CN116287149B - 鉴别狭叶竹节参的方法、引物、探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴别狭叶竹节参的方法、引物、探针及其应用，属于近缘种鉴定的技术领域。其方法包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物TZF、TZR和探针probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为狭叶竹节参；所述引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物TZR的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针probe的序列如SEQ ID No.3所示。本发明具有极佳的特异性和灵敏度，能够对狭叶竹节参进行快速、可靠的鉴定。

Description

鉴别狭叶竹节参的方法、引物、探针及其应用
技术领域
本发明涉及一种鉴别狭叶竹节参的方法、引物、探针及其应用，属于近缘种鉴定的技术领域。
背景技术
狭叶竹节参（Panax wangianus）为五加科人参属的植物，又名狭叶假人参分布于四川、贵州、云南、广西等地，为高40～50cm的多年生草本，根状茎短，呈竹鞭状，横生，有时有数条肉质根。狭叶竹节参的根茎为一种中药材，味微苦、甘，性温，具有消肿散瘀、活血定痛、利尿、健脾祛痰的功效，能够用于治疗跌打损伤，咳嗽痰多，劳伤腰痛。狭叶竹节参含有多种皂苷：人参皂苷-Rd、-Rgl、-Rhl、Ro，人参三七皂苷N-R1，竹节参皂苷-ClV、-ClVa，姜状三七皂苷ZRl等，与其他人参属的近缘种植物形态特征相似、化学成分部分相同，然而，在药用中，其有效化学成分如皂苷的具体种类和含量差异会造成药效的显著区别，如果将该植物根茎与其他近缘植物的根茎混淆，则会影响组方的药效，耽误患者的治疗。因此，在人参属植物生长区域，尤其是在人参属植物野生资源丰富的区域，对近缘种来源药材的可靠鉴定方法尤为重要。
目前，传统的鉴定方法主要包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，但传统的鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状是与环境紧密相关的表现型，受植物生长年限、生理状态以及生长环境的影响，难以保证鉴定结果的可靠性。近年来，随着DNA分子技术的发展，分子生物学鉴定方法应运而生，将DNA分子标记技术应用于植物的鉴别中，直接以植物的基因组序列作为鉴定依据，大大提高了鉴定结果的可靠性。但已应用于参类药材鉴定的RAPD、SSR、RFLP等技术存在操作步骤复杂、工作量大、实验结果重复性差等缺点。实时荧光定量PCR技术应用于物种鉴定时，使用一组或多组特异性的引物探针，通过检测荧光强度变化达到鉴定目的，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优势，检测效率高，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的鉴定方法可靠性差、操作复杂、工作量大、实验结果重复性差等不足，提供一种鉴别狭叶竹节参的方法、引物、探针及其应用。
本发明的第一方面提供鉴别狭叶竹节参的方法，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物TZF、TZR和探针probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为狭叶竹节参；所述引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物TZR的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针probe的序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，所述探针probe的5’端修饰CY5，所述探针probe的3’端修饰MGB。
优选的，所述模板最低检测下限为0.0001ng/μL的。
优选的，所述引物TZF和TZR的浓度均为0.45～0.55μmol/μL。
优选的，所述探针probe的浓度0.45～0.55μmol/μL。
本发明的第二方面提供鉴别狭叶竹节参的引物对，所述引物对由引物TZF和TZR组成，所述引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物TZR的序列如SEQ ID No.2所示。
本发明的第三方面提供鉴别狭叶竹节参的探针，所述探针probe的序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明的第四方面提供鉴别狭叶竹节参的试剂，含有上述的引物对和上述的探针probe。
本发明的第五方面提供上述的引物对、上述的探针或上述的试剂在鉴别狭叶竹节参中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的鉴别方法、引物对、探针及试剂具有极佳的特异性和灵敏度，能够准确地鉴定或检测人参属中狭叶竹节参种，实现了对狭叶竹节参的快速鉴定。
附图说明
图1为本发明实施例二的标准曲线。
图2为本发明实施例二的扩增曲线，本实施例的检测采用96孔板，列：1-12，行：A-H，图中A-H的曲线为各行孔的检测结果。
图3为本发明实施例三的扩增曲线，本实施例的检测采用96孔板，列：1-12，行：A-H，图中A-H的曲线为各行孔的检测结果。
图4为本发明实施例四的扩增曲线，本实施例的检测采用96孔板，列：1-12，行：A-H，图中A-H的曲线为各行孔的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例一 目标植物样品的PCR扩增及鉴定
以提取的狭叶竹节参的基因组DNA作为模板，采用引物TZF和TZR进行PCR扩增，采用探针probe进行实时荧光定量PCR检测，引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，引物TZR的序列如SEQ ID No.2所示，探针probe的序列如SEQ ID No.3所示，探针probe的5’端修饰CY5，探针probe的3’端修饰MGB。其中，扩增的反应体系如表1所示，扩增程序如表2所示，扩增后获得鉴定结果与PCR产物。
表1 反应体系
表2 扩增程序
实施例二 狭叶竹节参标准质粒的制备和探针标准曲线的创建
根据实施例一获得的PCR产物制备阳性克隆样品，然后进行测序，选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用质粒提取试剂盒完成质粒的提取。
计算质粒浓度拷贝数，计算如下所示：
C=A·B-1×6.02×1014，
式中，A为质粒浓度（ng/μL），B为质粒DNA分子量，C为copies·μL-1。计算得到母液浓度：狭叶竹节参标准质粒（2.37*1010copies·μL-1），作为实验质粒标准品使用。
使用溶剂将狭叶竹节参质粒标准品稀释至2.37*1010copies·μL-1，再稀释至2.37*108copies·μL-1，然后按10倍浓度将其稀释为5个梯度，然后分别以稀释后的各梯度质粒标准品为模板，在实施例一的反应条件下进行实时荧光定量PCR检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。狭叶竹节参质粒标准品检测结果如表3所示，标准曲线如图1所示，相关扩增曲线如图2所示。
狭叶竹节参标准曲线方程：y = -3.4723x + 46.422，R2=0.9998，R2达到0.99以上，符合实时荧光定量PCR的标准要求。
表3 狭叶竹节参质粒标准品检测结果
实施例三 鉴别狭叶竹节参的特异性验证
本实施例提供一种鉴别狭叶竹节参的方法，包括以下步骤：分别以狭叶竹节参以及人参、西洋参、姜状三七、珠子参、三七和屏边三七共七个近缘种的基因组DNA为模板，并设立阴性对照组（ddH2O），采用实施例一的引物对、探针probe、反应体系及扩增程序对模板进行扩增，每个样本重复3次，检测结果如表4所示，扩增曲线如图3所示。
表4 特异性检测结果
由表4可见，在人参属的七个近缘种中，引物对及探针probe仅与狭叶竹节参有扩增反应和荧光现象，特异性好，3个重复的CT值相近，重复性好。
实施例四 引物探针的灵敏度验证
将实施例三采用的狭叶竹节参样本的DNA浓度分别设置1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01ng/μL、0.001 ng/μL 、0.0001 ng/μL 、0.00001 ng/μL 六个浓度梯度，采用实施例一的引物对、探针probe、反应体系及扩增程序对样本进行扩增，以测试引物对和探针probe的灵敏度，每个样本重复三次，并使用实时荧光定量PCR仪进行测定，检测结果如表5和图4所示。
表5 狭叶竹节参引物探针灵敏度检测结果
由表5可见，本发明的引物对和探针probe对狭叶竹节参的灵敏度均较高，最低检测下限为0.0001 ng/μL，平均CT值为33.869。
实施例五 重复性验证
1.同实验员同实时荧光定量PCR仪不同批次酶之间的重复性验证；
2.同批次酶同实时荧光定量PCR仪不同人员操作之间的重复性验证。
样本采用野外采集经形态学及叶绿体基因组对比确认为狭叶竹节参的两个已知样本，采用实施例一的引物对、探针probe、反应体系及扩增程序，每个样本重复3次，通过计算变异系数（CV%）值来进行重复性评价。变异系数值的计算公式为：
CV=SD(标准偏差)/Mean(平均值)×100%。
同实验员同QPCR仪不同批次酶的验证结果如表6所示，同批次酶同QPCR仪不同人员操作的验证结果如表7所示。
表6.1 同实验员同QPCR仪第一批次酶的验证结果
表6.2 同实验员同QPCR仪第二批次酶的验证结果
表7.1 同批次酶同QPCR仪实验员A操作的验证结果
表7.2 同批次酶同QPCR仪实验员B操作的验证结果
由表6.1、6.2、7.1和7.2可见，无论是同实验员同QPCR仪不同批次酶之间、同批次酶同QPCR仪不同人员操作之间，其重复性验证结果变异系数值均小于3%，实验重复性好，不同批次聚合酶稳定性优良，反应体系稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.鉴别狭叶竹节参的方法，其特征在于，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物TZF、TZR和探针probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为狭叶竹节参；所述引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物TZR的序列如SEQ IDNo.2所示，所述探针probe的序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的鉴别狭叶竹节参的方法，其特征在于，所述探针probe的5’端修饰CY5，所述探针probe的3’端修饰MGB。
3.根据权利要求1所述的鉴别狭叶竹节参的方法，其特征在于，所述模板最低检测下限为0.0001ng/μL。
4.根据权利要求1所述的鉴别狭叶竹节参的方法，其特征在于，所述引物TZF和TZR的浓度均为0.45～0.55μmol/μL。
5.根据权利要求1所述的鉴别狭叶竹节参的方法，其特征在于，所述探针probe的浓度0.45～0.55μmol/μL。
6.鉴别狭叶竹节参的试剂，其特征在于，含有引物对和探针probe，其中引物对包含引物TZF和引物TZR，引物TZF的序列如SEQ ID No.1所示，引物TZR的序列如SEQ ID No.2所示；探针probe的序列如SEQ ID No.3所示。
7.权利要求6所述的试剂在鉴别狭叶竹节参中的应用。
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