CN109234461B - 桃病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及桃病毒检测，具体涉及一种桃病毒的多重RT‑PCR检测试剂盒及检测方法。本发明的试剂盒包含独立包装或者混装在一起的三对引物，其核苷酸序列如SEO ID NO.1～6所示；所述桃病毒为PaLV，PeVD和/或NSPaV。本发明的检测方法以待测样品的cDNA为模板，采用所述三对引物在同一反应体系中对三种病毒的目的片段同时进行扩增，经一次PCR反应即可检测三种桃病毒，具有简便、经济、快速、准确的优点。

Description

桃病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及桃病毒检测，具体涉及一种桃病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
油桃茎痘相关病毒(nectarine stem pitting-associated virus，NSPaV)，桃黄症相关病毒(peach associated luteovirus，PaLV)和桃病毒D(peach virus D，PeVD)都是近年来桃上发现的新病毒。NSPaV首先是于2015年在美国加利福尼亚州出现茎痘症状的油桃树中分离得到的[1]，随后在日本[2]、中国[3]、匈牙利[4]、韩国[5]相继被报道发现，我国是在2016年首次报道发现该病毒[3]。PaLV[6]和PeVD[7]均是于2017年首次报道发现。目前对这三种病毒的研究较少。RT-PCR检测方法是桃病毒检测的重要和常用的技术。多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR，mRT-PCR)是PCR技术的发展，是对两个以上不同病毒基因位点的同时扩增，是一种较为快速、简便、经济的检测方法，目前，已应用到多种植物病毒的检测。但对不同植物不同病毒组合的mRT-PCR检测体系均各不相同，必须对引物进行筛选，对引物浓度，样品cDNA浓度及PCR体系进行优化才能建立一套同时扩增多病毒基因的稳定的检测方法。
本研究在2016年5月对我国辽宁的21个样品病毒进行了常规的RT-PCR检测，结果表明NSPaV，PaLV和PeVD三者之间或两两之间存在复合侵染现象，且复合侵染现象频繁发生。因此，需要建立一套快速、简便、经济、稳定的同时检测这三种病毒的检测方法。
为了与多重RT-PCR区别，以下将普通RT-PCR命名为单重RT-PCR，普通PCR命名为单重PCR。
发明内容
本发明提供用于检测PaLV，PeVD，NSPaV三种桃病毒的引物，通过优化PCR反应体系和反应条件，建立了一套快速、简便、经济、稳定的多重RT-PCR检测方法，能够在同一反应体系中经一次PCR反应同时检测这三种病毒，具有特异性强、灵敏度高的优点。
本发明请求保护的技术方案如下：
桃病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起的如下三对引物：
PaLV 981F：5’-ATCCAGCATGATTCGTTCGT-3’，
PaLV 981R：5’-CGTGACAGAGCCCATCTAAAA-3’；
PeVD 695F：5’-CCGACTCTGTCATTGACTACCC-3’，
PeVD 695R：5’-GAGGACTCGTGCGGACTTTA-3’；
NSPaV 409F：5’-TACCACCAATGCGACAACAA-3’，
NSPaV 409R：5’-AGAGGCGAAGACATCACTTTACT-3’；
所述桃病毒为PaLV，PeVD和/或NSPaV。
优选地，包含混装在一起的所述三对引物，三对引物的摩尔比为：PaLV：PeVD：NSPaV＝1：1.5：3。
桃病毒PaLV的PCR检测试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
PaLV 981F：5’-ATCCAGCATGATTCGTTCGT-3’，
PaLV 981R：5’-CGTGACAGAGCCCATCTAAAA-3’。
桃病毒PeVD的PCR检测试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
PeVD 695F：5’-CCGACTCTGTCATTGACTACCC-3’，
PeVD 695R：5’-GAGGACTCGTGCGGACTTTA-3’。
桃病毒NSPaV的PCR检测试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
NSPaV 409F：5’-TACCACCAATGCGACAACAA-3’，
NSPaV 409R：5’-AGAGGCGAAGACATCACTTTACT-3’。
优选地，还包括植物内参基因引物，其核苷酸序列如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’。
优选地，还包括植物内参基因引物，其核苷酸序列如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’；
四对引物的摩尔比为：PaLV：PeVD：NSPaV：nad5＝1：1.5：3：1。
桃病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；
(2)采用所述试剂盒中的三对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现981bp大小的条带，则样品中含有PaLV；若扩增产物中出现695bp大小的条带，则样品中含有PeVD；若扩增产物中出现409bp大小的条带，则样品中含有NSPaV。
优选地，所述多重PCR反应中，所述三对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为PaLV981F/R 0.2μM，PeVD 695F/R 0.3μM，NSPaV 409F/R 0.6μM。
优选地，所述多重PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸20sec，循环35次；最后72℃延伸2min。
多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个基因位点的特异性扩增，因此，建立多重RT-PCR反应体系，需要对多个目标产物，多对引物，反应体系等进行综合研究，通过反复试验，优化反应条件，摸索出最佳的多重RT-PCR检测体系。在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增；引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。此外，其他PCR反应条件如循环退火温度，模板浓度等也直接影响产物的扩增。
本发明针对PaLV，PeVD，NSPaV三种桃病毒的基因组序列进行了引物设计，筛选到3对特异引物。通过对3对引物的浓度配比进行反复筛选实验，获得了能同时检测PaLV，PeVD，NSPaV这三种病毒的最佳引物浓度配比组合(组合5)。同时对PCR反应退火温度、模板浓度等进行了研究，确定了最佳退火温度为55℃，检测三种病毒cDNA(RNA～0.63ug的反转录产物)的极限稀释倍数为10-4，灵敏度高。
采用本发明建立的多重RT-PCR检测方法对我国辽宁地区田间的桃样品进行PaLV，PeVD，NSPaV三种病毒的检测。结果表明，多重PCR与单重PCR的检测结果完全一致。该方法一次能同时扩增三种病毒，减少了操作次数，避免了交叉污染，同时还减少了试剂、引物、模板等的使用量，达到了简便、经济、快速和准确的检测要求。
附图说明
图1.不同引物浓度配比的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图；
其中，M：DNA Marker II，泳道1-6：组合1-6的PCR产物，CK：阴性对照，以ddH2O代替引物。
图2.不同退火温度对多重RT-PCR结果的影响；
其中，M：DNA Marker II，泳道1-5依次为45℃，50℃，55℃，60℃和65℃退火温度处理，CK：阴性对照，模板为ddH2O，退火温度55℃。
图3.本发明检测方法的灵敏度检测结果(不同RNA浓度对mRT-PCR检测敏感性的测定影响)；
其中，M：DNA Marker II，泳道1-6：将PaLV、PeVD、NSPaV三种混合病毒的总RNA(～0.63μg)依次稀释为100～10-5六个梯度，分别反转录为cDNA，以各cDNA为模板进行PCR的扩增产物，CK：阴性对照，模板为ddH2O。
图4.本发明检测方法的灵敏度检测结果(不同cDNA浓度对mRT-PCR检测敏感性的测定影响)；
其中，M：DNA Marker II，泳道1-6：将PaLV、PeVD、NSPaV三种混合病毒的cDNA依次稀释为100～10-5六个梯度，以各稀释液为模板进行PCR的扩增产物，CK：阴性对照，模板为ddH2O。
图5.多重PCR与单重PCR的扩增产物电泳图；
其中，泳道1：多重PCR的扩增产物；泳道2-5：单重PCR的扩增产物；CK：阴性对照，以ddH2O代替引物。
图6.RT-PCR对田间样品的检测结果；
其中，A：多重RT-PCR检测PaLV、PeVD与NSPaV三种病毒的结果，泳道1-21为21份桃样品的多重RT-PCR产物，CK为阴性对照(模板为ddH2O)；B：单重RT-PCR检测PaLV的结果，泳道1-21为21份桃样品的单重RT-PCR产物，CK为阴性对照(模板为ddH2O)；C：单重RT-PCR检测PeVD的结果，泳道1-21为21份桃样品的单重RT-PCR产物，CK为阴性对照(模板为ddH2O)；D：单重RT-PCR检测NSPaV的结果，泳道1-21为21份桃样品的单重RT-PCR产物，CK为阴性对照(模板为ddH2O)。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本发明的任何限制。
供试植物：21个有病害症状和无症状桃叶片和枝条样品于2017年5月采自辽宁大连。
主要试剂和仪器：
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Polysaccharides&Polyphenolics-richRNAprep Pure)，购自天根生物技术(北京)公司；
TIANgel琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；
dNTP Mix(10mM)，5×M-MLV buffer，M-MLV RT(200U/μl)，RNase inhibitor(40U/μl)，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司(PROMEGA)；
1.1×T3Super PCR Mix，购自北京擎科新业生物技术有限公司；
载体pMD18-T，购自宝生物工程(大连)有限公司；
MultiGene OptiMax Thermal Cycler TC9610-230(Labnet International，Inc.)；Bio-Rad PCR仪；
Tanon-2500凝胶成像系统；中国DYY-6B型稳压电泳仪。
下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验条件，均为本领域常规实验条件，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1、用于检测三种桃病毒的多重RT-PCR体系的建立
1、引物设计与合成
应用Primer Premier 5引物软件设计三种桃病毒(PaLV，PeVD，NSPaV)的特异引物。nad5为植物内参对照基因引物[8](植物mRNA特异引物)，用于检测植物RNA的质量和RT-PCR的效果。为了保证这三种病毒能够在同一个反应体系和相同温度下同时被检测出来，在设计引物时，选择Tm值接近的引物对，并对引物对进行Blast比对，保证引物对3′端无互补性。筛选到7对PaLV引物，4对PeVD引物和3对NSPaV引物，经过进一步筛选，获得了能够在同一反应体系中同时检测三种病毒的3对特异引物。三种桃病毒的特异引物序列和植物mRNA特异引物序列如表1所示。所有引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
表1.多重RT-PCR体系中使用的特异性引物
Figure BDA0001861651410000051
Figure BDA0001861651410000061
注：PaLV病毒基因组全长5819bp，PeVD病毒基因组全长6612bp，NSPaV病毒基因组全长4991bp。
2、植物总RNA提取
采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取植物总RNA，具体操作步骤按操作指南：
称取新鲜樱桃叶片或枝条树皮韧皮部0.05-0.1g装入2ml EP管中，液氮冰冻后，用研磨仪研磨成粉状，加入500μl含β-巯基乙醇的裂解液SL，涡旋剧烈震荡混匀，12000rpm离心2min；将上清液移至过滤柱CS上(过滤柱放在收集管中，12000rpm离心2min，吸上清液于新的RNase-Free的离心管中，加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，向吸附柱CR3中央加入80μl的DNaseI工作液，室温放置15min；加入350μl去蛋白液RW1，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，加入500μl去漂洗液RW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复漂洗1次，12000rpm离心2min；将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到RNA溶液，于-80℃冰箱中保存。
3、反转录合成cDNA
反转录体系
Figure BDA0001861651410000062
Figure BDA0001861651410000071
混匀混合液，42℃温育1h，然后进行PCR或-20℃保存备用。
在mRT-PCR研究中，因反复实验，需频繁使用反转录产物，反转录体系总体积可增加到20μl，其他试剂按比例相应增加。
4、多重PCR检测方法的建立
多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个位点，多个基因片断的特异性扩增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增；引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。此外，其他PCR反应条件如循环退火温度，模板浓度等也直接影响产物的扩增。
本研究对多重PCR检测体系的引物组合，引物浓度配比及退火温度，模板浓度等进行研究，建立了能同时检测这三种病毒的最佳的多重PCR检测体系。
(1)引物浓度配比的筛选
对上述4对引物浓度进行筛选，首先在反应体系中等量加入4对引物，结果显示PeVD和NSPaV扩增条带较弱。增加PeVD和NSPaV引物的浓度、降低PaLV引物的浓度或保持PaLV引物浓度不变，筛选最适合的引物浓度配比组合。不同引物浓度和配比组合详见表2。
表2.不同引物浓度配比的筛选
Figure BDA0001861651410000072
Figure BDA0001861651410000081
多重PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸20sec，循环35次；最后72℃延伸2min。4℃保存。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，120V下电泳30min左右，电泳胶于Tanon-2500凝胶成像系统中照相，分析电泳结果。
结果如图1所示：引物最佳浓度配比组合为组合5，三种病毒的条带亮度差别不大，因此最终选定的引物浓度的组合为组合5，优化后PaLV、PeVD、NSPaV引物的浓度分别为0.2μM，0.3μM，0.6μM，3对引物之间的比例为PaLV：PeVD：NSPaV＝1：1.5：3。
(2)退火温度的筛选
为了明确多重PCR反应体系的最佳退火温度，实验设置了5个退火温度处理：45℃，50℃，55℃，60℃和65℃。检测时，采用表2中组合5所示的反应体系，多重PCR反应条件除退火温度外，其余同上。
如图2所示，电泳检测结果表明，退火温度从45℃到60℃各基因扩增条带均清晰可见，其中退火温度为55℃时三种病毒扩增片段亮度最佳，而在60℃时PaLV扩增条带较弱，在65℃时仅能扩增出PeVD，表明了在45℃到60℃这个温度范围内反应体系扩增效果良好，以55℃扩增效果最佳。
(3)多重PCR的最佳反应体系和条件
多重PCR的最佳反应体系：
Figure BDA0001861651410000082
多重PCR的最佳反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸20sec，循环35次；最后72℃延伸2min。4℃保存。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，120V下电泳30min左右，电泳胶于Tanon-2500凝胶成像系统中照相，分析电泳结果。
5、特异性验证
为确认检测目的片段的特异性，对PCR产物进行克隆及序列分析。在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，按试剂盒操作指南，使用TIANgel琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行扩增产物的纯化。分别将PaLV、PeVD、NSPaV的PCR纯化产物连接至克隆载体pMD18-T，转化大肠感菌DH5α感受态细胞，筛选白色单菌落置于800μL LB(含氨苄青霉素Amp)培养基中培养，通过对菌液进行PCR检测来鉴定重组质粒，PCR体系和程序如下：
单重PCR反应体系如下：
Figure BDA0001861651410000091
单重PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸20sec，循环35次；最后72℃延伸2min。4℃保存。
经菌液PCR，每个病毒各筛选3个阳性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。对所得序列通过BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)与相关序列进行比对分析，鉴定检测的目的片段。经克隆及序列分析，均表明PCR产物为目的片断。
6、灵敏度检测
为确定mRT-PCR检测灵敏度，分别对RNA和cDNA进行稀释，然后按照上述多重PCR反应体系进行检测。
(1)RNA稀释：首先将含PaLV、PeVD、NSPaV三种混合病毒的总RNA(～0.63μg)依次稀释为100～10-5六个梯度，按照上述步骤3中的反转录体系和程序合成cDNA，分别以cDNA作为模板，按照多重PCR的最佳反应体系和条件进行检测。
(2)cDNA稀释：首先将含PaLV、PeVD、NSPaV三种混合病毒的总RNA(～0.63μg)按照上述步骤3中的反转录体系和程序合成cDNA(～0.75μg)，用分光光度仪分别测定浓度，再将cDNA依次稀释为100～10-5六个梯度，分别以稀释液作为模板，按照多重PCR的最佳反应体系和条件进行检测。
如图3和图4所示，mRT-PCR检测灵敏度结果表明，当RNA溶液稀释系数≤10-4时，PaLV、PeVD、NSPaV三种病毒均可以扩增出完整的目的条带，但稀释系数为10-5时，NSPaV扩增条带明显减弱，这与不同cDNA浓度对mRT-PCR检测敏感性影响的结果是一致的。以上结果表明本实验中所构建的多重RT-PCR检测体系对PaLV、PeVD、NSPaV的检测灵敏度较高。
实施例2、多重RT-PCR对田间桃样品病毒检测应用
首先，利用筛选的3对病毒基因引物和植物内参基因引物通过单重RT-PCR对田间样品检测，结果表明PaLV，PeVD，NSPaV之间存在复合侵染现象。以NSPaV，PaLV，PeVD三种病毒复合侵染的样品为材料，将单重PCR与多重PCR的结果进行比较验证，结果显示，两者均扩增出目标条带981bp的PaLV，695bp的PeVD，409bp的NSPaV，181bp的nad5(图5)。
随后，采用多重PCR的最佳反应体系和条件，分别对我们利用单重RT-PCR反应已检测到的辽宁大连的21份桃样品进行三种病毒检测。结果表明，多重RT-PCR反应检测结果与单重RT-PCR反应结果完全一致。如图6所示，在3，4，6，9样品中检测到单一PaLV(图6A，6B)，在18，19，20，21样品中检测到单一NSPaV(图6A，6D)，在7，11，12样品中同时检测到PaLV与PeVD(图6A，6B，6C)，在13，14样品中同时检测到PaLV与NSPaV(图6A，6B，6D)，在1，2样品中同时检测到PaLV、PeVD与NSPaV(图6A，6B，6C，6D)。
参考文献：
[1]Bag S.，Al Rwahnih M.，Li A.，et al.Detection of a new luteovirus inimported nectarine trees:a case study to propose adoption of metagenomics inpost-entry quarantine[J].Phytopathology，2015，105(6):840-846.
[2]Candresse T.，Faure C.，Theil S.，et al.First report of nectarinestem pitting-associated virus infecting Prunus mume in Japan[J].PlantDisease，2017，101(2):393-393.
[3]Lu M G.，Zhang C.，Zhang Z X.，et al.Nectarine stem-pitting-associated virus detected in peach trees in China[J].Plant Disease，2017，101(3):513-513.
[4]Krizbai L.，Kriston E.，Kreuze J.，et al.Identification of nectarinestem pitting-associated virus infecting Prunus persica in Hungary[J].NewDisease Reports，2017，35:18-18.
[5]Jo Y.，Cho J K.，Choi H.，et al.First report of nectarine stempitting-associated virus and Plum bark necrosis and stem pitting-associatedvirus infecting a peach cultivar in Korea[J].Plant Disease，2017，101(6):1067-1067.
[6]Wu L P.，Liu H W.，Bateman M.，et al.Molecular characterization of anovel luteovirus from peach identified by high-throughput sequencing[J].Archives of virology，2017，162(9):2903-2905.
[7]Igori D.，Lim S.，Baek D.，et al.Complete nucleotide sequence andgenome organization of peach virus D，a putative new member of the genusMarafivirus[J].Archives of virology，2017，162(6):1769-1772.
[8]Menzel W.，Jelkmann W.，Maiss E.Detection of four apple viruses bymultiplex RT-PCR assays with coamplification of plant mRNA as internalcontrol[J].Journal of Virological Methods，2002，99(1-2):81-92.
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 桃病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法
<130> P180774/ZWB
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测PaLV病毒的上游引物
<400> 1
atccagcatg attcgttcgt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测PaLV病毒的下游引物
<400> 2
cgtgacagag cccatctaaa a 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测PeVD病毒的上游引物
<400> 3
ccgactctgt cattgactac cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测PeVD病毒的下游引物
<400> 4
gaggactcgt gcggacttta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测NSPaV病毒的上游引物
<400> 5
taccaccaat gcgacaacaa 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测NSPaV病毒的下游引物
<400> 6
agaggcgaag acatcacttt act 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测nad5内参基因的上游引物
<400> 7
gatgcttctt ggggcttctt gtt 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 用于检测nad5内参基因的下游引物
<400> 8
ctccagtcac caacattggc ataa 24

Claims (6)

1.桃病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起的如下三对引物：
PaLV 981F：5’-ATCCAGCATGATTCGTTCGT-3’，
PaLV 981R：5’-CGTGACAGAGCCCATCTAAAA-3’；
PeVD 695F：5’-CCGACTCTGTCATTGACTACCC-3’，
PeVD 695R：5’-GAGGACTCGTGCGGACTTTA-3’；
NSPaV 409F：5’-TACCACCAATGCGACAACAA-3’，
NSPaV 409R：5’-AGAGGCGAAGACATCACTTTACT-3’；
所述桃病毒为PaLV，PeVD和NSPaV。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述三对引物，三对引物的摩尔比为：PaLV：PeVD：NSPaV＝1：1.5：3。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括植物内参基因引物，其核苷酸序列如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’；
四对引物的摩尔比为：PaLV：PeVD：NSPaV：nad5＝1：1.5：3：1。
4.桃病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；
(2)采用权利要求1或2所述试剂盒中的三对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现981bp大小的条带，则样品中含有PaLV；若扩增产物中出现695bp大小的条带，则样品中含有PeVD；若扩增产物中出现409bp大小的条带，则样品中含有NSPaV。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述多重PCR反应中，所述三对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为PaLV 981F/R 0.2μM，PeVD 695F/R 0.3μM，NSPaV 409F/R 0.6μM。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述多重PCR反应条件为：98℃预变性3min，98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸20sec，循环35次；最后72℃延伸2min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110643740B (zh) * 2019-10-15 2023-08-04 云南省畜牧兽医科学院 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Complete nucleotide sequence and genome organization of peach virus D, a putative new member of the genus Marafivirus.;Davaajargal Igori等;《Arch Virol》;20170210;第162卷;1769-1772 *
Davaajargal Igori等.Complete nucleotide sequence and genome organization of peach virus D, a putative new member of the genus Marafivirus..《Arch Virol》.2017,第162卷1769-1772. *
First report of Peach-associated Luteovirus in nectarine (Prunus persica) in Italy.;Sorrentino等;《Plant disease》;20180425;第102卷(第7期);1-2 *
Identification of Nectarine stem pitting-associated virus infecting Prunus persica in Hungary.;L. Krizbai 等;《New Disease Reports》;20170419;第35卷(第18期);18 *
L. Krizbai 等.Identification of Nectarine stem pitting-associated virus infecting Prunus persica in Hungary..《New Disease Reports》.2017,第35卷(第18期),18. *
Molecular characterization of a novel luteovirus from peach identified by high-throughput sequencing.;Wu et l.;《Arch Virol》;20170526;第162卷(第9期);2903-2905 *
Multiplex RT-PCR to simultaneously detect three viruses that infect peach.;Y. Xu 等;《Letters in Applied Microbiology》;20190930;第69卷;318-324 *
Simultaneous detection and identification of four cherry viruses by two step stepmultiplex RT-PCR with an internal control of plant nad5 mRNA.;Noorani等;《Journal of Virological Methods》;20180523;第193卷;103-107 *
Sorrentino等.First report of Peach-associated Luteovirus in nectarine (Prunus persica) in Italy..《Plant disease》.2018,第102卷(第7期),1-2. *
Wu et l..Molecular characterization of a novel luteovirus from peach identified by high-throughput sequencing..《Arch Virol》.2017,第162卷(第9期),2903-2905. *

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