CN109897912A - 一种lamp引物及检测葡萄霜霉病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于检测葡萄霜霉病菌技术领域，具体涉及一种LAMP引物及检测葡萄霜霉病菌的方法；所述方法包括：扩增反应：以待测样品的DNA作为扩增模板，采用所述LAMP引物，通过LAMP技术进行DNA的扩增反应，得到扩增产物；检测：采用染色剂染色或电泳方式检测所述扩增产物，确定所述待测样品是否感染所述葡萄霜霉病菌。本发明设计的LAMP引物结合LAMP技术检测葡萄霜霉病菌，极大地提高了检测效率，降低了检测成本，具有易操作、快速、灵敏、高度特异性等特点。

Description

一种LAMP引物及检测葡萄霜霉病菌的方法

技术领域

本发明属于检测葡萄霜霉病菌技术领域，具体涉及一种LAMP引物及采用环介导等温扩增技术来检测葡萄霜霉病菌的方法。

背景技术

由葡萄霜霉菌单轴霉[Plasmopara viticola(Berket Curtis)Ber.Et de Toni]侵染引起的葡萄霜霉病是危害葡萄最严重的病害之一。目前，世界上几乎所有的葡萄产区都有葡萄霜霉病的发生。一般年份，葡萄霜霉病引起的损失在10％～15％左右，流行年份，可达20％～80％，严重制约了葡萄产业的健康发展。

葡萄霜霉病是一种典型的流行性病害，病菌从侵入到发病需要3～5d。在条件适宜时，从田间出现中心病株到全田普发，仅需10～15d。再加之，葡萄霜霉病菌是一种活体营养专性寄生菌，无法人工培养，这在一定程度上影响了对该病菌的早期诊断、监测、群体遗传分化等方面的深入研究。传统的病原菌分离鉴定方法比较繁琐，无法实现早期快速准确诊断，给病害监测和防控工作带来一定困难。因此，建立简便、快速和准确的早期检测技术尤为重要。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，常规PCR、实时荧光定量PCR(Real-timePCR)和环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等分子鉴定手段广泛应用于植物病原物的检测和定量研究。LAMP技术是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列。迄今已建立了针对多种病原性真菌、细菌、病毒、寄生性线虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。

目前常用的检测葡萄霜霉病菌的方法是PCR技术，但该技术存在的不足至少包括(非专利文献1～10)：1)无法区分田间葡萄白粉病、霜霉病和灰霉病等样品；2)对葡萄白粉病样品的检测会出现假阳性，且不能直观获得检测结果。

因此，针对以上不足，需要提供一种技术方案来克服或至少减轻现有技术的至少一个上述缺陷。

非专利文献

非专利文献1：秦文韬,黄晓庆,孔繁芳,等.葡萄霜霉病菌PCR检测方法的建立与应用[J].植物保护,2014,40(2):99～102+108.

非专利文献2：秦文韬.葡萄霜霉病菌快速检测方法[D].中国农科院博士学位论文，2013.

非专利文献3：孙炳剑,陈清清,袁虹霞,等.SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用[J].中国农业科学,2015,48(1):55～62.

非专利文献4：刘劼,焦彬彬,宋绍祎,等.丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测[J].植物病理学报,2016,46(6):730～738.

非专利文献5：李京,张祥林,王翀,等.基于线粒体DNAcox2基因的甜菜霜霉病的分子检测技术[J].新疆农业科学,2016,53(5):857～865.

非专利文献6：李京,张祥林,王翀,等.菠菜霜霉病菌快速分子检测方法研究[J].新疆农业科学,2016,53(2):346～351.

非专利文献7：王晓杰,康振生,黄丽丽.PCR技术在植物病害检测中的应用[J].云南农业大学学报(自然科学),2005,20(2):179～182.

非专利文献8：Hayden K J,Rizzo D,Tse J,et al.Detection andquantification of Phytophthorara morum from California forests using a real-time polymerasechain reaction assay[J].Phytopathology,2004,94(10):1075～1083.

非专利文献9：Leisova L,Kucera L,Chrpova J,et al.Quantification ofFusarium culmorum in wheat and barley tissues using real-time PCRincomparison with DON content[J].Journal of Phytopathology,2010,154(10):603～611.

非专利文献10：Moretti C,Quaglia M,Cerri M,et al.A real-time PCR assayfor detection and quantification of Botrytis cinereain Pelargonium x hortorumplants,and its use for evaluation of plant resistance[J].European Journal ofPlant Pathology,2015,143(1):159～171.

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种LAMP引物及检测葡萄霜霉病菌的方法，该方法结合LAMP技术建立一种快速、灵敏、高度特异的检测葡萄霜霉病菌的方法，为葡萄霜霉病菌的快速检测和早期诊断提供了新的手段。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种LAMP引物，所述LAMP引物包括：外引物和内引物；

所述外引物包括：

PVITF3-1：5′-CGTGAACCGTTTCAACCA-3′；

PVITF5-1：5′-GTATCTAGTAAAAGCGAAGACTT-3′；

所述内引物包括：

PVITFIP-1：5’-ATCCATTAGCTGCAACCGCC-AGTTGGGGATGAAATAGGC-3’；

PVITBIP-1：5’-AGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGT-CGTCCTCACAGTATAATCAGT-3’。

进一步地，所述LAMP引物对葡萄霜霉病菌具有较高的特异性，对混合侵染或侵染潜育期的葡萄叶片病样也可以检测出病菌含量。检测最大DNA浓度与常规PCR相当，灵敏度为10pg.μL^-1。

进一步地，所述LAMP引物是根据葡萄霜霉菌(登录号：DQ665668和登录号：DQ665666)、葡萄白粉菌(登录号：LC028995和登录号：KJ539202)和葡萄灰霉菌(登录号：KX443701)的rDNA-ITS的序列信息，通过序列比对，以葡萄霜霉菌rDNA-ITS(登录号：DQ665668)全长序列(2337bp)设计得到7组LAMP引物，经实验筛选获得1组特异性高的引物，即所述LAMP引物。

一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，所述方法包括：

扩增反应：以待测样品的DNA作为扩增模板，采用所述LAMP引物，通过LAMP技术进行DNA的扩增反应，得到扩增产物；

检测：采用染色剂染色或电泳方式检测所述扩增产物，确定所述待测样品是否感染所述葡萄霜霉病菌。

进一步地，所述扩增反应的体系为一25μl扩增反应的反应体系(即LAMP反应体系)；所述25μl扩增反应的反应体系(下表1)中包括：10×ThermoPol缓冲液2.5μl、40μM外引物0.5μl、100μM内引物1.4μl、25mM Mg²⁺6μl、10mM dNTPs 2.5μl、8U Bst DNA Polymerase 1μl、5M甜菜碱(betaine)5μl。

表1 LAMP反应体系(25μl)

进一步地，所述10×ThermoPol缓冲液包括：20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mMMgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％(m/v)TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。

进一步地，所述待测样品的DNA包括：葡萄潜伏侵染的叶片、或表现症状葡萄叶片、或葡萄霜霉病菌基因组的DNA。

进一步地，提取所述葡萄潜育侵染的叶片总DNA的方法，包括：田间采集葡萄霜霉病病叶“拓贴”接种或配置孢子囊悬浮液喷雾接种于健康葡萄叶片，25℃，RH80％，保湿培养，待症状显示前，分别取8h、16h和24h的潜伏侵染叶片，称取0.1～0.5g，提取所述病叶总DNA。

进一步地，提取所述表现症状葡萄叶片总DNA的方法，包括：田间采集不同发病时期葡萄霜霉病病叶，称取0.1～0.5g叶片，提取病叶总DNA。

进一步地，提取所述葡萄叶片总DNA采用去糖去酚植物提取DNA试剂盒。

进一步地，提取所述葡萄霜霉病菌基因组DNA的方法，包括：田间采集葡萄病叶或接种显症的病叶，刮取少量病菌菌丝体，提取所述病菌基因组DNA。

进一步地，提取所述葡萄霜霉病菌基因组DNA的方法采用真菌基因组DNA试剂盒。

进一步地，采用所述染色剂染色的方式检测所述扩增产物的方法，包括：在扩增产物中添加SYBR Green Ι荧光染液，观察扩增产物的颜色变化，确定葡萄叶片是否感染葡萄霜霉病菌。

进一步地，采用电泳方式检测所述扩增产物的方法，包括：对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得葡萄霜霉病菌基因扩增产物条带，确定样品是否感染所述病菌。

进一步地，所述扩增反应中，采用所述LAMP引物的内引物和外引物的物质的量浓度比为内引物：外引物＝1:7。

进一步地，所述扩增反应中，反应温度是62℃。

进一步地，所述扩增反应中，反应时间为1h。

进一步地，所述扩增反应中，Mg²⁺浓度为6mM(在25μl反应体系中，Mg²⁺浓度计算方法25mM×6μl/25μl＝6mM)。

本发明具有如下有益技术效果：

本发明设计LAMP引物结合LAMP技术检测葡萄霜霉病菌，极大地提高了检测效率，降低了检测成本，具有易操作、快速、灵敏、高度特异性等特点。

本发明的方法已经成功地应用于室内和田间葡萄霜霉病菌不同侵染时期和病害复合侵染的同步检测。

附图说明

图1为本发明实施例中LAMP反应特异性检测及染色观察示意图。

其中，A:M:100bp DNA Ladder；1:葡萄霜霉病菌；2:葡萄白粉病菌；3:葡萄灰霉病菌；CK:葡萄无菌组培苗；

B(肉眼观察):CK:葡萄无菌组培苗；1:葡萄霜霉病菌；2:葡萄白粉病菌；3:葡萄灰霉病菌；

C(蓝光仪下观察):CK:葡萄无菌组培苗；1:葡萄霜霉病菌；2:葡萄白粉病菌；3:葡萄灰霉病菌。

图2为本发明实施例中LAMP反应最佳温度优化(62℃)的示意图。

其中，M:100bp DNA Ladder；1:66℃；2:64℃；3:62℃；4:60℃。

图3为本发明实施例中LAMP反应Mg²⁺浓度优化(6mM)的示意图。

其中，M:100bp DNA Ladder；1～3:Mg²⁺浓度5mM；4～6:Mg²⁺浓度6mM；7:清水。

图4为本发明实施例中LAMP反应最佳内外引物浓度比(1:7)变化的示意图。

其中，M:100bp DNA Ladder；1:1:5；2:1:6；3～4:1:7；5:1:8；6:清水。

图5为本发明实施例中采用本发明的方法检测田间样品的染色示意图。

其中，A:LAMP反应M:100bp DNA Ladder；1:清水；2:葡萄无菌组培苗；3:葡萄霜霉病叶(森淼兰月谷酒庄，品种维戴尔)；4:葡萄霜霉病叶(志辉源石葡萄酒业有限公司，品种赤霞珠)；5:葡萄霜霉病叶(蒲尚酒庄，品种美乐)；6:葡萄霜霉病叶(立兰酒庄，霞多丽)；

B:LAMP反应染色观察(肉眼观察):1～6顺序同A；

C:LAMP反应染色观察(蓝光仪下观察):1～6顺序同A。

图6为本发明实施例中“拓贴”接种不同时间葡萄霜霉病样品的LAMP检测示意图。

其中，A：“拓贴”接种不同时间葡萄霜霉病叶(赤霞珠)的症状(8h、16h和24h)；

B:“拓贴”接种不同时间葡萄霜霉病叶的LAMP检测M:100bp DNA Ladder；1:葡萄无菌组培苗；2:拓贴接种8h；3：拓贴接种16h；4:拓贴接种24h；

C:“拓贴”接种不同时间葡萄霜霉病叶的LAMP检测染色观察(肉眼观察)1～4顺序同B；

D:“拓贴”接种不同时间葡萄霜霉病叶的LAMP检测染色观察(蓝光仪下观察)1～4顺序同B。

图7为本发明实施例中快速检测葡萄霜霉病菌的方法的操作步骤示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例及说明书附图，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。

本实施例提出一种LAMP引物，所述LAMP引物包括：外引物和内引物；

所述外引物包括：

PVITF3-1：5′-CGTGAACCGTTTCAACCA-3′；

PVITF5-1：5′-GTATCTAGTAAAAGCGAAGACTT-3′；

所述内引物包括：

PVITFIP-1：5’-ATCCATTAGCTGCAACCGCC-AGTTGGGGATGAAATAGGC-3’；

PVITBIP-1：5’-AGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGT-CGTCCTCACAGTATAATCAGT-3’。

所述LAMP引物对人工拓贴接种后，处于潜育侵染的葡萄叶片也可以检测出葡萄霜霉病菌(如图6所示)。

所述LAMP引物对葡萄霜霉病菌具有较高的特异性，对混合侵染或侵染潜育期的葡萄叶片病样也可以检测出病菌含量。检测最大DNA浓度与常规PCR相当，灵敏度为10pg.μL^-1。

所述LAMP引物是根据葡萄霜霉菌(登录号：DQ665668和登录号：DQ665666)、葡萄白粉菌(登录号：LC028995和登录号：KJ539202)和葡萄灰霉菌(登录号：KX443701)的rDNA-ITS的序列信息，通过序列比对，以葡萄霜霉菌rDNA-ITS(登录号：DQ665668)全长序列(2337bp)设计得到7组LAMP引物，经实验筛选获得1组特异性高的引物，即所述LAMP引物。

所述葡萄霜霉菌rDNA-ITS的全长序列为：

CCACACCTAAAAACTTTCCACGTGAACCGTTTCAACCAAATAGTTGGGGATGAAATAGGCAGCGACTACTGACTTTATTGTTGGCGGTTGCAGCTAATGGATTCCTATCATAGTGAAATAGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGTAGCTATTTTTAAACCATTACTAAATACTGATTATACTGTGAGGACGAAAGTCTTCGCTTTTACTAGATACAACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTTCGGGTTAGTCCTGGAAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTACAATAAACTTGGCATTTCATCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAAGTAAAGCCAGATGTGAAGTGTCTTGCGCTTAATTTTAAATTGATTGCGAGTCCTTTTAAATGTACTCACTGTACTTCTCTTTGCTCAAAAAGCATAGCGATTTTGGTTGTTAGACTTTGTGATTAGTAACAAAACTGCTCCCGGTTTGTTTGTCGAGGCAATAATGAAAGAGTATTTAATTTGCGGAAGCTGGCCTCGGCTAAGCTATACGCTTATATAGTATGCTTTCTGGCATGACATTTACAGGTGGGTCGTAGTTACGACGTTGCTTTGTCTTTTAACCGGTTTTGCTGTTATAAAAGACTTTCATCTGTAGCCAATCGGCGATCAATTTCTTCTTGCTAAAGCATTTAAGAAAATTTGTTATAAATATGAACTATATCAGCTTTTGCTTGATACTGTGCTTATAAAACATTTTTCTTGCTGCGGCAGAATAACTTGGTGAACCGTAGTTATATTTGATACTTTGGTCTTCTAATCGGCATTATTGCTGCGAAAGGTTTTGCTTGTACTTGTCGGCGACCGATTTATTCTTCTTAAGCACTAAGAAAATTAGTATGAAAAGCGCTAATTAAAGCTCTGCTTTAATAATGCACTTTTTGAACATTTTTTTCTGCTATAGATAATAATAAAATGGTGAACCGTAGTTATGAGCTTAAATCTTTTAACGTGTAATGTTGTGTGAAGGCTGTCGTTTGTAGCAAGTCGGCGATCATTGTTTTTGCTGAAGCACTTAAAGAAAATTTGTTATATATTCGTACAATATCAGCTTTGGCTTGTTAATGTGCTTATTAAACATTTTTTTTGCTGCGGCAGAATACTTTGGTGAACCGTAGTTATATTCGATACTATAGTCTTCTAATCGGCATTATTGTTGCGAAAGGTTTTGCTTGTACTTGTCGGCGACCAATTTATTCTTCTTAAGCACTAAGAAAATTGGTATGAAAAGCGCTATTTAAAGCTCTGCTTTAATAATGCACTTTTTGAACTTTTTTTCTGCTATAGATAATAATAAAATGGTGAACCGTAGTTATGAGCTTTAAGTCTTTTGATGTTTAATGTTGTGTGAAGGCTGTCGTTTGTAGCAAGTCGGAGATCATTTTTTTTGCTGAAGCACTTAAAAAAAATTTGTTATATATTTGTACAATATCAGCTTTGGCTTGTTAATGTGCTTATTAAACATTTTTTTTGCTGCGGCAGAATACTTTGGTGAACCGTAGTTATATTCGATACTATAGTCTTCTAATCGGCATTATTGTTGCGAAAGGTTTTGCTTGTACTTGTCGGCGACCGATTTAATTTCTTAAGCACTAAGAAAATTGGTATGAAAAGCGCTATTTAAAGCTCTGCTTTAATAATGCACTTTTTGAACTTTTTTTCTGCTATAGATTAATTATAGAGTGGTGAACCGTAGTTATGAGCTTAAAGTCTTTTAATCTATAATGCTGTGTGAAGGCTGTCGTTTTTGACCGGTCGGCGATCACTTTGTTTATACTTAAAGCATAAGAAAAAAATATTTTAGTATGTGTTTTGATAGCTTCGGCTTGAAAATGTGCTAATAAATTCTTTTCTTATTGCAGTATAATAACTTGATGAACCGTAGTCATTAGTGACAAAGTCTTTTATTAAGCTATACCAGTTTGAAGTTTGTCTATTGTGGCCAGTCGGCGACCAATTTATTTGCTGTTGCATTAAAGATTTTTTTTTGATTTGCGGTATGGTTGGCTTCGGCTAAACAATGCGTTTATTAAATTAATTTCTGTGATGGCTTAATGAATCGGTGAACCGTAGCTATATGTGACTATGCTTTCAATCAGTTTTGCTATTGCGAAGTAGAGTGGCAGCTTTGGCTGCCGAGGGTCGATCCATTTGGGAAATAATGTGTATTTCGGTATGCATCTCAGTTGGACCTGATATCAGGCAA。

所述7组LAMP引物的序列为：

第一组：PVITF3-1:CGTGAACCGTTTCAACCA

PVITB3-1:GTATCTAGTAAAAGCGAAGACTT

PVITFIP-1:ATCCATTAGCTGCAACCGCC-AGTTGGGGATGAAATAGGC

PVITBIP-1:AGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGT-CGTCCTCACAGTATAATCAGT

第二组：PVITF3-2:CTTTCCACGTGAACCGTT

PVITB3-2:GTATCTAGTAAAAGCGAAGACTT

PVITFIP-2:TGCAACCGCCAACAATAAAGT-TCAACCAAATAGTTGGGGAT

PVITBIP-2:AGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGT-CGTCCTCACAGTATAATCAGT

第三组：PVITF3-3:AGATATTCCAGATATGAAGTGTCT

PVITB3-3:AGCCGAAACTAACCATACC

PVITFIP-3:CGAGCAAAGAGAAGTACAGTTAGT-TGCGGTTGATTTTCGAACT

PVITBIP-3:AAGCATAGCGATTCTGACTTTAAGA-TTTCATTATTGCCGTGGC

第四组：PVITF3-4:GGTTTTTTTCCTTCCGTGTAG

PVITB3-4:TTATTGCCGTGGCAAACA

PVITFIP-4:GGACTCACAGTCAGTTCGAAAAT-TCGGTGGAAGATATTCCAGAT

PVITBIP-4:CTAACTGTACTTCTCTTTGCTCGAA-CGACTTGTTACTTATTACAGTCTT

第五组：PVITF3-5:CGTGTAGTCGGTGGAAGA

PVITB3-5:AGCCGAAACTAACCATACC

PVITFIP-5:CGAGCAAAGAGAAGTACAGTTAGT-GATATGAAGTGTCTTGCGGTT

PVITBIP-5:AAGCATAGCGATTCTGACTTTAAGA-TTTCATTATTGCCGTGGC

第六组：PVITF3-6:AAGTGTCTTGCGGTTGAT

PVITB3-6:AGCCGAAACTAACCATACC

PVITFIP-6:TGCTTTTCGAGCAAAGAGAAGT-TTTCGAACTGACTGTGAGT

PVITBIP-6:AGCGATTCTGACTTTAAGACTGTAA-AAATACTATTTCATTATTGCCGTGG

第七组：PVITF3-7:GTTGATTTTCGAACTGACTGT

PVITB3-7:ATAAGCGCATTGTTTAGCC

PVITFIP-7:TCTTAAAGTCAGAATCGCTATGCTT-GAGTCCTTTTAAATGTACTAACTGT

PVITBIP-7:CTGTAATAAGTAACAAGTCGGCGA-GAAACTAACCATACCGCAAAT。

本实施例中，还提出一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，所述方法包括：

扩增反应：以待测样品的DNA作为扩增模板，采用所述LAMP引物，通过LAMP技术进行DNA的扩增反应，得到扩增产物；

检测：采用染色剂染色或电泳方式检测所述扩增产物，确定所述待测样品是否感染所述葡萄霜霉病菌。

所述扩增反应的体系为一25μl扩增反应的反应体系(即LAMP反应体系)；所述25μl扩增反应的反应体系(下表1)中包括：10×ThermoPol缓冲液2.5μl、40μM外引物0.5μl、100μM内引物1.4μl、25mM Mg²⁺6μl、10mM dNTPs2.5μl、8U Bst DNA Polymerase 1μl、5M甜菜碱(betaine)5μl。

表1 LAMP反应体系(25μl)

所述10×ThermoPol缓冲液包括：20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。

所述待测样品的DNA包括：葡萄潜伏侵染的叶片、或表现症状葡萄叶片、或葡萄霜霉病菌基因组的总DNA。

提取所述葡萄潜伏侵染的叶片总DNA的方法，包括：田间采集葡萄霜霉病病叶“拓贴”接种或配置孢子囊悬浮液喷雾接种于健康葡萄叶片，25℃，RH80％，保湿培养，待症状显示前，分别取8h、16h和24h的潜伏侵染叶片，称取0.1～0.5g，提取所述病叶总DNA。

提取所述表现症状葡萄叶片总DNA的方法，包括：田间采集不同发病时期葡萄霜霉病病叶，称取0.1～0.5g叶片，提取病叶总DNA。

提取所述葡萄叶片总DNA采用去糖去酚植物提取DNA试剂盒。

提取所述葡萄霜霉病菌基因组DNA的方法，包括：田间采集葡萄病叶或接种显症的病叶，刮取少量病菌菌丝体，提取所述病菌基因组DNA。

提取所述葡萄霜霉病菌基因组DNA的方法采用真菌基因组DNA试剂盒。

采用所述染色剂染色的方式检测所述扩增产物的方法，包括：在扩增产物中添加SYBR GreenΙ荧光染液，观察扩增产物的颜色变化，确定葡萄叶片是否感染葡萄霜霉病菌。

采用电泳方式检测所述扩增产物的方法，包括：对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，获得葡萄霜霉病菌基因扩增产物条带，确定样品是否感染所述病菌。

所述扩增反应中，采用所述LAMP引物的内引物和外引物的物质的量浓度比为内引物：外引物＝1:7。

所述扩增反应中，反应温度是62℃。

所述扩增反应中，反应时间为1h。

所述扩增反应中，Mg²⁺浓度为6mM。

本实施例中，根据所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，如图7所示，进行如下实验：

材料与试剂

葡萄霜霉病病叶、白粉病叶和灰霉病叶采自宁夏志辉-源石葡萄酒业有限公司、立兰酒庄、蒲尚酒庄、森淼兰月谷酒庄的葡萄园，葡萄霜霉病和白粉病叶经室内与健康葡萄叶片“拓贴”接种、培养，获得纯化菌株；葡萄灰霉病叶经组织分离、培养和获得纯化菌株；葡萄无菌组培苗叶片为对照。获得的葡萄病叶和纯化菌株分别用液氮速冻后保存于-80℃冰箱中备用。

主要试剂：

Bst DNA polymerase购自NEB公司；

Betaine购自上海生工生物工程有限公司；

MgSO4购自北京索莱宝科技有限公司；

植物DNA提取试剂盒，购自Omega Bio-tek公司；

真菌DNA提取试剂盒，购自Bio Flux公司；

胶纯化试剂盒，购自TIANGEN公司；

SYBR Green I购自上海瑞楚生物公司；

100bp DNA Ladder购自Trans Gen Biotech公司；

dNTP Mixture购自BBI公司；

Simple克隆载体，购自全式金公司。

引物特异性检测：

1.引物设计

首先从NCBI上下载葡萄霜霉菌的全基因组序列，使用Primer4.0(http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html)设计了多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引物的发夹结构、二聚体GC含量以及Tm值等综合因素选择了引物。引物组有4条引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)。所述引物参见SEQ ID NO.1～4。所有引物的信息见下表2。

表2引物序列SEQ ID NO.1～4的信息

2.DNA提取

田间采集葡萄霜霉病叶、白粉病病叶和葡萄灰霉病病果经表面消毒处理，保湿培养长出新霉层。“拓贴”接种于健康葡萄叶片，保湿培养纯化，待长出菌丝体，分别刮去菌丝少许，采用真菌DNA提取试剂盒，按照操作说明，分别提取葡萄霜霉病菌、白粉病菌、灰霉病菌基因组DNA，溶于30μl洗脱缓冲液中。提取的葡萄无菌组培苗DNA为对照，保存于-80℃冰箱中。

3.LAMP反应体系

反应体系(25μl)如下：10×ThermoPol缓冲液2.5μl[20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100]，引物(F3和B3)0.2μM，引物(FIP和BIP)1.4μM，dNTPs 1mM，MgCl 26mM，betaine 1M，Bst DNA polymerase(8U)1μl，模板DNA 1μl，补充ddH₂O至25μl。反应条件为：62℃恒温1h。

反应结束后，加入SYBR Green I荧光染液后，直接用肉眼或在蓝光仪下观察进行分析。肉眼观察葡萄霜霉菌阳性样品为嫩绿色，葡萄无菌组培苗对照、葡萄白粉病菌和灰霉病菌均为橙色。蓝光仪下葡萄霜霉菌阳性样品带荧光，其它样品不带荧光。

常规PCR和LAMP检测田间样品：

参照秦文韬等的两对引物(真菌16S rDNA-ITS和Cox基因序列)用常规PCR测序的方法和LAMP两种方法检测了多个田间酿酒葡萄样品，结果两种方法的检测结果差别很大，16S rDNA-ITS基因序列特异性较差，无法区分田间葡萄白粉病、霜霉病和灰霉病等样品；Cox基因序列特异性相对较高，但对葡萄白粉病样品的检测会出现假阳性，且不能直观获得检测结果。与常规PCR方法相比，LAMP方法的特异性和准确性明显的要高很多，LAMP检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，适于基层实验室进行快速检测，而且具有快速高效、高特异性的特点，其应用范围会越来越广泛。

葡萄霜霉病潜育期样品检测：

目前有关葡萄霜霉病菌侵入潜伏期分子检测方法还较少，本发明为检测葡萄霜霉病潜伏期病原提供了一种有效方法。实验采用“拓贴”接种，在湿度95％下保湿培养，取不同时间段的葡萄霜病叶样品进行LAMP检测，直至症状出现。该检测方法为田间葡萄霜霉病菌的快速检测和早期诊断提供了新的手段，通过田间初始菌量的测定，也为葡萄霜霉病的监测预警提供理论依据。

本发明根据葡萄霜霉病菌ITS序列(Genbank登录号DQ665668)设计了LAMP引物，与秦文韬建立的LAMP方法相比，一是引物种间特异性、准确性高，能分别检测到被霜霉病菌感染的酿酒葡萄和鲜食葡萄样品，而秦文韬建立的LAMP方法未检测到酿酒葡萄样品的霜霉病菌；二是合成引物成本低，本发明的LAMP方法仅设计4条引物，而秦文韬建立的LAMP方法设计5～6条引物，包括1～2条环引物。

本文虽然已经给出了本发明的几个实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

另附序列表文本

序列号18、23、39、46：：人工序列的说明：LAMP引物。

序列表

<110> 申请人名称：宁夏大学

<120> 一种LAMP引物及检测葡萄霜霉病菌的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> PVITF3-1

<400> 1

cgtgaaccgt ttcaacca 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> PVITF5-1

<400> 2

gtatctagta aaagcgaaga ctt 23

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> PVITFIP-1

<400> 3

atccattagc tgcaaccgcc agttggggat gaaataggc 39

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> PVITBIP-1

<400> 4

agtttggaat ttattccgag ctagtcgtcc tcacagtata atcagt 46

Claims (10)

1.一种LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括：外引物和内引物；

所述外引物包括：

PVITF3-1：5′-CGTGAACCGTTTCAACCA-3′；

PVITF5-1：5′-GTATCTAGTAAAAGCGAAGACTT-3′；

所述内引物包括：

PVITFIP-1：5’-ATCCATTAGCTGCAACCGCC-AGTTGGGGATGAAATAGGC-3’；

PVITBIP-1：5’-AGTTTGGAATTTATTCCGAGCTAGT-CGTCCTCACAGTATAATCAGT-3’。

2.一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述方法包括：

扩增反应：以待测样品的DNA作为扩增模板，采用权利要求1所述LAMP引物，通过LAMP技术进行DNA的扩增反应，得到扩增产物；

检测：采用染色剂染色或电泳方式检测所述扩增产物，确定所述待测样品是否感染所述葡萄霜霉病菌。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述扩增反应的体系为一25μl扩增反应的反应体系；

所述25μl扩增反应的反应体系中包括：10×ThermoPol缓冲液2.5μl、40μM的所述外引物0.5μl、100μM的所述内引物1.4μl、25mM的Mg²⁺6μl、10mM的dNTPs 2.5μl、8 U Bst DNAPolymerase 1μl、5M甜菜碱5μl。

4.根据权利要求3所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述10×ThermoPol缓冲液包括：20mM Tris-HCl，10mM KCl，2mM MgSO₄，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。

5.根据权利要求2所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述待测样品的DNA包括：葡萄霜霉病菌潜育侵染的叶片、或表现症状的葡萄叶片、或葡萄霜霉病菌基因组的总DNA。

6.根据权利要求5所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，提取所述葡萄霜霉病菌潜育侵染的叶片总DNA的方法，包括：田间采集葡萄霜霉病病叶“拓贴”接种或配置孢子囊悬浮液喷雾接种于健康葡萄叶片，25℃，RH80％，保湿培养，待症状显示前，分别取8h、16h和24h的潜伏侵染叶片，称取0.1～0.5g，提取所述病叶总DNA。

7.根据权利要求5所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，提取所述表现症状葡萄叶片总DNA的方法，包括：田间采集不同发病时期葡萄霜霉病病叶，称取0.1～0.5g叶片，提取病叶总DNA。

8.根据权利要求5所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，提取所述葡萄霜霉病菌基因组DNA的方法，包括：田间采集葡萄病叶或接种显症的病叶，刮取少量病菌菌丝体，提取所述病菌基因组DNA。

9.根据权利要求2所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，采用所述染色剂染色的方式检测所述扩增产物的方法，包括：在扩增产物中添加SYBR GreenΙ荧光染液，观察扩增产物的颜色变化，确定葡萄叶片是否感染葡萄霜霉病菌。

10.根据权利要求2所述的一种快速检测葡萄霜霉病菌的方法，其特征在于，所述扩增反应中，采用所述LAMP引物的内引物和外引物的物质的量浓度比为内引物：外引物＝1:7。