CN104831000A - 用于樱桃病毒检测的多重rt-pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及“用于樱桃病毒检测的多重RT-PCR试剂盒及检测方法”，属于植物病毒检测领域。本发明提供的多重PCR试剂盒，包含独立包装或者混装在一起的四对引物：CVA-F/R,ACLSV-F/R,CGRMV-F/R以及LChV-1F/R，所述樱桃病毒为CVA,ACLSV,CGRMV和/或LChV-1。采用本发明试剂盒检测这四种樱桃病毒，灵敏度高：只需提取待测樱桃植株的叶片或韧皮部的总RNA(低至2ng)，反转录成cDNA，按照引物摩尔比CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10进行PCR反应，即可检测出待测样品中是否含有这四种病毒中的一种、两种、三种或全部；特异性强：对检测的病毒基因片段进行测序，结果表明，四个病毒基因片段均为目的片段。
Description
技术领域
本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于樱桃病毒检测的多重RT-PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
由于栽培樱桃有较高经济效益，近几年樱桃的栽培在我国各地发展较快。我国的大樱桃栽培主要集中在山东的烟台，辽宁的大连，河北的秦皇岛等地，目前北京、山西、江苏、安徽、河南、甘肃、新疆等地均有栽培种植。但近年来，病毒病呈日益加重的趋势，成为影响樱桃产量和品质的重要因素。据国外报道，侵染大樱桃的病毒约有30多种，比较常见的大樱桃病毒主要有20种。我国已报道的侵染樱桃的主要病毒有：李属坏死环斑病毒(Prunus necroticringspot virus，PNRSV)，李矮缩病毒(Prune dwarf virus，PDV)，樱桃病毒A(Cherry virus A，CVA)，樱桃绿环斑驳病毒(Cherry green ring mottle virus，CGRMV)，樱桃小果病毒－2(Littlecherry virus-2，LChV-2)，樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1，LChV-1)，苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)等。
发明人在2014年4-10月对我国山东，辽宁和北京樱桃园的35个样品病毒进了常规的RT-PCR检测，结果表明CVA与CGRMV,CGRMV与LChV-1,CVA与ACLSV,CGRMV,LChV-1存在复合侵染现象(部分结果已发表在卢美光，吴冰，高蕊，等.我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测.植物保护，2015,41(1):98-103.)，未检测到CNRMV。有必要研究可以同时鉴别检测这四种樱桃病毒的快速检测手段。
关于樱桃病毒检测的现有技术，目前国内外已有3篇关于樱桃病毒多重RT-PCR报道，包括同时检测樱桃CVA,PNRSV,CNRMV,LChV-1四种病毒,同时检测樱桃PNRSV,PDV,LChV-2,CGRMV四种病毒和同时检测樱桃PNRSV,PDV,LChV-2三种病毒的报道，其中对CVA,PNRSV,CNRMV,LChV-1四种病毒的多重RT-PCR的报道是基于室内对四种病毒人工混合进行的研究，没有这四种病毒混合感染的田间样品。
RT-PCR检测方法是樱桃病毒检测的重要和常用的技术。多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR,mRT-PCR)是PCR技术的发展，是对两个以上不同病毒基因位点的同时扩增，是一种较为快速、简便、经济的检测方法，目前，已应用到多种植物病毒的检测。该方法用于樱桃病毒复合感染的样品的检测是一种不错的选择。但对不同植物不同病毒组合的mRT-PCR检测体系均各不相同，必须对引物进行筛选，对引物浓度，样品cDNA浓度及PCR体系进行优化才能建立一套同时扩增多病毒基因的稳定的检测方法。
发明内容
根据上述领域存在的不足，本发明提供一种可同时检测侵染樱桃的CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒的多重RT-PCR检测方法及其试剂盒。本发明请求保护的技术方案如下：
用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起的如下的四对引物：
CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，
CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’；
ACLSV-F：5’-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3’，
ACLSV-R：5’-GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3’；
CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，
CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’；
LChV-1F：5’-GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3’，
LChV-1R：5’-GGCTTGGTTCCATACACTTC-3’。
所述樱桃病毒为CVA,ACLSV,CGRMV和/或LChV-1。
所述多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述四对引物，四对引物的摩尔比为：CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10。
用于检测樱桃病毒CVA的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，
CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’。
用于检测樱桃病毒CGRMV的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，
CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’。
还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’。
还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’；
五对引物的摩尔比为：CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1：nad5＝1：11.25：0.5：10：1.125。
用于检测樱桃病毒的mRT-PCR方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；
(2)采用权利要求1或2所述的试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现1184bp大小的条带，则样品中含有CVA；若扩增产物中出现791bp大小的条带，则样品中含有ACLSV；若扩增产物中出现468bp大小的条带，则样品中含有CGRMV；若扩增产物中出现300bp大小的条带，则样品中含有LChV-1。
所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CVA-F/R0.08μM,ACLSV-F/R 0.9μM,CGRMV-F/R 0.04μM,LChV-1F/R 0.8μM。
所述PCR反应的退火温度为55℃。
所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。
本发明提供能同时检测CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒的PCR试剂盒，包括四对引物：CVA-F/R,ACLSV-F/R,CGRMV-F/R,LChV-1F/R，能够分别特异结合四种病毒的RNA反转录成的cDNA，准确检测待测植株是否感染这四种病毒之一、之二、之三或全部。所述试剂盒还可以包括植物内参对照基因引物nad5-F/R，它是植物mRNA特异引物，用于检测提取的植物RNA的质量和RT-PCR的效果，从而排除因操作不规范或其它原因导致的假阴性结果。
本发明还提供能同时检测CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒的mRT-PCR检测方法。所述方法快速、简便、经济、稳定，只需提取待测植株的总RNA，反转录获得cDNA，然后采用本发明提供的引物组合，以cDNA为模板进行PCR反应，最后利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，根据产物大小，即可判断待测植株是否感染这四种病毒，操作简便易行，一份样品只需一次PCR即可对四种病毒进行检测，减少了操作次数，避免了交叉污染，同时还减少了试剂、引物、模板及耗材等的使用量，节约了时间，达到了简便、经济、快速和准确的检测要求。应用该方法对我国山东、辽宁和北京樱桃样品进行这四种病毒的检测，结果表明，与单重PCR检测结果一致。
多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个位点，多个基因片断的特异性扩增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增；引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。使用本发明提供的PCR试剂盒进行多重PCR检测待测植株是否感染CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1病毒，优选引物配比为CVA-F/R：ACLSV-F/R：CGRMV-F/R：LChV-1F/R＝1：11.25：0.5：10，如使用植物内参对照基因引物nad5-F/R，优选引物配比为CVA-F/R：ACLSV-F/R：CGRMV-F/R：LChV-1F/R：nad5-F/R＝1：11.25：0.5：10：1.125。本发明提供的引物组合及其引物配比，能够保证四种病毒的靶标条带均得到有效扩增，并且特异性强，检测结果的准确性高。
此外，其它PCR反应条件如循环退火温度，模板浓度，体系体积等也直接影响产物的扩增。本发明提供的检测方法，多重PCR反应的退火温度优选55℃。该方法能够检测CVA,ACLSV,CGRMV和LChV-1病毒的RNA(～0.471ug/μL)的极限稀释倍数为53，能够检测CVA,ACLSV和CGRMV病毒的cDNA(RNA～0.732ug/μL的反转录产物)的极限稀释倍数为54，灵敏度高。对PCR反应体积的研究表明，50ul、30ul、25ul的体系均可用于这四种病毒的多重PCR扩增，从经济的角度和操作的简易性考虑，25ul的体系最佳。
本发明提供的能同时检测CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒的引物组合及mRT-PCR检测方法，具有很强的实用性。利用本发明，对我们单重RT-PCR已检测到的辽宁大连、山东烟台和北京3个地区的20份樱桃阳性样品和4份阴性样品进行四种病毒检测。结果表明多重RT-PCR检测结果与单重RT-PCR检测结果一致。不仅检测到单一CVA,CGRMV,LChV-1感染；而且检测到CVA与CGRMV,CGRMV与LChV-1,CVA与ACLSV、CGRMV、LChV-1复合感染。因此，采用本发明提供的PCR试剂盒及mRT-PCR检测方法，能够快速、准确地检测田间常见的樱桃病毒感染，及时提供预防和治理方案，将病毒感染所带来的经济损失降至最低。
术语：
为了与多重RT-PCR区别，全文将普通RT-PCR命名为单重RT-PCR，普通PCR命名为单重PCR。
附图说明
图1不同引物组合PCR筛选琼脂糖凝胶电泳检测图，
其中，M：AL2000DNA Marker，N：阴性对照。
图2不同组合引物浓度和配比的琼脂糖凝胶电泳检测图。
图3不同退火温度对mRT-PCR的影响。
图4不同RNA浓度对mRT-PCR检测敏感性测定影响。
图5不同cDNA浓度对mRT-PCR检测敏感性测定影响。
图6单重PCR与多重PCR病毒检测比较，
其中，1-9为四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1复合侵染的烟台樱桃叶片，1为多重PCR产物，2～9为单重PCR产物。
图7多重RT-PCR对田间样品的检测，
其中，1，5，6，8，11，13，14，19，20为烟台樱桃叶片；2，3，9，15，16为北京樱桃叶片；4，7，17，18为大连樱桃枝条；10，12为大连樱桃叶片。
图8多重RT-PCR对田间样品及PCR回收产物的检测，
其中，21，22，23为北京樱桃叶片；24为大连樱桃枝条LChV-1PCR回收产物；25为烟台樱桃叶片ACLSV PCR回收产物；26为烟台樱桃叶片。
图9多重RT-PCR四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1和nad5扩增片段的序列BLAST结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行解释，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不构成对本发明的任何限制。
植物材料
24个有病害症状和无症状樱桃叶片和枝条样品于2014年4～10月采自山东烟台、辽宁大连和北京，其中，四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1复合侵染材料采自山东烟台果园。
主要试剂和仪器
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Polysaccharides&Polyphenolics-rich RNAprep Pure)购自天根生物技术(北京)公司)；
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒，购自Axygen试剂公司；
dNTP Mix(10mM),5×M-MLV buffer,M-MLV RT(200U/μl),RNase inhibitor(40U/μl)，购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司(PROMEGA)；
2×Taq PCR mix，购自北京冰达生物技术有限公司；
MultiGene OptiMax Thermal Cycler TC9610-230(Labnet International,Inc.)；
Bio-Rad PCR仪；
KCBIO-2800凝胶成像系统；
中国DYY-6B型稳压电泳仪。
实施例1.多重RT-PCR反应体系的建立
1、引物设计与合成
根据文献“宗晓娟，王文文，王甲威，等.SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR技术在甜樱桃病毒定量分析中的应用[J].植物保护学报，2012,39(6)：497-502.”中所述的引物CVA-1；
“Yu Y,Zhao Z,Jiang D,et al.A one-step multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection offour viruses that infect peach[J].Lett Appl Microbiol,2013,57(4)：350-355.”中所述的引物ACLSV-1；
“Bajet N B,Unruh T R,Druffel K L,et al.Occurrence of two little cherry viruses in sweetcherry in Washington State[J].Plant Disease,2008,92：234–238.”中所述的引物LChV-1；
“卢美光，吴冰，高蕊，等.我国部分地区樱桃病毒病害初步调查和病原检测.植物保护[J].,2015,41(1)：98-103.)”中所述的引物ACLSV-2,CGRMV-1；
以及“Menzel W.,Jelkmann W.,Maiss E.Detection of four apple viruses by multiplex RT-PCRassays with coamplification of plant mRNA as internal control.J.Virol.Methods,2002,99：81–92.”中所述的引物nad5。
应用Primer 3.0引物软件设计樱桃病毒的特异引物CVA-2，CGRMV-2。nad5为植物内参对照基因引物(植物mRNA特异引物)，用于检测提取的植物RNA的质量和RT-PCR的效果。为了保证这四种病原能够在同一个反应体系和相同温度下同时被检测出来，在设计引物时，选择Tm值接近的引物对，并对引物对进行比对，保证引物对的3′端无互补性。详细的病毒特异引物序列和植物mRNA特异引物序列见表1，所有的引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
表1.PCR反应所用特异性引物
2、植物总RNA提取及cDNA合成
(1)采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取24个有病害症状和无症状樱桃叶片和枝条样品的总RNA，具体操作步骤参考操作指南：称取新鲜樱桃叶片或枝条树皮韧皮部0.05-0.1g装入2mL EP管中，液氮冰冻后，用研磨仪研磨成粉状，加入500μl含β-巯基乙醇的裂解液SL，涡旋剧烈震荡混匀，12000rpm离心2min；将上清液移至过滤柱CS上(过滤柱放在收集管中)，12000rpm离心2min，吸上清液于新的RNase-Free的离心管中，加入0.4倍上清体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱CR3中，12000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，向吸附柱CR3中央加入80μL的DNaseI工作液，室温放置15min；加入350μL去蛋白液RW1，12000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，加入500μL去漂洗液RW，12000rpm离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中，重复漂洗1次，12000rpm离心2min；将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加35μL RNase-FreeddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到RNA溶液，于-80℃冰箱中保存。
(2)按照下列反应体系进行反转录，合成cDNA：
反转录体系
混匀混合液，室温放置10min，42℃温育1h，然后进行PCR或-20℃保存备用。
3、引物筛选
对表1所列8对引物进行组合，以步骤2获得的cDNA为模板，按照下列表2体系和如下程序进行PCR反应。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，100V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶成像分析仪中照相，分析电泳结果。根据对靶标条带的扩增情况，逐步调整组合中引物的组成和浓度，最终获得5个优选的组合。5个不同引物组合如下所示，多重PCR反应体系如表2所示。
组合1：CVA1+CGRMV1+ACLSV2+LChV-1；
组合2：CGRMV2+ACLSV1+LChV-1；
组合3：CVA1+CGRMV2+ACLSV1+LChV-1；
组合4：CVA2+CGRMV2+ACLSV2+LChV-1
组合5：CVA2+CGRMV2+ACLSV2+LChV-1+nad5
利用上述5个引物组合对四种病毒CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1复合侵染材料进行检测，结果如图1所示，组合1：CGRMV-1与LChV-1扩增条带不易分开，组合2：CGRMV-2取代CGRMV-1后，CGRMV-2,ACLSV-1,LChV-1条带均能被扩增，组合3：增加CVA-1后，CVA-1与CGRMV-2扩增条带难以分开，组合4：CVA-2取代CVA-1后，虽然CVA-2与CGRMV-2扩增条带可分开，但ACLSV-1的条带不出现，组合5：ACLSV-2取代ACLSV-1，4种病毒基因条带均能被扩增，因此，最佳组合为组合5。
表2.不同引物组合的多重PCR反应体系
| 多重PCR反应体系 | 组合5* | 组合4* | 组合3* | 组合2* | 组合1* |
| 反转录产物 | 1.2μl | 1.2μl | 1.2μl | 1.2μl | 1.2μl |
| 2×Taq PCR mix | 15μl | 15μl | 15μl | 15μl | 15μl |
| CVA-R(10μM) | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0 | 0.25μl |
| CVA-F(10μM) | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0 | 0.25μl |
| ACLSV-R(20μM) | 1.25μl | 1.25μl | 1.25μl | 1.25μl | 0.25μl |
| ACLSV-F(20μM) | 1.25μl | 1.25μl | 1.25μl | 1.25μl | 0.25μl |
| CGRMV-R(5μM) | 0.20μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl |
| CGRMV-F(5μM) | 0.20μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl |
| LChV-1-R(15μM) | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl |
| LChV-1-F(15μM) | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl | 0.25μl |
| nad5-R(10μM) | 0.25μl | 0 | 0 | 0 | 0 |
| nad5-F(10μM) | 0.25μl | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 无菌双蒸水 | 9.4μl | 9.8μl | 9.8μl | 10.3μl | 11.8μl |
| 总体积μl | 30μl | 30μl | 30μl | 30μl | 30μl |
*组合1，组合2，组合3，组合4，组合5所用引物组合对如上所列。
4、引物浓度配比的优化
对步骤3筛选出来的最佳组合5中的四对引物浓度和配比进一步优化。
以多重PCR体系体积30μL,引物浓度为20μM 1.0μL,0.5μL和0.25μL(即各引物终浓度为0.68μM,0.34μM和0.17μM)开始筛选，初步筛选出较合适的引物终浓度为0.17μM。以各引物终浓度为0.17μM为基数进一步摸索引物最佳浓度和配比。经过反复实验，筛选出五个优选的引物浓度和配比(表3)。
表3.不同引物浓度配比的筛选
其中，
配比1：CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1各引物终浓度均为0.17μM,
比例为1：1：1：1。
配比2：CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1,nad5
引物终浓度分别为0.1μM,0.9μM,0.05μM,0.2μM,0.1μM，
比例为1：9：0.5：2：1。
配比3：CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1,nad5
引物终浓度分别为0.08μM,0.9μM,0.04μM,0.4μM,0.1μM，
比例为1：11.25：0.5：5：1.25。
配比4：CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1,nad5
引物终浓度分别为0.08μM,0.9μM,0.04μM,0.6μM,0.08μM，
比例为1：11.25：0.5：7.5：1。
配比5：CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1,nad5
引物终浓度分别为0.08μM,0.9μM,0.04μM,0.8μM,0.09μM，
比例为1：11.25：0.5：10：1.125。
结果如图2所示，配比1各引物终浓度为0.17μM,CGRMV2扩增条带过亮，ACLSV2,LChV-1扩增条带被抑制，配比2降低了CGRMV2引物的浓度，引物的浓度由20μM减至5μM(终浓度为0.05μM)，加大了ACLSV2引物的浓度，并对其他3对引物也进行了微调，结果得到明显改善，配比3，4继续调整五对引物的比例，配比5加大了LChV-1引物的比例，能同时扩增4个病毒基因。因此，多重PCR的最佳引物浓度配比为配比5，即CVA2,ACLSV2,CGRMV2,LChV-1,nad5引物终浓度分别为0.08μM,0.9μM,0.04μM,0.8μM,0.09μM，比例为1：11.25：0.5：10：1.125，五个目标片断均能得到有效扩增。
5、其他PCR反应条件的优化
(1)退火温度
为了明确多重PCR反应体系的最佳退火温度和最佳延伸时间，实验设置了6个退火温度处理(57℃，55℃，53℃，51℃，49℃和47℃)和40s的延伸时间，按照表3中配比5的反应体系及下列反应程序进行多重PCR反应。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，(57℃，55℃，53℃，51℃，49℃和47℃)退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，100V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶成像分析仪中照相。结果如图3所示，退火温度从51℃到57℃各基因扩增条带均清晰可见，其中退火温度为55℃时LChV-1扩增片段亮度最佳，而在47℃和49℃时CGRMV扩增条带较暗并出现非特异性杂带，LChV-1扩增条带较弱，表明了在51℃到57℃这个温度范围内反应体系扩增效果良好，以55℃扩增效果最佳。
(2)模板浓度
为确定mRT-PCR检测灵敏度，将含CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种混合病毒的植物总RNA(～0.471μg/μL)依次稀释为50～56七个梯度，得到稀释系数为50、5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6的稀释液，并分别以稀释液作为模板，按照步骤2中的反应体系和程序反转录获得cDNA，按照表3中配比5的反应体系及下列反应程序进行多重PCR反应。
将含CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种混合病毒的植物总RNA(～0.732μg/μL)按照步骤2中的反应体系和程序反转录获得cDNA，将cDNA依次稀释为50～54五个梯度，得到稀释系数为50、5-1、5-2、5-3、5-4的稀释液，并分别以稀释液作为模板，按照表3中配比5的反应体系及下列反应程序进行多重PCR反应。
PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，100V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶成像分析仪中照相。
实验结果：
如图4所示，当RNA溶液稀释系数≥5-3时，CVA,ACLSV,CGRMV三种病毒均可以扩增出完整的目的条带，LChV-1扩增条带开始模糊；稀释系数≥5-2时，CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒均可以扩增出完整的目的条带，但RNA溶液稀释系数≤5-4时，CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1四种病毒均无法扩增。
如图5所示，当cDNA溶液稀释系数≥5-4时，CVA,ACLSV,CGRMV三种病毒均可以扩增出完整的目的条带；但稀释系数为5-4时，CVA,ACLSV,CGRMV扩增条带明显减弱；nad5条带无法扩增；稀释系数≤5-1时，LChV-1扩增条带开始模糊。以上结果表明本实验中所构建的多重RT-PCR检测体系对CVA,ACLSV,CGRMV,nad5检测灵敏度较高，LChV-1检测灵敏度较低。
(3)PCR反应总体积
对PCR反应总体积，实验也设置了30，50，25μL 3个不同处理。结果表明，在我们筛选的最佳组合中，这3个体系体积均是可行的，从经济角度考虑我们选择了25μL的体系，从操作的简易性和准确性方面考虑，按引物为1μL或0.75μL添加(表4)，根据筛选的CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1,nad5引物的最佳比例和终浓度计算出各引物浓度分别为2μM,30μM,1μM,20μM,3μM。
表4.mRT-PCR反应体系
*1.引物：为组合5的引物(表5)，CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1,nad5的终浓度为0.08μM,0.90μM,0.04μM,0.80μM,0.09μM；CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1：nad5为1：11.25：0.5：10：1.125
2.cDNA：植物总RNA(2～732ng)的反转录产物。cDNA量加太多时一些病毒基因的条带扩增会受到抑制。
表5.mRT-PCR反应所用特异性引物
6、特异性验证
为确认最佳引物组合检测目的片段的特异性，我们对PCR产物进行克隆及序列分析。在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，按试剂盒操作指南，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行扩增产物的纯化。分别将CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1的PCR纯化产物连接至克隆载体pGEM-T，转化大肠感菌DH5α感受态细胞，筛选白色单菌落置于1mL LB(含氨苄青霉素Amp)培养基中培养，按照常规的菌液PCR反应体系和反应条件进行PCR检测，鉴定重组质粒。经菌液PCR，每个病毒各筛选3个阳性菌液，送至北京六合华大基因科技有限公司进行序列测定。通过BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)对所得序列与相关序列进行比对分析，鉴定检测的目的片段。结果表明，PCR产物均为目的片段，NCBI BLAST结果如图9所示，四个病毒基因片段均与GenBank中登录的相应片断一致性较高，一致性在80～100％。
实施例2、多重RT-PCR与单重RT-PCR检测效果的比较
以实施例1步骤2获得的cDNA为模板，按照下列体系和程序进行单重PCR反应和多重PCR反应，使用表1所列的7对病毒基因引物和植物内参基因引物进行田间样品检测。
单重PCR反应体系
多重PCR反应体系
单重PCR和多重PCR反应循环参数：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec(其中单重PCR时,ACLSV引物退火温度为51℃)，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。4℃保存。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，在DYY-6B型稳压电泳仪，100V下电泳30min左右，电泳胶于KCBIO-2800凝胶成像分析仪中照相，分析电泳结果。
结果如图5所示，单重PCR(泳道2～9)和多重PCR(泳道1)均扩增出目标条带：1184bp的CVA2，791bp的ACLSV2，468bp的CGRMV2，300bp的LChV-1，181bp的nad5，652bp的ACLSV-1，632bp的CVA-1，364bp的CGRMV-1。
实施例3、多重RT-PCR对田间樱桃样品的病毒检测
利用实施例1建立的多重RT-PCR反应体系，分别对我们利用单重RT-PCR反应已检测到的辽宁大连、山东烟台和北京3个地区的20份樱桃阳性样品和4份阴性样品进行四种病毒检测。
结果显示：多重RT-PCR检测结果与单重RT-PCR检测结果一致。如图6所示，在2，5，14，15样品中检测到单一CGRMV，在8，10，12，13样品中检测到单一CVA，在3样品中检测到单一LChV-1，在4样品中同时检测到CVA与CGRMV，在9样品中同时检测到CVA与LChV-1，在17,18样品中同时检测到CGRMV与LChV-1，在11,19样品中同时检测到CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1。
由于mRT-PCR检测中，对LChV-1的检测条带较弱，我们用此体系对单重PCR检测的LChV-1,ACLSV回收纯化产物进行检测验证，如图7所示，均能扩增出明显的目标条带，在22,23样品中检测到CVA，在24样品中检测到LChV-1，在25样品中检测到ACLSV，在26样品中同时检测到CVA,ACLSV,CGRMV,LChV-1。说明在mRT-PCR检测中，LChV-1的条带弱与样品本身的含量低有关。
Claims (10)
1.用于检测樱桃病毒的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含独立包装或者混装在一起的如下的四对引物：
CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，
CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’；
ACLSV-F：5’-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3’，
ACLSV-R：5’-GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3’；
CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，
CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’；
LChV-1F：5’-GGTTGTCCTCGGTTGATTAC-3’，
LChV-1R：5’-GGCTTGGTTCCATACACTTC-3’。
所述樱桃病毒为CVA,ACLSV,CGRMV和/或LChV-1。
2.根据权利要求1所述的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含混装在一起的所述四对引物，四对引物的摩尔比为：CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1＝1：11.25：0.5：10。
3.用于检测樱桃病毒CVA的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
CVA-F：5’-TGTTGGGGCACAGTTTCAAG-3’，
CVA-R：5’-TGATTGGTGACGGTGAAGGA-3’。
4.用于检测樱桃病毒CGRMV的PCR试剂盒，其特征在于：包含具有如下核苷酸序列的引物：
CGRMV-F：5’-AGGCTAGGAATGGGATCAGC-3’，
CGRMV-R：5’-GTAACTTTAGCTTCGCCCCG-3’。
5.根据权利要求1、3和4任一所述的试剂盒，还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括植物内参基因引物，其核苷酸信息如下：
nad5-F：5’-GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT-3’，
nad5-R：5’-CTCCAGTCACCAACATTGGCATAA-3’；
五对引物的摩尔比为：CVA：ACLSV：CGRMV：LChV-1：nad5＝1：11.25：0.5：10：1.125。
7.用于检测樱桃病毒的mRT-PCR方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，反转录获得cDNA模板；
(2)采用权利要求1或2所述的试剂盒中的四对引物，以样品cDNA为模板进行多重PCR反应，得到扩增产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，若扩增产物中出现1184bp大小的条带，则样品中含有CVA；若扩增产物中出现791bp大小的条带，则样品中含有ACLSV；若扩增产物中出现468bp大小的条带，则样品中含有CGRMV；若扩增产物中出现300bp大小的条带，则样品中含有LChV-1。
8.根据权利要求7所述的方法，所述多重PCR反应中，所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CVA-F/R 0.08μM,ACLSV-F/R 0.9μM,CGRMV-F/R 0.04μM,LChV-1F/R 0.8μM。
9.根据权利要求8所述的方法，所述PCR反应的退火温度为55℃。
10.根据权利要求9所述的方法，所述PCR反应的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸40sec，循环35次；最后72℃延伸10min。
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