORF4608、ORF5389）总引物浓度比值为3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：1时，ORF 5389基因片段只能检测出一条很淡的荧光条带(见图2中A)。调整三对引物配比为3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1：1：2时，FS201912菌株三个目的基因片段均不能检测出条带(见图2中B)。调整三对引物配比为3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R =1：2：2时，三个目的基因片段都出现较清晰条带(见图2中C)。调整引物配比为3336-F/R：4608-F/R：5389-F/R =2：1：2时，三个目的基因片段都出现清晰条带，且3个条带的亮度差别较小（见图2中D），所以选择该配比为最佳引物配比。
当引物组合II（ORF3335、ORF4608、ORF5389）总引物浓度比值为3335-F/R：4608-F/R：5389-F/R =1:1:1时，三个目的基因片段都出现清晰条带，且3个条带的亮度差别较小（见图2中E），故直接使用该比例。
当引物组合III（ORF3334、ORF4608、ORF5389）总引物浓度比值为3334-F/R：4608-F/R：5389-F/R = 1:1:1时，ORF 5389、ORF 4608基因片段只能检测出很淡的荧光条带（见图2中F）。调整三对引物配比为3334-F/R：4608-F/R：5389-F/R=1:2:2时，三个目的基因片段都出现清晰条带（见图2中G），所以选择该配比为最佳引物配比。
6.3.2 多重PCR反应条件参数的确立
经过多重PCR反应条件参数的优化，确立多重PCR反应体系（50μL）为PremixTaqTMPCR预混液25μL、总引物15μL（引物组合I中引物配比3336-F/R:4608-F/R:5389-F/R =2:1:2；引物组合II中引物配比为3335-F/R:4608-F/R:5389-F/R = 1:1:1；引物组合III中引物配比为3334-F/R:4608-F/R:5389-F/R = 1:2:2)、DNA模板5 μL、加ddH2O补足50μL；多重PCR反应程序为95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min、30个循环；72℃延伸10min。
6.3.3 多重PCR的灵敏程度检测
根据优化后的多重PCR反应条件和程序，对提取好的FS201912和N-14两株鰤鱼诺卡氏菌DNA进行等比稀释，形成8个浓度梯度，进行多重PCR的灵敏程度检测。对引物组合I：3336-F/R(320bp)、4608-F/R(685bp)、5389-F/R(1007bp)进行多重PCR灵敏度检测：结果如图3中A和B所示，结果显示：鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为125pg/μL时仍能同时扩增出合理的目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明引物组合I所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达125pg/μL。
对引物组合II：3335-F/R(433bp)、4608-F/R(685bp)、5389-F/R(1007bp)进行多重PCR灵敏度检测，结果如图3中C和D所示，结果显示：鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为500pg/μL时仍能同时扩增出合理的目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明引物组合II所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达500pg/μL。
对引物组合III：3334-F/R(252bp)、4608-F/R(685bp)、5389-F/R(1007bp)进行多重PCR灵敏度检测，结果如图3中E和F所示，结果显示：鰤鱼诺卡氏菌DNA模板量为500pg/μL时仍能同时扩增出合理的目标条带，条带片段大小与预期一致。阴性空白对照无任何扩增条带。表明引物组合III所建立的鰤鱼诺卡氏菌多重PCR的灵敏度可达500pg/μL。
6.4 多重PCR鉴定方法对鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的应用检测
使用优化后的多重PCR参数，使用引物组合I（3336-F/R、4608-F/R、5389-F/R）对从感染鱼类诺卡氏菌病鱼体分离到的29株鰤鱼诺卡氏菌菌株进行多重PCR分型鉴定，结果如图4所示，29株鰤鱼诺卡氏菌菌株对应的菌株分型如表6所示。
表6 病鱼分离出的29株鰤鱼诺卡氏菌菌株对应的菌株分型
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注：“菌株分型”栏从左至右依次代表ORF3336、ORF4608、ORF5389基因片段扩增情况，“＋”表示有扩增片段，“－”表示无扩增。
从上述实施例的结果可以看出，本发明建立的多重PCR鉴定方法对于鰤鱼诺卡氏菌菌株的分型具备良好的效果，且具有较高灵敏度，引物组合I（3336-F/R、4608-F/R、5389-F/R）低至125pg/μL混合样品仍可被检出；引物组合II（3335-F/R、4608-F/R、5389-F/R）低至500pg/μL混合样品仍可被检出；引物组合III（3334-F/R、4608-F/R、5389-F/R）低至500pg/μL混合样品仍可被检出；因此，利用多重PCR技术对鰤鱼诺卡氏菌菌株进行分型鉴定的方法在鱼类诺卡氏菌的病害防治中具有应用价值。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型鉴定的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括引物组合I、引物组合II和引物组合III中的任意一项；
所述引物组合I为：SEQ ID NO：11-12所示的引物对I、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III；
所述引物组合II为：SEQ ID NO：9-10所示的引物对IV、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III；
所述引物组合III为：SEQ ID NO：7-8所示的引物对V、SEQ ID NO：15-16所示的引物对II和SEQ ID NO：19-20所示的引物对III。
2.用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
3.一种用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的多重PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测鰤鱼诺卡氏菌的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行多重PCR扩增反应，根据所述引物组合中各引物对所对应PCR产物的扩增情况，检测所述PCR扩增产物组合条带呈现的类型以对所述待测鰤鱼诺卡氏菌的菌株分型进行鉴定。
4.如权利要求3所述的多重PCR鉴定方法，其特征在于，当所述引物组合为引物组合I时，引物对I、引物对II和引物对III的质量浓度比为2:1:2；
当所述引物组合为引物组合II时，引物对IV、引物对II和引物对III的质量浓度比为1:1:1；
当所述引物组合为引物组合III时，引物对V、引物对II和引物对III的质量浓度比为1:2:2。
5.如权利要求3所述的多重PCR鉴定方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min、30个循环；72℃延伸10min。
6.如权利要求3所述的多重PCR鉴定方法，其特征在于，所述多重PCR扩增反应的反应体系为：预混液25μL、引物组合15μL和DNA模板5μL，加ddH2O补至总体积为50μL。
7.如权利要求3所述的多重PCR鉴定方法，其特征在于，所述鉴定的方法包括：
若所述PCR扩增产物满足如下（1）：所述引物对I、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（2）：所述引物对I和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（3）：所述引物对I和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（4）：所述引物对I未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（5）：所述引物对I扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（6）：所述引物对I和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（7）：所述引物对I和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（8）：所述引物对I、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（9）：所述引物对IV、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（10）：所述引物对IV和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（11）：所述引物对IV和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（12）：所述引物对IV未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（13）：所述引物对IV扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（14）：所述引物对IV和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（15）：所述引物对IV和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（16）：所述引物对IV、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（17）：所述引物对V、所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（18）：所述引物对V和所述引物对II均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（19）：所述引物对V和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（20）：所述引物对V未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（21）：所述引物对V扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（22）：所述引物对V和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对II扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（23）：所述引物对V和所述引物对II均未扩增出对应的PCR扩增产物，所述引物对III扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌；
若所述PCR扩增产物满足如下（24）：所述引物对V、所述引物对II和所述引物对III均未扩增出对应的PCR扩增产物，则将符合该扩增结果的所述待测菌株归为同一种类型的鰤鱼诺卡氏菌。
8.如权利要求1所述的引物组合或其所述引物组合中的任意一条引物在制备鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的产品中的应用。
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