CN110408683A

CN110408683A - 用于樱桃物种鉴定的特异性dna区段和引物

Info

Publication number: CN110408683A
Application number: CN201910760640.5A
Authority: CN
Inventors: 檀建新; 桑亚新; 贾欣月; 王永; 兰青阔; 刘双; 刘紫薇; 沈晓玲
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110408683B

Abstract

本发明公开了一种用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段、引物和探针。所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述PCR引物为C36‑F、C36‑R，所述荧光定量PCR和数字PCR引物和探针为C36‑QF、C36‑QR、C36‑QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。本发明利用了定性PCR技术、实时荧光PCR技术以及数字PCR技术，建立一套樱桃物种特异性定性及定量的检测方法，并对樱桃纯果汁及含樱桃等多种不同水果混合果汁，建立了较为精准的樱桃物种定性和定量的检测方法。

Description

用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物

技术领域

本发明涉及分子生物学物种鉴定技术领域，具体涉及用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物。

背景技术

2017年10月Shirasawa,Kenta等人应用下一代测序技术，确定了甜樱桃(Prunusavium)的基因组序列。组装序列总长度为272.4Mb，其中支架序列10148个，N50长度为219.6kb。此项成果已发表在《DNA RESEARCH》上发表。

樱桃作为“早春第一果”、“百果第一枝”具有较高的营养价值和药用价值，而国内外还没有关于樱桃物种源性成分的研究，所以建立樱桃物种特异性的检测方法有利于国家标准的完善。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物及探针。

用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段，所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ IDNO：1所示。

用于樱桃物种特异性鉴定的PCR引物，所述引物为C36-F、C36-R，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

用于樱桃物种鉴定的荧光定量PCR和数字PCR的引物和探针，所述引物为C36-QF、C36-QR，探针为C36-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

一种定性鉴定樱桃物种的试剂盒，包含上述引物C36-F、C36-R。

一种定量鉴定樱桃物种的试剂盒，包含上述引物C36-QF、C36-QR和探针C36-QP。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用Perl语言编程和NCBI-BLAST从多种水果基因组中筛选获得了1条樱桃物种特异性序列，利用普通PCR通用体系和程序验证并测序，得到了完整的序列。建立了樱桃物种特异性定性PCR鉴定方法，C36-F/R在引物浓度为0.4μmol/L、退火温度为58℃时灵敏度可达0.5％。此方法可用于混合鲜榨果汁中樱桃成分定性鉴定。建立了樱桃物种特异性实时荧光PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物浓度和探针浓度均为0.5μmol/L时，灵敏度达0.1％。扩增条件经优化后，建立了Ct值与樱桃DNA的质量之间的量化关系方程式y＝-3.356x+31.062，R²＝0.998，扩增效率为98.545％。此方法可用于定量鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁中樱桃成分鉴定，并得能得到樱桃模板DNA含量。建立了樱桃物种特异性数字PCR方法，C36-QF/QR/QP在引物浓度为0.5μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L，退火温度为56.7℃时扩增效果最佳。确定线性定量范围下限为0.24ng，拷贝数和DNA模板量之间具有y＝7.4093x+1.2482的线性关系，且相关系数R²＝1，检测拷贝数下限约为1.8copy/μL。此方法可用于定量鉴别混合鲜榨果汁、非浓缩果汁和浓缩果汁中樱桃成分鉴定，并能得到樱桃的目标DNA的拷贝数。

附图说明

图1为引物tRNALeu-F/R对水果DNA PCR扩增结果图；

其中，M:DL 2000bp Marker CK:空白对照1:桑葚 2:网纹甜瓜 3:猕猴桃 4:山楂5:龙眼 6:桃 7:火龙果 8:西瓜 9:杏 10:李子 11:榴莲 12:西柚 13:橙 14:草莓 15:柑橘 16:柠檬 17:芒果 18:白香瓜 19:沙果 20:梨 21:苹果 22:牛油果 23:樱桃。

图2为PCR鉴定法引物C36-F/R特异性测试结果；

其中，M:DL 2000bp Marker 1:空白对照 2:樱桃 3:桑葚 4:猕猴桃 5:龙眼 6:桃7:火龙果 8:西瓜 9:杏 10:李子 11:榴莲 12:西柚 13:橙子 14:草莓 15:柑橘 16:柠檬17:芒果 18:白香瓜 19:沙果 20:梨 21:苹果 22:牛油果 23:网纹甜瓜 24:山楂。

图3为PCR鉴定法灵敏度测试结果；

其中，M:DL2000bp Marker；1:100％；2:20％；3:5％；4:1％；5:0.5％；6:0.1％；7:0％。

图4为PCR鉴定法检测混合果汁中樱桃；

其中，M:DL 2000bp Marker，ck：空白对照，+:阳性对照，1：鲜榨果汁，2：非浓缩还原果汁，3：浓缩果汁。

图5为实时荧光定量PCR鉴定法中C36-QF/QR/QP特异性测试结果图。

图6为樱桃物种实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线图。

图7为实时荧光定量PCR鉴定法特异性检测混合果汁中樱桃。

图8为数字PCR鉴定法中C36-QF/QR/QP特异性测试结果。

图9为樱桃物种数字PCR检测方法的模板DNA量与拷贝数之间的关系图。

图10为数字PCR鉴定法特异性检测混合果汁中樱桃；

图中上左为樱桃、芒果，上右为樱桃、梨，下左为芒果、梨，下右为樱桃、梨、芒果。

图11为本发明实验的技术路线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。附图11为本发明实验的技术路线图。

实施例1樱桃物种特异性定性的常规PCR检测

所用材料：樱桃为市售产品，美国车厘子，产自美国；白香瓜、网纹甜瓜、猕猴桃、梨、火龙果、西瓜、榴莲、西柚、橙子、草莓、龙眼、柑橘、柠檬、芒果、保加利亚原装进口Philicon鲜芬酸樱桃汁(浓缩樱桃汁)、冰糖雪梨(浓缩梨汁)、芒果小酪(浓缩芒果汁)购自超市；桑葚由河北农业大学食品科技学院试验室提供；山楂，沙果，桃，苹果，杏，李子由天津市农业科学院创新基地提供。以上材料均由4℃贮藏。

制备鲜榨果汁：

制备流程：清洗水果-破壁处理-成品

1)清洗水果：用清水将水果洗净切块去核；2)破壁处理：称取相同质量的果肉各20g加入100mL凉开水进行破壁，得到鲜榨果汁；3)提取鲜榨果汁DNA。

制备NFC非浓缩还原果汁：

制备流程：清洗水果-破壁处理-过滤-灭菌-成品。

1)清洗水果：用清水将水果洗净切块去核；2)破壁处理：称取相同质量的果肉各20g加入100mL凉开水进行破壁处理；3)过滤：用4层纱布进行过滤处理，去掉残渣，收集果汁；4)灭菌：85℃水浴灭菌3min；5)提取NFC非浓缩果汁DNA。

提取DNA：

果肉DNA的提取：在通用DNA提取CTAB法的基础上，利用配置的CTAB核裂解液、分离液、同时加入聚乙烯吡咯烷酮、β-Mercaptoethanol以去除水果中多余的糖类和酚类，使其避免与DNA结合形成酚类化合物。

果汁DNA的提取：将果汁高速离心得到沉淀，以CTAB方法为基础进行改良，利用配置的SET核分离液、CTAB核裂解液，再加入聚乙烯吡咯烷酮、β-Mercaptoethanol去除糖类和酚类物质。

DNA质量验证：

用改良的CTAB法提取了23种水果基因组DNA，并用tRNALeu(180bp)高等植物内源上下游引物，以稀释后的水果基因组DNA(25ng/μL)为模板进行PCR扩增验证DNA质量(见表1)。反应体系和反应程序(见表2)，并用2.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果。如图1所示，樱桃、网纹甜瓜、猕猴桃等这23种水果果肉DNA均能出现明显的扩增条带，且空白没有被污染，证明提取DNA质量可靠，结果有效，可作为后续实验材料。

表1 tRNALeu引物和序列

表2 tRNALeu-F/R PCR反应体系和程序

PCR体系及退火温度的优化

引物浓度在0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8μmol/L，1.0μmol/L，退火温度在52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃进行引物浓度和退火温度的优化，从而确定C36-F/R最佳的引物浓度和最佳退火温度。

对C36-F/R引物浓度在0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.6μmol/L，0.8μmol/L，1.0μmol/L，退火温度在52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，进行引物浓度和退火温度的优化。从扩增效果和引物二聚体的产生情况来看，确定最佳的引物浓度为0.4μmol/L，最佳的退火温度为58℃。从而确定了C36-F/R的反应体系和反应程序(见表3)。

表3 C36-F/R PCR反应体系和程序

特异性测试

将引物对C36-F/R以樱桃、桑葚等23种水果基因组DNA分别为模板进行PCR扩增，并用2.0％的琼脂糖凝胶电泳观察特异性测试结果。反应体系和反应程序(见表4，图2)。

表4 PCR反应体系和程序

PCR产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳观察结果(见图2)。从图中可以看出C36-F/R(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示)扩增效果好、特异性强。

灵敏度测试

利用优化好的程序将樱桃基因组DNA用鲑鱼精基因组DNA稀释到7个梯度：100％，20％，5％，1％，0.5％，0.1％，0.0％，进行灵敏度测试。

将樱桃基因组DNA用鲑鱼精进行梯度稀释到100％，20％，5％，1％，0.5％，0.1％，0.0％利用优化后的体系和退火温度进行灵敏度的确定，结果表明当DNA浓度不小于0.5％时，均能出现明显的扩增条带(图3)。

确定检出限

LOD指不低于95％的检出情况下的樱桃含量，取60份相同含量的樱桃DNA应最少检出59份阳性。

取60份含量为0.5％的樱桃基因组DNA进行PCR扩增，用2.0％琼脂糖凝胶观察电泳结果，60份DNA全部扩增出目的条带，所以此方法的检出限为0.5％。

果汁测试

以樱桃、芒果和梨为基础，制成了成份不同的三种果汁，分别是鲜榨果汁、NFC非浓缩果汁和浓缩果汁(见表5)，并进行果汁DNA的提取，以C36-F/R对三种类型的成份不同的果汁进行成份测定。

表5鲜榨果汁、NFC非浓缩还原果汁、浓缩果汁的成份

从图4中看出用C36-F/R对鲜榨果汁，NFC非浓缩果汁和浓缩果汁进行了扩增，含有樱桃成份的鲜榨果汁中能检测出樱桃成份，不含樱桃果汁成份的鲜榨果汁未能检测出樱桃，其他果汁类型未检出樱桃成分。

实施例2樱桃物种特异性实时荧光定量PCR检测

利用运用软件primer express 3.0软件对序列C36设计樱桃物种特异性引物和探针，所述引物为C36-QF、C36-QR，探针为C36-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示(C36-QF/QR/QP)。

特异性测试：

将筛选出的引物和探针以樱桃、桑葚等23种水果基因组DNA分别为模板，进行实时荧光PCR特异性测试，反应体系和反应程序见表6。

表6引物探针实时荧光PCR反应体系和程序

对C36-QF/QR/QP进行特异性测试，以樱桃、桑葚等23种水果基因组DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增特异性验证。结果如图5所示，只有樱桃基因组DNA出现扩增峰信号，而其余22种水果基因组DNA均未起峰，空白没有起峰，试验结果有效，从图中可以看出C36-QF/QR/QP扩增效果好，特异性强，且无非特异性扩增。

灵敏度的测试：

将樱桃基因组DNA用鲑鱼精基因组DNA分别稀释浓度为：100％，20％，10％，2％，1％，0.2％，0.1％，做3个平行，模板分别加2μL。

利用樱桃特异性引物和探针C36-QF/QR/QP，在优化后的最佳引物浓度和最佳探针浓度下对含量为100％，20％，10％，2％，1％，0.2％，0.1％的樱桃DNA模板进行实时荧光PCR扩增。结果表明：当模板浓度为0.1％时，扩增曲线Ct值仍为35.99，即Ct值小于36，可以判断为阳性。因此，本方法的灵敏度为0.1％。

标准曲线的绘制：

利用鲑鱼精基因组DNA将樱桃基因组DNA分别稀释到12ng、2.4ng、1.2ng、0.24ng、0.12ng分别做3个平行，模板分别加2μL。

应用C36-QF/QR/QP，在优化后的实时荧光PCR反应体系和反应程序下进行标准曲线的绘制。由图6可知樱桃物种标准曲线的R²为0.998，斜率为-3.357，扩增效率为98.545％，根据《实时荧光定量国际化标准－MIQE指南》检测方法的回归系数最小为0.98，斜率有效范围为-3.1≧斜率≧-3.6，扩增效率有效范围为90％～110％。R²、斜率和扩增效率均在有效范围之内，此次试验结果有效。得到标准曲线的关系式为y＝-3.356x+31.062。同时得到Ct值与樱桃模板量之间具有y＝-1.457ln(x)+29.367的关系，且相关系数R²为0.9985。

果汁的测试：

以樱桃、芒果和梨为基础，制成了成份不同的三种果汁，分别是鲜榨果汁、NFC非浓缩果汁和浓缩果汁，并进行果汁DNA的提取，以C36-QF/QR/QP对三种类型的成份不同的果汁进行成份测定。

结果如图7所示，用C36-QF/QR/QP对四种成份的鲜榨果汁，NFC非浓缩还原果汁和浓缩果汁进行了扩增，含有樱桃成份的鲜榨果汁和NFC非浓缩还原果汁中均能检测出樱桃成份，根据Ct值与樱桃模板量之间具有y＝-1.457ln(x)+29.367的关系计算出樱桃的模板量；不含樱桃果汁成份的鲜榨果汁、NFC非浓缩还原果汁和含樱桃成分的浓缩果汁中未能检测出樱桃；同时利用芒果和梨的特异性引物探针还能检测出芒果成份和梨成份。

实施例3樱桃物种特异性数字PCR检测

利用数字PCR通用程序和通用体系，以樱桃基因组DNA为模板，以C36-QF/QR/QP为引物和探针，进行数字PCR反应，验证引物和探针产生的微滴情况。

特异性测试：

应用C36-QF/QR/QP进行樱桃物种特异性的验证，分别以樱桃、桑葚等基因组DNA为模板进行数字PCR反应，观察微滴生成情况验证特异性。结果表明(图8)C36-QF/QR/QP扩增效果和特异性均较好。

数字PCR体系和退火温度的优化：

应用C36-QF/QR/QP在引物浓度为0.2μmol/L，0.3μmol/，0.4μmol/L，0.5μmol/L和探针浓度为0.1μmol/L，0.15μmol/，0.2μmol/L，0.25μmol/L正交形成16组引物浓度组合进行体系优化。利用优化好的引物浓度和探针浓度以樱桃基因组DNA为模板进行退火温度的优化。设置退火温度为66.0℃，65.5℃，64.3℃，62.4℃，60.0℃，58.0℃，56.7℃，56.0℃。观察微滴生成情况，以确定最佳的引物浓度和最佳的探针浓度。

16个浓度组合中，微滴生成数均大于10000，试验结果有效，数据可靠。根据阴性和阳性微滴的分离程度、微滴的集中程度，最终选择最佳引物浓度为0.5μmol/L，最佳探针浓度为0.2μmol/L。

当温度高于64℃时，阳性微滴生成数少之又少，由此可见，高温抑制数字PCR反应。根据阴性和阳性微滴的分离程度，以及阳性微滴的集中程度最终确定退火温度为：56.7℃。所以最终确定C36-QF/QR/QP的数字PCR体系和反应程序(见表7)。

表7 C36-QF/QR/QP数字PCR反应体系和反应程序

线性定量范围的测定：

用鲑鱼精基因组DNA稀释樱桃基因组DNA到30ng/μL，6ng/μL，1.2ng/μL，0.6ng/μL，0.12ng/μL，0.06ng/μL，0.012ng/μL，0.006ng/μL，利用优化好的反应体系和退火温度进行数字PCR反应。每种不同浓度的樱桃基因组DNA分别做3个平行。记录拷贝数并计算RSD％值，取RSD％不大于25％时每微升的拷贝数的模板量，以线性定量范围下限，同时以模板DNA量为X轴，以拷贝数为Y轴绘制模板DNA量与拷贝数之间的关系图。

以模板DNA量为X轴，以拷贝数为Y轴绘制模板DNA量与拷贝数之间的关系图(如图9)，所示拷贝数和DNA模板量之间具有y＝7.4093x+1.2482的线性关系，且相关系数R²＝1，灵敏度可达0.24ng。

LOQ验证：

取线性定量范围下限的样品DNA进行10次平行定量检测，使RSD％不大于25％。

如表8所示，取线性定量下限0.24ng样品DNA进行10次平行定量检测，RSD％为21.40％，符合小于25％的要求。

表8 LOQ验证结果

果汁的测试：

以樱桃、芒果和梨为基础，制成了成份不同的三种果汁(表9)，分别是鲜榨果汁、NFC非浓缩果汁和浓缩果汁，并进行果汁DNA的提取，以C36-QF/QR/QP对三种类型的成份不同的果汁进行成份测定。

表9鲜榨果汁、NFC非浓缩还原果汁、浓缩果汁的成份

结果如图10和表10所示，用含有樱桃成份的鲜榨果汁、自制NFC非浓缩还原樱桃果汁和浓缩樱桃汁做材料提取DNA，用C36-QF/QR/QP进行数字PCR扩增，结果表明C36-QF/QR/QP均能明显的检测出鲜榨果汁、NFC非浓缩还原果汁和浓缩果汁并得到樱桃的拷贝数。此方法为将鲜榨果汁、自制NFC非浓缩还原果汁和浓缩樱桃果汁的检测提供了试验依据。

表10鲜榨樱桃果汁、NFC非浓缩还原樱桃果汁、浓缩樱桃果汁数字PCR检测结果

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段和引物

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1045

<212> DNA

<213> 樱桃(Prunus avium)

<400> 1

tgcctatgaa gtagcacgtc agttcctttt tgaggaggca ggggaaggca cttcagatcg 60

cactctgtcc tacggtgttt caacgcaagc gtggtcccgg ctttggcaaa tttgtgttcc 120

tcccaaggtt aaggtgctca tctggcgtgt gcttctcaac atccttccca caagagaacg 180

gctgcgcagc aaaggaatcc aaggggatgt tggtgtttgt gggttgtgtg gggcccggga 240

ggagacacta catcatgttc tcttggactg ctctttcaca gctttaatct ggcagaacag 300

ccctttgcag actgaatggc gtgatcatga tacacgggac ctcaatggct ggctcgagca 360

tattctgatg ggtggggatc gtcataaaac tgagcttctt tttatgctta tatggaatct 420

ctggaatgag cgcaacacgg tcgtatggac agcaaagcgt agaagccctt gtgaagttgt 480

tgatggcgct gtgcgattgc tgcaagaatt caaagagcat cagcctacca tgttgcagcc 540

gctctcacga gcccaggcga aatggcagaa accccctctt ggagccataa agatcaatgt 600

tgatggggct ctccatgtgc aaactggttc cggaggaggg gggattatgg ctcgagactc 660

tgcaggatgt ttcgtggctg cccgtgcatg tcgattcagc cacgtctctt ccctagaaca 720

tgctgaaatt cttgctctcc gtgcagccat tctattttcc catgaccttg gcccggggcc 780

aaagatcatt gagggtgatg cgcaaggagt gattcagact gtccaaaccg cgcatgagga 840

taggtccatt ttaagttttc tgttttcaga ttgcaagttt ttactttccc agttagagaa 900

tacttctatt cagtttgctt ttagagaggc taatcgagta gcccaccgct tagctcgttt 960

ggctattacc ttaccaggaa cattaacgtg gctacaggac cctcctgatg ccgtgtgtga 1020

tgttttggta gaggatattt tgtaa 1045

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgcttctcaa catccttcc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccatcaac aacttcac 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggactgctc tttcacagct t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatgctcga gccagccatt 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatctggcag aacagccctt tgca 24

Claims

1.用于樱桃物种鉴定的特异性DNA区段，其特征在于，所述DNA区段的基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.用于樱桃物种特异性鉴定的PCR引物，其特征在于，所述引物为C36-F、C36-R，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

3.用于樱桃物种定量鉴定的荧光定量PCR和数字PCR的引物和探针，其特征在于，所述引物为C36-QF、C36-QR，探针为C36-QP，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

4.一种定性鉴定樱桃物种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述引物C36-F、C36-R。

5.一种定量鉴定樱桃物种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述引物C36-QF、C36-QR和探针C36-QP。