CN109486960B

CN109486960B - 一种应用rpa技术检测杉并根结线虫的方法、rpa引物及试剂盒

Info

Publication number: CN109486960B
Application number: CN201811300658.9A
Authority: CN
Inventors: 方亦午; 顾建锋; 刘乐乐; 陈先锋
Original assignee: NINGBO ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY FOR INSPECTION AND QUARANTINE
Current assignee: NINGBO ACADEMY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY FOR INSPECTION AND QUARANTINE
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2018-11-02
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: CN109486960A

Abstract

本发明提供了一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物及包含该RPA引物的RPA试剂盒，所述RPA引物的序列如下：上游引物MSRPAF：5'‑TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG‑3'；下游引物MSRPAR：5'‑ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT‑3'。本发明还提供了利用RPA试剂盒来检测杉并根结线虫的方法，可以检测单个或者混合杉并根结线虫DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好，可以对进境种苗中的杉并根结线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种的入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

Description

一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一套利用重组酶聚合酶等温扩增技术检测杉并根结线虫的引物及方法。

技术背景

根结属线虫(Meloidogyne Goeldi，1887)为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。

我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定。

杉并根结线虫Meloidogyne suginamiensis，这是我国口岸首次截获该种线虫。目前，全球仅日本已报道发现该种线虫，其他国家未有确切报道。该种线虫寄主较广，包括桑树、榆树、樱花、黄瓜、辣椒等20多种木本和草本植物，潜在危害显著，还是日本桑树最重要的病原线虫之一。

随着我国经济发展和生态需求，进境种苗数量快速增长，各种外来生物有可能随之入侵。要防止其入侵，首先必须进行准确鉴定，传统上根结线虫的检测和鉴定主要基于形态学、同工酶技术以及PCR技术，这些技术对操作人员的专业素质要求高，需要高级显微镜、PCR仪等昂贵仪器，且耗时长，难以应用于口岸快速诊断。

重组酶聚合酶等温扩增技术RPA(Recombinase Polymerase Amplifcation)是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术可以在37℃至42℃的恒温条件下，利用1对引物在短时间内实现核酸靶标片段的快速扩增，相比另一种环等温扩增扩增技术LAMP，其反应时间更短，反应温度低，且扩增后产生单一目的条带，具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒。

本发明根据通过比对不同根结线虫基因组多拷贝序列和杉并根结线虫基因组中多拷贝序列中特异性位点和非特异性位点进行分析，设计并筛选出一套利用RPA特异性检测爪哇根结线虫的引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以杉并根结线虫的DNA为模板，苹果根结线虫、山茶根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫、花生根结线虫、西班牙根结线虫、北方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行RPA检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明采用的技术方案是：

应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物，所述引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'-TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'-ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

进一步，本发明还提供一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，所述试剂盒中的RPA引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'-TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'-ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

进一步，所述应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，RPA冻干酶粉适量，280mM的MgAc溶液2.5μL，ddH₂O 12.2μL。

所述RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物，以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中。

本发明的RPA扩增反应在RPA反应管中进行。RPA反应管和反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号

Basic kit。

即，所述应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，280mM的MgAc溶液2.5μL，ddH₂O 12.2μL，含有RPA冻干酶粉的RPA反应管，RPA扩增反应在RPA反应管中进行。

本发明还提供一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法，所述方法为：

提取待测线虫样品的DNA作为模板，利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现145bp的特异DNA条带，则待测线虫为杉并根结线虫，反之则否。

所述RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟。

进一步，所述应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法包括以下步骤：

(1)提取待测线虫样品的DNA作为模板；

(2)利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA扩增，RPA扩增的反应体系如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4PA，待测DNA模板1板A，RPA冻干酶粉适量，280mM的MgAc溶液2.5μL，ddH₂O 12.2μL；

RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟；

(3)RPA扩增产物进行电泳检测：取出RPA扩增产物5μL，用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在145bp处出现扩增条带的为杉并根结线虫，反之则否。

所述步骤(1)中，提取待测线虫样品的DNA可按以下步骤进行：

挑取单条线虫放入200μL PCR管中，其中已加有10μL双蒸水和5μL无Mg²⁺的10×PCR缓冲液，然后液氮中放置1min或-70度放置0.5h以上，取出后立即85℃加热2min，然后向PCR管中加入1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃加热30min以上，95℃加热10min，将PCR管在微型离心机上微离心，得到DNA模板。

进一步，所述步骤(2)的RPA扩增反应优选按照以下操作进行：在0.2ml的PCR管中加入反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，ddH₂O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的RPA反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将RPA反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA特异性引物，该特异性引物对日本短体线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为145bp，对其它根结线虫无特异性条带片段，因此可根据凝胶电泳在145bp处有无扩增条带作为鉴定杉并根结线虫的依据，可以检测单个或者混合杉并根结线虫DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好，可以对进境种苗中的杉并根结线虫进行准确鉴定，对于防止根结线虫非中国种的入侵、保护我国农林生产安全具有重要意义。

附图说明

图1显示的是利用本发明的RPA引物，对不同种根结线虫的DNA进行RPA检测后的电泳图。图中，各泳道分别为：M为DNA分子量标准，其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；1：苹果根结线虫株系M1；2：山茶根结线虫株系C1；3：南方根结线虫株系MIYN1；4：北方根结线虫株系MHSD1；5：花生根结线虫MAJS2；6：爪哇根结线虫MJFJ1；7：象耳豆根结线虫MEHN2；8：西班牙根结线虫MSHM1；9：杉并根结线虫株系S；10：超纯水对照；11：实验室前期实验阳性对照；12：RPA试剂盒自带阳性对照。

图2显示的是利用本发明的RPA引物，对梯度稀释的不同浓度的杉并根结线虫幼虫的DNA进行RPA检测的电泳图。图中，各泳道分别为：M为DNA分子量标准，其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；1：10ng/μL；2：2ng/μL；3：1ng/μL，4：0.02ng/μL；5：0.01ng/μL；6：0.002ng/μL；7：0.001ng/μL；8：ddH₂O阴性对照。

具体实施方式：

以下通过具体实验例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编号

Basic kit；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。

实施例1、DNA提取方法

挑取单条线虫放入200μL PCR管中[已加有10μL双蒸水和5μL 10×PCR缓冲液(无Mg2+)]，液氮中放置1min(或-70度放置0.5h)，取出后立即85℃加热2min。然后向PCR管中加入1μL 1mg/mL蛋白酶K，56℃加热30min，95℃加热10min，将PCR管在微型离心机上微离心，得到DNA模板。

实施例2、RPA检测方法

RPA反应使用

Basic kit，反应总体系为50μL，首先在0.2ml的PCR管中加入反应缓冲液29.5μL，10μM的上下游引物各2.4μL，DNA模板1μL，ddH₂O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的RPA反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将RPA反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟，反应产物使用凝胶电泳检测。电泳：将5μL RPA产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现大小为145bp的特异性片段，则为杉并根结线虫，在145bp处不出现条带的样品不是杉并根结线虫。

实施例3、准确性和可靠性试验——杉并根结线虫的特异性扩增

用实施例1的提取方法，实施例2的RPA检测方法，分别对表1中的根结线虫群体提取DNA，并以DNA为模板进行RPA检测，结果只有杉并根结线虫获得特异性扩增产物，其他根结线虫群体均无条带。部分结果如图1所示，其中各泳道分别为：M：DL100分子标记(其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；1：苹果根结线虫株系M1；2：山茶根结线虫株系C1；3：南方根结线虫株系MIYN1；4：北方根结线虫株系MHSD1；5：花生根结线虫MAJS2；6：爪哇根结线虫MJFJ1；7：象耳豆根结线虫MEHN2；8：西班牙根结线虫MSHM1；9：杉并根结线虫株系S；10：超纯水对照；11：实验室前期实验阳性对照；12：RPA试剂盒自带阳性对照(具体样品信息见表1)。因此，本发明具有很高的特异性，能对杉并根结线虫株系进行有效扩增，而其他近似种均无扩增，保证鉴定结果准确。

实施例4、灵敏度试验——对单条杉并根结线虫幼虫的DNA以及梯度稀释DNA的特异性扩增

用实施例1的提取方法，提取单条杉并根结线虫的DNA，使用测定其浓度，并将模板稀释至10ng/μL，2ng/μL，1ng/μL，0.02ng/μL，0.01ng/μL，0.002ng/μL，0.001ng/μL，分别以这7种不同浓度的杉并根结线虫的DNA作为模板(1.0μL)，按照实施例2的RPA检测方法，同时使用等量的ddH₂O为阴性对照，对不同DNA浓度下的灵敏度进行测试。实验结果:结果如图2所示，其中各泳道分别为：M：DL100分子标记(其条带从上至下分别为1500bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)；1：10ng/μL；2：2ng/μL；3：1ng/μL，4：0.02ng/μL；5：0.01ng/μL；6：0.002ng/μL；7：0.001ng/μL；8：ddH₂O阴性对照。

灵敏度试验结果表明，本发明方法具有较高的灵敏度，适合在实际应用中推广。

利用本发明提供的方法或试剂盒，可对衫并根结线虫作出快速鉴定，具有很高的可靠性和灵敏度，且操作方便，不依赖操作人员的经验，准确度高，实用性强。

表1实验所用根结线虫群体

序列表

<110> 宁波检验检疫科学技术研究院

<120> 一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的方法、RPA引物及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

tcccttctca tgggctcatt aagtcttaaa ccg 33

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

actttggtcg tgtaacggct aacgctggtg tct 33

Claims

1.应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA引物，所述引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'- TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'- ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

2.一种应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，所述试剂盒中的RPA引物的序列如下：

上游引物MSRPAF：5'- TCCCTTCTCATGGGCTCATTAAGTCTTAAACCG-3'

下游引物MSRPAR：5'- ACTTTGGTCGTGTAACGGCTAACGCTGGTGTCT-3'。

3.如权利要求2所述的应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，其特征在于所述试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，RPA冻干酶粉适量，280mM的醋酸镁溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL。

4.如权利要求3所述的应用RPA技术检测杉并根结线虫的RPA试剂盒，其特征在于所述试剂盒的反应体系的组成如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL， 280mM的MgAc溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL，含有RPA冻干酶粉的RPA反应管，RPA扩增反应在RPA反应管中进行。

5.利用权利要求2~4之一所述的RPA试剂盒来检测杉并根结线虫的方法，其特征在于所述方法为：

提取待测线虫样品的DNA 作为模板，利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA 扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现145 bp的特异DNA 条带，则待测线虫为杉并根结线虫，反之则否。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）提取待测线虫样品的DNA作为模板；

（2）利用杉并根结线虫的RPA试剂盒中的特异性引物作为扩增引物，进行RPA 扩增，RPA扩增的反应体系如下：

反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，RPA冻干酶粉适量，280mM的MgAc溶液2.5μL ，ddH₂O 12.2μL；

RPA扩增的条件如下：38℃反应30分钟;

（3）RPA扩增产物进行电泳检测：取出RPA扩增产物5μL，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在145 bp处出现扩增条带的为杉并根结线虫，反之则否。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤（2）的RPA扩增反应按照以下操作进行：在0.2ml 的PCR管中加入反应缓冲液29.5μL，浓度均为10μM的上游引物MSRPAF和下游引物MSRPAR各2.4μL，待测DNA模板1μL，ddH₂O 12.2μL，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的RPA反应管中混匀，加入280mM的MgAc溶液2.5μL，将RPA反应管置于金属浴中，38℃反应30分钟。