CN117965799A - 鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用，涉及植物鉴定的技术领域，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用第一引物A2‑F、A2‑R、第一探针A2‑probe和第二引物A3‑F、A3‑R、第二探针A3‑probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为滇重楼杂交个体；所述第一引物A2‑F的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一引物A2‑R的序列如SEQ ID No.2所示，所述第一探针A2‑probe的序列如SEQ ID No.3所示，所述第二引物A3‑F的序列如SEQ ID No.4所示，所述第二引物A3‑R的序列如SEQ ID No.5所示，所述第二探针A3‑probe的序列如SEQ ID No.6所示。本发明具有极佳的特异性和灵敏度，能够对滇重楼杂交个体进行快速、可靠的鉴定。
Description
技术领域
本发明属于植物鉴定的技术领域，具体涉及鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用。
背景技术
滇重楼(Paris yunnanensis) 为黑药花科重楼属多年生药用植物，以干煤根茎入药，具有清热解毒、止痛消肿、凉肝定惊等功效，还有抗肿瘤、抗病毒、消炎等药理作用。近年来由于药用需求增多而被大肆采挖，滇重楼野生资源逐渐枯竭，人工大面积栽培已成为长期的发展趋势，且滇重楼遗传纯合个体和杂合个体在药效上有一定区别，为了更好的按需对滇重楼进行栽培，须在栽培前对其进行鉴别。
滇重楼药用植物的传统鉴定方法为基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。传统鉴定方法的理论基础建立于分类群的性状特征分析，这些性状特征是与环境紧密相关的表现型。从分子遗传学角度来看，物种表现型的差异归根结底应追溯到基因型的差异，即在DNA序列上的差异。因此，对基因组序列差异的比较研究无疑为植物分类和鉴定提供了本质依据。随着生命科学不断取得重大突破，分子生物学鉴定方法应运而生，此类方法应用DNA分子标记技术鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展。DNA分子标记鉴别应用于参类药材鉴别已有不少的报道，RFLP、SSR、RAPD、AP-PCR、AFLP、ISSR、SNP等技术相继应用于药用植物的鉴别鉴定。然而这些技术除了需要进行PCR扩增还需要通过电泳或测序技术呈现鉴定结果，存在操作步骤繁琐、工作量大、人为干扰大、检测灵敏度低、特异性和实验结果重复性差等弱点，特别是在鉴定工业加工、高温烘干过的药材，难以在实际中得到应用，而逐渐退出舞台。随着分子生物学的发展和基因组时代的到来，一些新的药用植物的鉴定提供了新的方法。
实时荧光PCR技术在物种鉴定上已经是非常成熟与成功的技术，使用一组或多组特异性的引物探针，通过监测荧光强度变化达到鉴定的目的，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测效率高等优势，具有良好的市场应用前景和推广应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的鉴定方法可靠性差、操作复杂、工作量大、实验结果重复性差等不足，提供一种鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种鉴别滇重楼杂交个体的方法，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用第一引物A2-F、A2-R、第一探针A2-probe和第二引物A3-F、A3-R、第二探针A3-probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为滇重楼杂交个体；所述第一引物A2-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一引物A2-R的序列如SEQ ID No.2所示，所述第一探针A2-probe的序列如SEQ ID No.3所示，所述第二引物A3-F的序列如SEQ ID No.4所示，所述第二引物A3-R的序列如SEQ ID No.5所示，所述第二探针A3-probe的序列如SEQ IDNo.6所示。
上述引物和探针的序列如表1。
具体的，上述第一探针A2-probe的5’端修饰VIC，所述第一探针A2-probe的3’端修饰MGB，所述第二探针A3-probe的5’端修饰ROX，所述第二探针A3-probe的3’端修饰MGB。
具体的，上述模板最低检测下限为0.0001ng/μL。
具体的，上述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
具体的，上述实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
本发明的第二方面提供鉴别滇重楼杂交个体的引物对，所述引物对包括第一引物A2-F、第一引物A2-R、第二引物A3-F和第二引物A3-R，所述第一引物A2-F的序列如SEQ IDNo.1所示，所述第一引物A2-R的序列如SEQ ID No.2所示，所述第二引物A3-F的序列如SEQID No.4所示，所述第二引物A3-R的序列如SEQ ID No.5所示。
本发明的第三方面提供鉴别滇重楼杂交个体的探针，所述探针包括第一探针A2-probe和第二探针A3-probe，所述第一探针A2-probe的序列如SEQ ID No.3所示，所述第二探针A3-probe的序列如SEQ ID No.6所示。
本发明的第四方面提供鉴别滇重楼杂交个体的试剂，含有上述的引物对和探针。
本发明的第五方面提供上述试剂在鉴别滇重楼杂交个体中的应用。
表1滇重楼杂交个体引物探针序列
本发明的有益效果是：
本发明的鉴别方法及试剂具有极佳的特异性和灵敏度，通过对检测CT值的判断就能够准确地鉴定或检测重楼属中的滇重楼杂交个体，实现了对滇重楼杂交个体的快速鉴定。
附图说明
图1为滇重楼杂交个体质粒（A2）的标准曲线；
图2为滇重楼杂交个体质粒（A3）的标准曲线；
图3为滇重楼杂交个体质粒（A2）标准品的扩增图谱；
图4为滇重楼杂交个体质粒（A3）标准品的扩增图谱；
图5为第一引物探针特异性检测的扩增图谱；
图6为第二引物探针特异性检测的扩增图谱；
图7为第一引物探针灵敏度检测的扩增图谱；
图8为第二引物探针灵敏度检测的扩增图谱；
图9为第一引物探针的第一批次酶验证的扩增图谱；
图10为第一引物探针的第二批次酶验证的扩增图谱；
图11为第二引物探针的第一批次酶验证的扩增图谱；
图12为第二引物探针的第二批次酶验证的扩增图谱；
图13为第一引物探针实验员A操作验证的扩增图谱；
图14为第一引物探针实验员B操作验证的扩增图谱；
图15为第二引物探针实验员A操作验证的扩增图谱；
图16为第二引物探针实验员B操作验证的扩增图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一 目标植物样品的PCR扩增及鉴定
以提取的滇重楼杂交个体的基因组DNA作为模板，采用第一引物A2-F、A2-R和第二引物A3-F、A3-R进行PCR扩增，采用第一探针A2-probe和第二探针A3-probe进行实时荧光定量PCR检测，引物A2-F的序列为GGACGATGCATATGTAGAAAGCC，引物A2-R的序列为CGACTATCTCCACTATAGAACGAGGA，引物A3-F的序列为TTCACGTTTCTGTGAAATATATACACG，引物A3-R的序列为CCAGAAAAAGGAAAAAGGGGA，探针A2-probe的序列为CCGATTTTATTTTTATCTGTTTT，探针A2-probe的5’端修饰VIC，探针A2-probe的3’端修饰MGB，探针A3-probe的序列为TATTTCTGAATTATCACTAGA，探针A3-probe的5’端修饰ROX，探针A3-probe的3’端修饰MGB。其中，扩增的反应体系如表1.1所示，扩增程序如表1.2所示，扩增后获得鉴定结果与PCR产物。
表1.1 反应体系
表1.2 扩增程序
实施例二 滇重楼杂交个体标准质粒的制备和探针标准曲线的创建
根据实施例一获得的PCR产物制备阳性克隆样品，然后进行测序，选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用质粒提取试剂盒完成质粒的提取。
计算质粒浓度拷贝数，计算如下所示：
C=A•B-1×6.02×1014，
式中，A为质粒浓度（ng/μL），B为质粒DNA分子量，C为copies•μL-1。计算得到母液浓度：滇重楼杂交个体(A2)标准质粒（2.19*1010copies•μL 1）和滇重楼杂交个体(A3)标准质粒（2.28*1010copies•μL 1），作为实验质粒标准品使用。
使用溶剂将滇重楼杂交个体质粒（A2）、（A3）标准品按10倍浓度将其稀释为5个梯度，然后分别以稀释后的各梯度质粒标准品为模板，在实施例一的反应条件下进行实时荧光定量PCR检测，每组试验重复3次，制定标准曲线。滇重楼杂交个体质粒（A2）标准品检测结果如表2.1所示，其标准曲线如图1所示，相关扩增图谱如图3所示，滇重楼杂交个体质粒（A3）标准品检测结果如表2.2所示，其标准曲线如图2所示，相关扩增图谱如图4所示。
滇重楼杂交个体标准曲线方程：
滇重楼杂交个体（A2）标准曲线：y = -4.3779x + 50.302；R²=0.9988；R²大于0.98，符合实时荧光定量PCR的标准要求。
滇重楼杂交个体（A3）标准曲线：y = -4.3467x + 49.211;R² = 0.9997；R²大于0.98，符合实时荧光定量PCR的标准要求。
表2.1 滇重楼杂交个体质粒（A2）标准品检测结果
表2.2 滇重楼杂交个体质粒（A3）标准品检测结果
实施例三 鉴别滇重楼杂交个体的特异性验证
本实施例提供一种鉴别滇重楼杂交个体的方法，包括以下步骤：分别以滇重楼遗传纯合个体（A1）、滇重楼杂交个体（A2、A3）以及多花重楼、高平重楼、海南重楼等十九个近缘种的基因组DNA为模板，并设立阴性对照组（ddH2O），采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序对模板进行扩增，每个样本重复3次，第一引物A2-F、A2-R和第一探针A2-probe的检测结果如表3.1、3.2、3.3所示，扩增图谱如图5所示，第二引物A3-F、A3-R和第二探针A3-probe的检测结果如表3.4、3.5、3.6所示，扩增图谱如图6所示。
表3.1特异性检测结果（A2）
表3.2特异性检测结果（A2）
表3.3特异性检测结果（A2）
表3.4特异性检测结果（A3）
表3.5特异性检测结果（A3）
表3.6特异性检测结果（A3）
由表3.1~3.6可见，本发明提供的引物对及探针仅与滇重楼杂交个体有扩增反应和荧光现象，特异性好，且每3个重复的CT值相近，重复性好。
实施例四 引物探针的灵敏度验证
将实施例三采用的滇重楼杂交个体样本的DNA浓度分别设置1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL、0.0001 ng/μL、0.00001 ng/μL、0.000001ng/μL七个浓度梯度，采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序对样本进行扩增，以测试引物对和探针的灵敏度，每个样本重复三次，并使用实时荧光定量PCR仪进行测定，第一引物A2-F、A2-R和第一探针A2-probe的检测结果如表4.1所示，扩增图谱如图7所示，第二引物A3-F、A3-R和第二探针A3-probe的检测结果如表4.2所示，扩增图谱如图8所示。
表4.1引物探针灵敏度检测结果（A2）
表4.2引物探针灵敏度检测结果（A3）
由表4.1和4.2可见，本发明的引物对和探针对滇重楼杂交个体的灵敏度均较高，第一引物探针灵敏度0.0001ng/μL；第二引物探针灵敏度0.0001ng/μL。
实施例五 重复性验证
1.同实验员同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同批次酶之间的重复性验证；
2.同批次酶同实时荧光定量PCR仪（QuantStudio Dx)不同人员操作之间的重复性验证。
样本采用野外采集经形态学及叶绿体基因组对比确认为滇重楼杂交个体的两个已知样本，采用实施例一的引物对、探针、反应体系及扩增程序，每个样本重复3次，通过计算变异系数（CV%）值来进行重复性评价。变异系数值的计算公式为：
CV=SD(标准偏差)/Mean(平均值)×100%。
同实验员同QPCR仪不同批次酶的验证结果如表5.1、5.2、5.3、5.4所示；第一引物探针的第一批次酶验证的扩增图谱如图9，第一引物探针的第二批次酶验证的扩增图谱如图10，第二引物探针的第一批次酶验证的扩增图谱如图11，第二引物探针的第二批次酶验证的扩增图谱如图12；同批次酶同QPCR仪不同人员操作的验证结果如表5.5、5.6、5.7、5.8所示；第一引物探针实验员A操作验证的扩增图谱如图13，第一引物探针实验员B操作验证的扩增图谱如图14，第二引物探针实验员A操作验证的扩增图谱如图15，第二引物探针实验员B操作验证的扩增图谱如图16。
表5.1 同实验员同QPCR仪第一批次酶的验证结果（A2）
表5.2 同实验员同QPCR仪第二批次酶的验证结果（A2）
表5.3 同实验员同QPCR仪第一批次酶的验证结果（A3）
表5.4 同实验员同QPCR仪第二批次酶的验证结果（A3）
表5.5 同批次酶同QPCR仪实验员A操作的验证结果（A2）
表5.6 同批次酶同QPCR仪实验员B操作的验证结果（A2）
表5.7 同批次酶同QPCR仪实验员A操作的验证结果（A3）
表5.8 同批次酶同QPCR仪实验员B操作的验证结果（A3）
由表5.1~5.8可见，无论是同实验员同QPCR仪不同批次酶之间、同批次酶同QPCR仪不同人员操作之间，其重复性验证结果变异系数值均小于3%，实验重复性好，不同批次聚合酶稳定性优良，反应体系稳定。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (9)
1.鉴别滇重楼杂交个体的方法，其特征在于：包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用第一引物A2-F、A2-R、第一探针A2-probe和第二引物A3-F、A3-R、第二探针A3-probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为滇重楼杂交个体；所述第一引物A2-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一引物A2-R的序列如SEQ ID No.2所示，所述第一探针A2-probe的序列如SEQ ID No.3所示，所述第二引物A3-F的序列如SEQ IDNo.4所示，所述第二引物A3-R的序列如SEQ ID No.5所示，所述第二探针A3-probe的序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼杂交个体的方法，其特征在于：所述第一探针A2-probe的5’端修饰VIC，所述第一探针A2-probe的3’端修饰MGB，所述第二探针A3-probe的5’端修饰ROX，所述第二探针A3-probe的3’端修饰MGB。
3.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼杂交个体的方法，其特征在于：所述模板最低检测下限为0.0001ng/μL。
4.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼杂交个体的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2xT5 Fast qPCR Mix 10μL、10uM的上游引物0.7μL、10uM的下游引物0.7μL、10uM的探针0.6μL、待测模板1μL，使用ddH2O补足至20μL反应体系。
5.根据权利要求1所述的鉴别滇重楼杂交个体的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增程序为：95℃ 1min，一个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环；在60℃退火延伸阶段采集对应荧光1min。
6.鉴别滇重楼杂交个体的引物对，其特征在于：所述引物对包括第一引物A2-F、第一引物A2-R、第二引物A3-F和第二引物A3-R，所述第一引物A2-F的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一引物A2-R的序列如SEQ ID No.2所示，所述第二引物A3-F的序列如SEQ ID No.4所示，所述第二引物A3-R的序列如SEQ ID No.5所示。
7.鉴别滇重楼杂交个体的探针，其特征在于：所述探针包括第一探针A2-probe和第二探针A3-probe，所述第一探针A2-probe的序列如SEQ ID No.3所示，所述第二探针A3-probe的序列如SEQ ID No.6所示。
8.鉴别滇重楼杂交个体的试剂，其特征在于：含有权利要求6所述的引物对和权利要求7所述的探针。
9.权利要求8所述的试剂在鉴别滇重楼杂交个体中的应用。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410362654.2A Pending CN117965799A (zh) | 2024-03-28 | 2024-03-28 | 鉴别滇重楼杂交个体的方法、引物、探针及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117965799A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468709A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-12-25 | 南京师范大学 | 霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法 |
| CN103484558A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-01 | 云南农业大学 | 滇重楼的分子鉴定方法 |
| CN105483282A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-04-13 | 云南省农业科学院药用植物研究所 | 一组pcr特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法 |
| CN110791583A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-02-14 | 浙江省中药研究所有限公司 | 一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用 |
-
2024
- 2024-03-28 CN CN202410362654.2A patent/CN117965799A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103468709A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-12-25 | 南京师范大学 | 霍山石斛的叶绿体基因组及种质鉴定方法 |
| CN103484558A (zh) * | 2013-10-16 | 2014-01-01 | 云南农业大学 | 滇重楼的分子鉴定方法 |
| CN105483282A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-04-13 | 云南省农业科学院药用植物研究所 | 一组pcr特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法 |
| CN110791583A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-02-14 | 浙江省中药研究所有限公司 | 一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DAN WANG等: "Population Genetic Analysis of Paris polyphylla var. yunnanensis Based on cpDNA Fragments", GENES, vol. 14, no. 9, 2 September 2023 (2023-09-02), pages 1754 * |
| NCBI: "Primer-BLAST Results", Retrieved from the Internet <URL:https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_2506849988> * |
| 刘涛等: "滇重楼的psbA-trnH条形码分子鉴定研究", 天然产物研究与开发, vol. 27, no. 5, 31 May 2015 (2015-05-31), pages 758 - 762 * |
| 马剑;李迪强;张于光;薛达元;: "基于matK基因的几种重要重楼属植物遗传关系分析", 中国中药杂志, no. 01, 1 January 2010 (2010-01-01), pages 18 - 21 * |
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