CN111534627A

CN111534627A - 与葡萄霜霉病抗性相关的qtl位点、snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN111534627A
Application number: CN202010334462.2A
Authority: CN
Inventors: 卢江; 傅佩宁; 吴伟; 宋士任; 彭亚纯; 高宇
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN111534627B

Abstract

本发明公开了与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点、SNP分子标记，其中，所述QTL位点包括Rpv22、Rpv23、Rpv24，所述Rpv22与np2464紧密连锁，位于2号染色体3396582bp；所述Rpv23与np21022紧密连锁，位于15号染色体11901515bp；所述Rpv24与np1766紧密连锁，位于18号染色体11950432bp。还公开了其在抗霜霉病品种选育中的应用。本发明提供的各SNP分子标记间平均遗传距离仅为0.35cM，距离小，且筛选出的SNP分子标记均与葡萄霜霉病的性状紧密连锁、显著相关，可用于分子标记辅助选择育种，在葡萄霜霉病性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

Description

与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点、SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点、SNP分子标记及应用。

背景技术

霜霉菌(Plasmopara viticola(Berk.&Curtis.)Berl et de Toni)引起的霜霉病可以侵染葡萄多个器官，侵染部位以叶片为主，个别情况下也会侵染果实和新梢等其它部位，发病严重时可以造成叶片干枯脱落、果实变软易碎、嫰梢卷须死亡，给全世界葡萄产业造成了巨大的损失，在大部分产区均为葡萄第一大病害。

霜霉菌的防治主要采用喷施化学药剂的方法。众所周知，化学药品对环境安全、食品安全以及人类的安全都有很大的潜在风险，而频繁使用化学药剂也容易造成霜霉菌的耐药性，给病害防治带来更大的难度。

选育抗霜霉病的新品种可以从根本上解决这一问题。传统葡萄育种一般需要10-15年，而且新品种的选育多是以选育者的主观判断为标准，具有很大的不稳定性。定位抗性QTL(数量性状基因座位，quantitative trait locus)，从中挖掘与抗病性连锁的分子标记并应用于辅助筛选育种可以在苗期对杂交后代进行筛选，提高筛选的效率，同时利用不同分子标记靶向选育含有不同抗性种质的新品种，则可以大大加快育种速度。

发明内容

本发明提供了与葡萄霜霉病抗性相关的QTL、SNP(单核苷酸的多态性)分子标记及应用，可以用于抗霜霉病辅助筛选育种，加快新品种选育的速度与精度。

本发明公开的与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点，包括Rpv22、Rpv23、Rpv24，所述Rpv22位于2号染色体3396582bp，所述Rpv23位于15号染色体11901515bp，所述Rpv24位于18号染色体11950432bp。

本发明公开了上述与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点在抗霜霉病品种选育中的应用，能够显著提高抗霜霉病品种的选择效率，在葡萄霜霉病性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

本发明公开了与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为np2464，位于2号染色体3396582bp，其碱基为C或T，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CT，其中碱基T是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv22与所述np2464紧密连锁。

本发明还公开了用于扩增该SNP分子标记的引物，所述扩增引物为：

1-F：CGCGTCCCTGATGATCCACG，如SEQ ID NO.1所示；

1-R：AACAACCAGCCATGACCCAC，如SEQ ID NO.2所示。

本发明公开了与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为np21022，位于15号染色体11901515bp，其碱基为C或G，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv23与所述np21022紧密连锁。

2-F：GGTTCAAGCCATGAGACAAG，如SEQ ID NO.3所示；

2-R：CATATTGATGCTCTGGGACA，如SEQ ID NO.4所示。

本发明公开了与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，所述SNP分子标记为np1766，位于18号染色体11950432bp，其碱基为T或G，在‘赤霞珠’中碱基类型为TT，在‘双红’中碱基类型为TG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv24与所述np1766紧密连锁。

3-F：ACAAGTCGCAACCAATGTGG，如SEQ ID NO.5所示；

3-R：AAGGTGGGTCCAGGAGGAAT，如SEQ ID NO.6所示。

本发明还公开了上述SNP分子标记在抗霜霉病品种选育中的应用，能够显著提高抗霜霉病品种的选择效率，在葡萄霜霉病性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果具体体现在：

本发明提供的一种与葡萄霜霉病相关的QTL位点，总遗传距离1898.09cM，各SNP分子标记间平均遗传距离仅为0.35cM，距离小，且筛选出的SNP分子标记np2464、np21022、np1766均与葡萄霜霉病的性状紧密连锁、显著相关，可用于分子标记辅助选择育种，能够显著提高抗霜霉病品种的选择效率，在葡萄霜霉病性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

当子代中含有本发明确定的与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点时，其抗霜霉病水平可以达到抗性亲本‘双红’对霜霉病抗性水平的75～95％。因此，利用本发明的QTL位点筛选杂交群体后代可以快速地找到抗性单体，加快育种速度。

附图说明

图1为‘赤霞珠’×‘双红’杂交群体融合遗传图谱，单位为cM。

图2为SNP分子标记在遗传图谱和参考基因组物理图谱上位置线性关系图，其中，X轴代表SNP分子标记在遗传图谱上的位置，单位是cM；Y轴代表SNP标记在物理图谱上的位置，单位是Mbp。

图3为葡萄叶盘抗霜霉菌等级分类标准图。

图4为杂交群体霜霉病抗性表型图。

图5为‘赤霞珠’×‘双红’群体霜霉病抗性QTL定位结果图。

图6为抗霜霉病QTL区域SNP单体型与霜霉病抗性连锁关系分析图。

图7为杂交后代QTL数量与霜霉病抗性能力的对应关系图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，有必要指出的是，本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，并不能理解为对本发明保护范围的界定。

实施例1

本实施例提供的与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点，包括Rpv22、Rpv23、Rpv24，所述Rpv22位于2号染色体3396582bp，所述Rpv23位于15号染色体11901515bp，所述Rpv24位于18号染色体11950432bp。

其中：所述Rpv22与第一SNP分子标记紧密连锁，所述第一SNP分子标记位于2号染色体3396582bp，其碱基为C或T，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CT，其中碱基T是抗性筛选的标志碱基，所述第一SNP分子标记为np2464；

所述Rpv23与第二SNP分子标记紧密连锁，所述第二SNP分子标记位于15号染色体11901515bp，其碱基为C或G，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述第二SNP分子标记为np21022；

所述Rpv24与第三SNP分子标记紧密连锁，第三SNP分子标记位于18号染色体11950432bp，其碱基为T或G，在‘赤霞珠’中碱基类型为TT，在‘双红’中碱基类型为TG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述第三SNP分子标记为np1766。

上述QTL位点和SNP分子标记具体由以下步骤获得：

一、遗传图谱的构建：

S1、利用抗病葡萄品种‘双红’与感病葡萄品种‘赤霞珠’杂交获得230粒种子，低温砂藏后萌芽151粒种子，经炼苗和真杂种鉴定之后获得91株杂交后代。

S2、利用CTAB方法提取杂交后代和亲本高质量gDNA；

S3、采用简化基因组测序技术对步骤S1的母本(赤霞珠)、父本(双红)及杂交后代进行简化基因组测序:

(1)选择限制性内切酶MseI和HaeII对每份gDNA在37℃环境下双酶切2h，酶切体系如下：

(2)80℃温育20min后，将样品转入冰上，使MseI和HaeII充分失活。

(3)在酶切后片段两边加接头1和接头2：

接头1与MseI酶切后的粘性末端连接，序列如下：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTxxxxxxT；

3’-TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAyyyyyyAAT；

接头2与HaeII酶切后的粘性末端连接，序列如下：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTxxxxxxRGGGC；

3’-GTTCGTCTTCTGCCGTATGCTCTACACTGACCTCAAGTCTGCACACGAGAAGGCTAGAyyyyyyY；

其中x和y代表六碱基条型码序列，与每一个单株所连接的接头携带的条形码各不相同，用于建库以后区分测序片段来源的个体。

(4)建库：每个个体连接完接头后的反应液分别取5μL，混匀，用

PCR&DNA Cleanup Kit试剂盒回收核酸，回收后的混合样品用50μL ddH₂O溶解完全，备用。

(5)PCR扩增：

PCR反应体系：

PCR扩增程序：

(6)利用琼脂糖凝胶回收400-425bp范围内的PCR扩增产物。

(7)委托诺禾致源生物信息科技有限公司利用Illumina 2500(Illumina,SanDiego,CA,USA)对回收产物进行19×深度PE150测序。

(8)按照条形码信息将测序获得的原始数据分配到每一个个体，删除接头序列。经过Illumina PE150测序，‘赤霞珠’和‘双红’中分别得到6649322和6737808个RAW reads，子代RAW reads平均数为3528224。删除含有未知碱基数量超过reads长度10％的reads，删除含有低质量碱基(Q≤5)数量超过reads长度50％的reads。通过过滤低质量Reads，‘赤霞珠’和‘双红’分别保留了6647794和6736292个Clean reads，子代平均Clean reads数为3509609.89。Clean reads的有效利用率在亲本和杂交子代中均能达到99.97％以上。

为确保所测序碱基的正确性，分析了碱基识别错误水平在1％(Q20)和0.1％(Q30)之下的碱基数量占总碱基数量的比例。如表1所示，‘赤霞珠’中Q20和Q30的比例分别为96.78％和91.86％，‘双红’中Q20和Q30的比例分别达到96.91％和92.16％；子代平均Q20达到95.50％，平均Q30达到89.12％。

表1测序数据基本信息

(9)将过滤后的测序数据与已经测序的葡萄品种‘PN40024’基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/401)比对，具体比对步骤如下：

(a)使用BWA比对软件(参数：mem-t 4-k 32-M-R)，将亲本和子代数据与参考基因组进行比对，将比对后结果利用SAMtools转换成SAM/BAM files，随后采用诺禾致源生物信息科技有限公司内部Perl脚本统计比对率和覆盖度，最后使用SAMtools对比对结果进行排序(参数：sort)，用于变异检测。

(b)对BWA比对结果进行过滤，将比对到‘PN40024’基因组上唯一位置的reads挑选出来，进行后续分析，可以发现：‘赤霞珠’和‘双红’中分别有97.98％和96.31％的Cleanreads可以比对到参考基因组上；子代可以比对到参考基因组上的Reads数量占总的Cleanreads数量的比例分布平均比例达到96.97％。通过计算比对到参考基因组上的Reads含有的碱基数量与参考基因组被覆盖区域总碱基数的比值，由表1可知，平均测序深度在‘赤霞珠’和‘双红’中分别达到98.56X和128.08X；子代平均覆盖深度达到81.11X。

综合以上数据，PE150测序所得数据绝大多数都为高质量数据，且测序深度足够高，可以进行下一步SNP分子标记开发工作。

S4、采用GATK(-type UnifiedGenotyper)对过滤后的bam文件进行群体SNP分子标记的检测，为减少测序错误造成的假阳性SNP分子标记，亲本要求SNP碱基支持数不少于10个，子代要求SNP碱基支持数不少于4个。

基于亲本基因型检测结果，分析亲本间具有多态性SNP分子标记，过滤掉父母本都为纯和的SNP分子标记(例如在‘赤霞珠’中基因型为‘GG’，在‘双红’中基因型为‘AA’的标记)，将其余标记分为7种多态类型：ab×cd、ab×cc、cc×ab、ef×eg、hk×hk、lm×ll和nn×np。

参照亲本SNP多态性分析结果，分析SNP分子标记在子代中分布，并丢掉以下不符合要求的标记：

1)异常碱基过滤：在子代中出现亲本没有的碱基类型(例如：某个SNP分子标记在亲本中基因型分别为‘AA’和‘TT’，而某些子代中出现‘A’和‘T’之外的碱基)。

2)完整度过滤：采用0.90的完整度过滤标记，即100个子代中至少需要有90个子代有确定基因型的标记。

3)偏分离标记过滤：偏分离标记会影响图谱构建的精度以及后续QTL定位的准确性，因此采用卡方检验，对标记进行过滤，偏分离阈值为0.05。

如表2所示，基于‘赤霞珠’与‘双红’SNP基因型检测结果，在亲本之间共开发出344782个SNP分子标记。其中，hk×hk、lm×ll和nn×np三种类型标记总共有231287个，数量最多，被用作后续分析。

表2 SNP标记分类汇总

经过完整度>0.9过滤和偏分离p>0.5筛选，保留27380个SNP分子标记。随后将相似度为1的标记只保留一个，经过筛选后保留7597个SNP分子标记。最后，在连锁群计算的时候设定LOD阈值为6，将不能和其他标记归到一起的SNP分子标记丢掉，共有5603个SNP分子标记被最终保留下来构建遗传图谱。

S5、利用JoinMap4.0软件构建‘赤霞珠’×‘双红’杂交群体高密度融合遗传图谱，经过计算，5603个SNP分子标记分成19个连锁群(如图1所示)，遗传距离采用Kosambi函数计算，总遗传距离为1898.09cM，标记间平均遗传距离为0.35cM(如表3所示)。将构建好的遗传图谱与参考基因组进行共线性分析，发现19条连锁群均呈现较好的共线性(如图2所示)，由此可见，本实施例构建了高密度的遗传图谱，可以用于下一步QTL定位。

表3‘赤霞珠’×‘双红’杂交群体融合遗传图谱详细信息

二、抗霜霉病QTL位点分析：

S1、在5月上旬从亲本及每个单株上采集第5-6片完全展开的嫩叶；取回后用无菌水冲洗2遍，将叶表面杂质洗净后用打孔器将洗净后叶片分离成直径1cm的叶盘；将灭过菌的滤纸平铺到一次性无菌培养皿上，并用无菌水打湿；每个单株采集16个叶盘，并将叶盘背面朝上摆放在盛有湿润滤纸的培养皿上，然后用无菌滤纸将叶盘背面水分吸净；将霜霉菌孢子囊浓度调成105个/mL，然后在每个叶盘上滴20微升；在22℃，12h/12h光周期条件下培养24小时后将菌液吸掉，然后继续培养；接菌后4-6天分别拍照用作后续评价霜霉菌抗性。

为评价霜霉菌的抗性表型，采用孢子囊密度法(Sporulation Density，SPD)评价离体叶盘霜霉病抗性。如图3所示，所有叶盘霜霉病抗性被分成5个等级(1、3、5、7及9)：1代表叶盘上孢子囊密度非常高，透过菌斑完全无法看到叶片；3代表叶盘孢子囊密度很高，但透过菌斑隐约能看到一点叶片；5代表孢子囊密度中等，透过长菌部位能清晰的看到叶片；7代表孢子囊密度很低，在叶片上只有零零散散几个地方有菌；9代表孢子囊密度极低或者没有孢子囊。每个单株的抗性表型值均用16个叶盘的平均值代表。

如图4所示，经过2014-2016连续3年的表型统计，发现杂交后代对霜霉病抗性在每一年均呈现连续分布，这表明该群体霜霉病抗性表型是由QTL决定的。

S2、分析遗传图谱和S1鉴定的抗霜霉病表型，采用MapQTL6.0进行QTL位点分析，在2号、15号和18号连锁群上分别得到1个与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点，这3个QTL位点分别被命名为Rpv22、Rpv23和Rpv24。

三、SNP分子标记的分析：

S1、将杂交后代按照QTL区域SNP分子标记单体型进行分类并计算抗性平均值，两部分抗性平均值的差值大小即视为该SNP分子标记与抗霜霉病的连锁能力。

由图6可知，在Rpv22内共包含5个SNP分子标记，其中np2464连锁能力最强；在Rpv23内共包含36个SNP分子标记，其中np21022连锁能力最强；在Rpv24内共包含8个SNP分子标记，其中np1766连锁能力最强。

经过分析测序原始数据，np2464位于2号染色体3396582bp位置，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CT，其中碱基T是抗性筛选的标志碱基；np21022位于15号染色体11901515bp位置，在‘赤霞珠’中碱基类型为CC，在‘双红’中碱基类型为CG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基；np1766位于18号染色体11950432bp位置，在‘赤霞珠’中碱基类型为TT，在‘双红’中碱基类型为TG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基；这3个SNP分子标记的抗性碱基可以分别作为各自QTL位点的筛选标记用于后续分析。

S2、将3个SNP分子标记(np2464、np21022和np1766)结合到一起在子代中分析3个QTL位点与霜霉病抗性的对应关系，由图7可知，当子代同时含有这3个QTL位点时，抗霜霉病水平可以达到抗性亲本‘双红’对霜霉病抗性水平的75～95％。这表明利用这3个QTL位点筛选杂交群体后代可以迅速的找到抗性单株，加快育种速度。

综上所述，本实施例基于GBS技术筛选获得大量带有基因序列的SNP分子标记，利用这些标记位点构建了高密度分子遗传图谱，并对葡萄霜霉病抗性进行定位研究，获得了与葡萄霜霉病抗性相关的功能标记，这表明本实施例获得的与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点、SNP分子标记在葡萄霜霉病性状分子标记辅助育种中具有良好的应用前景。

实施例2SNP分子标记的验证

所述np2464的扩增引物为：

1-F：CGCGTCCCTGATGATCCACG，如SEQ ID NO.1所示；

1-R：AACAACCAGCCATGACCCAC，如SEQ ID NO.2所示。

所述np21022的扩增引物为：

2-F：GGTTCAAGCCATGAGACAAG，如SEQ ID NO.3所示；

2-R：CATATTGATGCTCTGGGACA，如SEQ ID NO.4所示。

所述np1766的扩增引物为：

3-F：ACAAGTCGCAACCAATGTGG，如SEQ ID NO.5所示；

3-R：AAGGTGGGTCCAGGAGGAAT，如SEQ ID NO.6所示。

以父本(‘双红’)和母本(‘赤霞珠’)的基因组DNA为模板，利用上述扩增引物进行PCR扩增，PCR反应体系和PCR扩增程序如下：

PCR反应体系：

PCR扩增程序：

通过对扩增产物进行测序可知，引物1-F和1-R扩增得到的母本和父本扩增产物的测序序列如下所示：

母本扩增序列，如SEQ ID NO.7所示；

父本扩增序列，如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

所述np2464为母本扩增序列自5’端起第123位碱基和父本扩增序列SEQ ID NO.8自5’端起第121位碱基，SEQ ID NO.9自5’端起第126位碱基，所述np2464在母本中碱基类型为CC，在父本中碱基类型为CT，其中碱基T是抗性筛选的标志碱基。

引物2-F和2-R扩增得到的母本和父本扩增产物的测序序列如下所示：

母本扩增序列，如SEQ ID NO.10所示；

父本扩增序列，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

所述np21022为母本扩增序列自5’端起第347位碱基和父本扩增序列自5’端起第347位碱基，所述np21022在母本中碱基类型为CC，在父本中碱基类型为CG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基。

引物3-F和3-R扩增得到的母本和父本扩增产物的测序序列如下所示：

母本扩增序列，如SEQ ID NO.13所示；

父本扩增序列，如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。

所述np1766为母本扩增序列自5’端起第198位碱基和父本扩增序列自5’端起第198位碱基，所述np1766在母本中碱基类型为TT，在父本中碱基类型为TG，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基。

上述是结合实施例对本发明作详细说明，但是本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何在本发明专利核心指导思想下所作的改变、替换、组合简化等都包含在本发明专利的保护范围之内。

序列表

<120> 与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点、SNP分子标记及应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcgtccctg atgatccacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacaaccagc catgacccac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttcaagcc atgagacaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catattgatg ctctgggaca 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaagtcgca accaatgtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaggtgggtc caggaggaat 20

<210> 7

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcgtccctg atgatccacg tagttgccaa atggatggac gcacgatctc aaccaatata 60

gattcttgat tcagtcgttc cacctgcaaa aggcgtccgg acggggtgtc cggacgcacc 120

ctccgatggt tttgtcagcc atggttcaga gagagagaga taaattagtt agccttttac 180

taggtatagc aagcttacct tcttccttgt gtgaaggttc atatatatag tctcagaagc 240

tttgttcccc tctttaatgg tggggagata ttttgtgttg tcatgatgac actaggtggt 300

ggtagggcca tcatcaccct acgggcggct gacaaagatc atggtagttg ctgcgattgt 360

cagaaaccgt gggaagtgat tgtaagaagt gacttgtcgt cacttcattc ttgtcctttc 420

accctatagg tagcggaacg tgggtcatgg ctggttgtt 459

<210> 8

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcgtccctg atgatccacg tagttgccaa atggatggac gcacgctctc aatcaatata 60

gagtcctggt tctatcgtcc ctgcaaaagg tgtccggaca gggtgtccgg acacatcctc 120

tgatgatttt gtcagtcatg gttagagaga tatggctcag ttggcctttt actaggtata 180

gcaagcttac cttcctcttt gtgtgaaggt tcatatatat agtaccagaa gccttgtttc 240

cctctttaat ggtagagaga tattttgggt tgtcatgatg acactaggtg gtggcagggc 300

catcatcacc ctacgggcgg ctgacagaga tcgtgggagg cgctgagatt gtcaaagatc 360

gtgggaagtg acttgccgtc acttcattcc tgtcctttca ctctgcaggt ggcggaacgt 420

gggtcatggc tggttgtt 438

<210> 9

<211> 458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcgtccctg atgatccacg caactgccag atggaggaac acgcaatctc aacacacaag 60

ggttcttgat ccagttgttg tacctgcaaa aagggcgtcc ggacagggtg tccgggcaca 120

ccctccgatg gttttgttag ccatggtaag agagggagat atctgagaca gttggacttt 180

tactaggtat cagaagatta cccgccaacc cactcttctt cgtgtgaagg cttatatata 240

cagcttcagg ggcactgttc ctctcattaa tggtgaggag atattttatg ttgttatgat 300

gacaacaagt ggtagcagag acatcatcac cctataggcg gctgtcagga accatagtag 360

gtgatgcggc cgtcagagat cgtgagaagt gacttgctgt cacttcatct tgtcttctct 420

ctctgcaggt gataggatgt gggtcatggc tggttgtt 458

<210> 10

<211> 522

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggttcaagcc atgagacaag attatcatta aagaacttag tttgagggtc atttcatggg 60

cataagggag gtcccaagga cccccttttc catagcctaa gccactactc aaaaagcatg 120

gattcaacac taaagtataa aaagctaagt gtggaatcat tgccagtaaa atccaaattt 180

aaggtttaaa gttatacaaa aatgaagggg aactatagct aaatgaagat acaaccaata 240

tgaaagtttg taagacatcc aagtcactta aaacatccaa aacattacaa agttctaagt 300

tgcaacaata cttcccaagg ttgaaggttg aagaatagct ccccatcaag ggacccccta 360

gtccatgtcc atcaagtcca aaatggacat ttataggttt ttttgggttg acctaagtgg 420

taggccacgt gaaggtataa aaagcaaggt ggagatttga ttgtgagcta ggaagggtct 480

aaaaaaagtg gtaggcttgt gctgtcccag agcatcaata tg 522

<210> 11

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggttcaagcc atgagacaag attatcatta aagaacttag tttgagggtc atttcatggg 60

cataagggag gtcccaagga cccccttttc catggcctaa gccactactc aaaaagcatg 120

gattcaacac taaagtataa aaagctaagt gtggaatcat tgccattaaa atccaaattt 180

aaggtttaaa gttatgcaaa aatgaagggg aactatagct aaatgaagat acaaccaata 240

tgaaagtttg taagacatcc aagtcactta aaacatccaa aacattacaa agttctaagt 300

tgcaataata gttcccaagg ttgaaggttg aagaatagct ccccatgaag ggacccccta 360

gtccatgtcc atcaagtcca aaatggacat ttataggttt ttttcggttg acctaagtgg 420

taggccatgt gaaggtataa aaaagcaagg tggagatttg attatgagct aggaagggtc 480

taaaaaaagt ggtaggcttg tgctgtccca gagcatcaat atg 523

<210> 12

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggttcaagcc atgagacaag attatcatta aagaacttag tttgagggtc atttcatggg 60

cataagggag gtcccaagga cccccttttc catggcctaa gccactactc aaaaagcatg 120

gattcaacac taaagtataa aaagctaagt gtggaatcat tgccattaaa atccaaattt 180

aaggtttaaa gttatgcaaa aatgaagggg aactatagct aaatgaagat acaaccaata 240

tgaaagtttg taagacatcc aagtcactta aaacatccaa aacattacaa agttctaagt 300

tgcaataata gttcccaagg ttgaaggttg aagaatagct ccccatcaag ggacccccta 360

gtccatgtcc atcaagtcca aaatggacat ttataggttt ttttcggttg acctaagtgg 420

taggccatgt gaaggtataa aaaagcaagg tggagatttg attatgagct aggaagggtc 480

taaaaaaagt ggtaggcttg tgctgtccca gagcatcaat atg 523

<210> 13

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acaagtcgca accaatgtgg ggggagtatc tactgtctat ctatagcaat cggcgcgaca 60

cctcacaatg ttggattcca atttccagca ctttaaatcg gaacacaaac gccggtccca 120

gatccacact tcttagcctc agatttcatc aatctaaatt ctttaacata attaaaaaga 180

tactacagtg ttgttattct agtgcttgtg gcttgctcaa tcatttttat ggggatttgg 240

aatatggtgc aagtacattc cattcgcacc atgtacttat gattggtatt ccattttgct 300

gctcccaatt gtattctatc aataaaaaga aaaaaaaata caaaaaccag atccatatca 360

gtggaatcaa aatctttatc aacacccccc accatcaggt atggggcttc tttcacaaac 420

accccatatt cctcctggac ccacctt 447

<210> 14

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acaagtcgca accaatgtgg ggggagtatc tactgtctat ctatagcaat cggcgcgaca 60

cctcacaatg ttggattcca atttccagca ctttaaatcg gaacacaaac gccggtccca 120

gatccacact tcttagcctc agatttcatc aatctaaatt ctttaacata attaaaaaga 180

tactacagtg ttgttattct agtgcttgtg gcttgctcaa tcatttttat ggggatttgg 240

aatatggtgc aagtacattc cattcgcacc atgtacttat gattggtatt ccattttgct 300

gctcccaatt gtattctatc aataaaaaga aaaaaaaata caaaaaccag atccatatca 360

gtggaatcaa aatctttatc aacacccccc accatcaggt atggggcttc tttcacaaac 420

accccatatt cctcctggac ccacctt 447

<210> 15

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acaagtcgca accaatgtgg ggggagtatc tactgtctat ctatagcaat cggcgcgaca 60

cctcacaatg ttggattcca atttccagca ctttaaatcg gaacacaaac gccggtccca 120

gatccacact tcttagcctc agatttcatc aatctaaatt ctttaacata attaaaaaga 180

tactacagtg ttgttatgct agtgcttgtg gcttgctcaa tcatttttat ggggatttgg 240

aatatggtgc aagtacattc cattcgcacc atgtacttat gattggtatt ccattttgct 300

gctcccaatt gtattctatc aataaaaaga aaaaaaaata caaaaaccag atccatatca 360

gtggaatcaa aatctttatc aacacccccc accatcaggt atggggcttc tttcacaaac 420

accccatatt cctcctggac ccacctt 447

Claims

1.与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点，其特征在于：所述QTL位点包括Rpv22、Rpv23、Rpv24，所述Rpv22位于2号染色体3396582bp，所述Rpv23位于15号染色体11901515bp，所述Rpv24位于18号染色体11950432bp。

2.权利要求1所述的与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点在抗霜霉病品种选育中的应用。

3.与权利要求1所述的葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为np2464，位于2号染色体3396582bp，其碱基为C或T，其中碱基T是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv22与所述np2464紧密连锁。

4.与权利要求1所述的葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为np21022，位于15号染色体11901515bp，其碱基为C或G，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv23与所述np21022紧密连锁。

5.与葡萄霜霉病抗性相关的QTL位点的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记为np1766，位于18号染色体11950432bp，其碱基为T或G，其中碱基G是抗性筛选的标志碱基，所述Rpv24与所述np1766紧密连锁。

6.根据权利要求3-5任一项所述的SNP分子标记在抗霜霉病品种选育中的应用。

7.用于扩增权利要求3所述的SNP分子标记的引物，其特征在于，所述扩增引物为：

1-F：CGCGTCCCTGATGATCCACG，如SEQ ID NO.1所示；

1-R：AACAACCAGCCATGACCCAC，如SEQ ID NO.2所示。

8.用于扩增权利要求4所述的SNP分子标记的引物，其特征在于，所述扩增引物为：

2-F：GGTTCAAGCCATGAGACAAG，如SEQ ID NO.3所示；

2-R：CATATTGATGCTCTGGGACA，如SEQ ID NO.4所示。

9.用于扩增权利要求5所述的SNP分子标记的引物，其特征在于，所述扩增引物为：

3-F：ACAAGTCGCAACCAATGTGG，如SEQ ID NO.5所示；

3-R：AAGGTGGGTCCAGGAGGAAT，如SEQ ID NO.6所示。