CN105002166A

CN105002166A - 褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法

Info

Publication number: CN105002166A
Application number: CN201510504086.6A
Authority: CN
Inventors: 姜陆; 宋锋林; 程晓兰; 高玉峰
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明涉及褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法和应用，属于媒介生物检疫技术研究领域。褐斑大蠊分子标准样品，以采集褐斑大蠊成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到褐斑大蠊的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或Tris-EDTA缓冲液中。本发明得到的褐斑大蠊的分子标准品，理化性质好，可采用特异性引物通过PCR方法检测，灵敏度可达到10^-3倍，该标准品作为阳性参照物，适用于出入境卫生检疫部门及其他行业对褐斑大蠊的鉴定检测，可提高鉴定结果的准确性。

Description

褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法

技术领域

本发明涉及褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法和应用，属于媒介生物检疫技术研究领域。

背景技术

国内外关于媒介生物分子DNA标准样品的研究则尚处于起步的阶段，很多问题亟待解决。由于受生物发育阶段的限制以及近缘种生物形态的相似性、实际工作中样品的不完整性等原因,传统的形态学手段进行物种鉴定遇到很多实际困难。现有分子DNA技术被证明是一个行之有效的生物鉴定手段。目前，我国还没有经过国家认可的、统一的、规范化的分子DNA标准样品，在国际上也没有该类标准样品。分子生物学鉴定技术是媒介生物分类鉴定新的技术手段。

分子生物学技术可以从分子水平上阐明物种间的差别，如可利用DNA探针技术、DNA测序技术、PCR技术等对媒介生物样品在分子水平上进行分类鉴定。媒介生物分子标准样品可作为实验室对媒介生物进行分子鉴定等技术的参照物，保证测试结果的可溯源性。因此，本项目研制的褐斑大蠊标准样品将为褐斑大蠊分子鉴定工作提供参照和依据，为我国分子标准样品的研究工作起到一定得推动作用。

发明内容

本发明的目的是提供褐斑大蠊分子标准样品，均匀性与稳定性良好，本发明的另一目的是提供褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，方法操作简单，易于制备。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：褐斑大蠊分子标准样品，其特征在于：采集褐斑大蠊成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到褐斑大蠊的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或Tris-EDTA（TE）缓冲液中。

进一步地，所述DNA纯度：OD260/280=1.85。

本发明褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步为褐斑大蠊DNA提取：

野外采集褐斑大蠊成虫，通过实验室条件饲养，提取褐斑大蠊DNA；

第二步为核酸标准样品的制备：

将测定浓度后的DNA按1μg±0.1μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装100管，然后冻干，即为目的标准品。

进一步地，所述第一步中褐斑大蠊DNA提取的具体步骤为：

（1）动物组织裂解：

取2-25mg的动物组织置于2mL离心管中，用剪刀剪成碎块；

加入180μL的Buffer GL、20μL的蛋白酶K（Proteinase K）和10μL的浓度为10mg/mL的RNase A，于56℃水浴中温浴2-3小时，至动物组织完全裂解，后12,000rpm离心2分钟，去除杂质；

（2）向裂解液中加入200μL Buffer GB 和200μL 100%乙醇，充分混匀；

（3）将试剂盒中的离心柱安置于收集管上，将上述操作（2）混合溶液移至离心柱中，12,000 rpm离

心2分钟，弃滤液；

（4）将500μL的Buffer WA加入至离心柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（5）在Buffer WB中加入指定体积的100%乙醇，混匀后，将700μL的Buffer WB加入至离心柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将离心柱安置于收集管上，12,000 rpm离心2分钟；

（8）将离心柱安置于新的1.5mL的离心管上，在离心柱膜的中央处加入50-200μL的灭菌水或洗脱缓冲液，室温静置5分钟；

（9）12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。

进一步地，所述操作步骤（5）中沿离心柱的管壁四周加入Buffer WB。

进一步地，所述步骤（8）中灭菌水或洗脱缓冲液加热至65℃。

进一步地，对制得的标准样品进行定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA：

取制备的核酸标准样品，加入50μL的TE，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物COI-1和COI-2进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

上游引物COI-1: 5’- GGTCA ACAAATCATA AAGATATTGG -3’

下游引物COI-2: 5’- TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3’

反应体系：

模板 1.0 μL

上游引物COI-1 1.0 μL

下游引物COI-2 1.0 μL

Taq酶 0.5 U

dNTP 2.0 μL

10×Buffer 2.5 μL

Total 25.0 μL

反应条件：

94℃ 3min

95℃ 30s

50℃ 45s

72℃ 1min 循环35次

72℃ 7min。

进一步地，对制得的标准样品进行DNA完整性、浓度及纯度检测：

（1）DNA完整性检测：用提取的DNA直接进行120V，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察条带的完整性；

（2）DNA浓度及纯度检测：吸取1μL DNA用分光光度计测定260nm和280nm的吸收值，然后根据OD260/OD280值判断DNA纯度，并根据OD260计算其浓度，按以下公式计算：

DNA浓度(ng/μl)=OD260×50

进一步地，对制得的标准样品进行均匀性、稳定性分析：

（1）标准样品均匀性分析：采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，取随机抽取的15管标准样品，每管标准样品分成2份子样进行测试，后进行F检验确认样品均匀性；

（2）标准样品稳定性分析：对制备的标准样品分阶段每次取二份样品，按照不同保存条件进行定性测定，每份样品以测定3次值为其定值结果，且在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。

进一步地，对制得的标准样品进行灵敏度检验：将制得的分子标准品稀释至10ng/μl，作为母液，然后按10倍浓度梯度进行稀释并进行PCR检测，由条带不可见时对应的标准品浓度判定该标准品的灵敏度。

本发明采集褐斑大蠊成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到褐斑大蠊的分子标准品，其理化性质好，可采用特异性引物通过PCR方法检测，灵敏度可达到10^-3倍，适用于出入境卫生检疫部门及其他行业对褐斑大蠊的鉴定检测，以该标准品作为阳性参考对照物，在分类鉴定分子检测中形成对比，提高鉴定结果的灵敏性和准确性。

附图说明

图1为褐斑大蠊总DNA电泳图。

图2 为褐斑大蠊特异性引物扩增电泳结果图，图中：M为Marker 750bp ，1-4为目的DNA。

图3 为灵敏度实验结果图，图中由左至右，每一格为一个浓度，依次是10^-1，10^-2,10^-3,10^-4,10^-5。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例1

褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，包括如下步骤：

第一步为褐斑大蠊DNA提取：

野外采集褐斑大蠊成虫，通过实验室条件饲养，采用试剂盒提取褐斑大蠊DNA：

（1）动物组织裂解：

取10mg的动物组织置于2mL离心管中，用剪刀尽可能地剪成碎块；

加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K和10μL的浓度为10mg/mL的RNase A，于56℃水浴

中温浴2小时，至动物组织完全裂解，后12,000rpm离心2分钟，去除杂质；对于难裂解的材料可以适当延长裂解时间甚至过夜裂解；

心2分钟，弃滤液；

（5）在Buffer WB中加入指定体积的100%乙醇，混匀后，沿离心柱的管壁四周加入700μL的Buffer WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将离心柱安置于收集管上，12,000 rpm离心2分钟；

（8）将离心柱安置于新的1.5mL的离心管上，将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至65℃，在离心柱膜的中央处加入100μL的灭菌水或洗脱缓冲液，室温静置5分钟，将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至65℃的目的是在使用时有利于提高洗脱效率；

（9）12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。

第二步为核酸标准样品的制备：

将测定浓度后的DNA按1μg±0.1μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装100管，然后采用真空冷冻干燥机F05508冻干，冻干温度为-50℃，压强为2.66Pa，冻干所得为目的标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或TE缓冲液中；

第三步为对制得的标准样品进行定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA：

取制备的核酸标准样品，加入50μL的TE，溶解后作为模板使用，经采用人工合成的特异性引物COI-1和COI-2进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

上游引物COI-1: 5’- GGTCA ACAAATCATA AAGATATTGG -3’

下游引物COI-2: 5’- TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3’

反应体系：

模板 1.0 μL

上游引物COI-1 1.0 μL

下游引物COI-2 1.0 μL

Taq酶 0.5 U

dNTP 2.0 μL

10×Buffer 2.5 μL

Total 25.0 μL

反应条件：94℃ 3min；95℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 1min，循环35次；72℃ 7min。

实施例2

对实施例1中制得的褐斑大蠊分子标准样品进行完整性、浓度及纯度检测：

（1）DNA完整性检测：直接法-用提取的DNA直接电泳检查，120V，1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察条带的完整性，检测结果见图１，条带完整，无弥散状，说明DNA条带完整性较好；

（2）DNA浓度及纯度检测：紫外分光光度计法-吸取1μL DNA用分光光度计测定260nm和280nm的吸收值，然后根据OD260/OD280值判断DNA纯度，并根据OD260计算其浓度，按以下公式计算：

DNA浓度(ng/μl)=OD260×50

当OD260/OD280＜1.8，表示蛋白质含量较高；OD260/OD280＞2.0，表示RNA含量较高；当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。

对实施例1中制得的褐斑大蠊分子标准样品进行均匀性、稳定性分析：

（1）标准样品均匀性分析：为检查制备的目的核酸标准样品的均匀性，采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样进行测试，结果见（表１）数据进行F检验（表2）确认样品均匀性。

（2）标准样品稳定性分析：

本有证标准样品参考国外同等带证有证标准样品的稳定性期限规定说明

（在真空、避光、-２０℃下贮存，稳定有效期为两年）为依据，其生物特性，以2年为期，对制备的标准样品分阶段每次取二份样品，按照不同保存条件进行定性测定，每份样品以测定3次值为其定值结果。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。

依据上述测定方法分别计算结果，本褐斑大蠊分子标准样品在真空、避光、-２０℃下贮存，稳定有效期为2年，测定结果见表3。

斜率可用下式计算：

式中：

截距由下式计算：

直线上的点的标准偏差可由下式计算：

取其平方根 s=0.00251％，与斜率相关的不确定度用下式计算：

自由度为n-2=5和p=0.95（95％置信水平）的学生分布t－因子等于2.57。由于

，故斜率是不显著的。因而稳定性实验中未观测到不稳定性。

对实施例1中制得的褐斑大蠊分子标准样品进行灵敏度检验：

将该病菌的分子标准品稀释至10ng/μl，作为母液，然后按10倍浓度梯度进行稀释，按说明书方法进行PCR检测。检测结果表明当该样品稀释至1000（即10^-3×）倍，条带不可见，因此判定该标准品的灵敏度为10^-3。

表1 褐斑大蠊分子标准品均匀性检测结果

表2褐斑大蠊分子标准品均匀性F检验结果

结论：在95％置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性是可接受的。

表３褐斑大蠊分子标准品稳定性检测结果（-20℃）

以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出简单的推演及替换，都应当视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 姜陆，宋锋林，程晓兰，高玉峰

<120> 褐斑大蠊分子标准样品及其制备方法

<130> 20150804

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> COI-1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 根据序列特异性而设计，作为褐斑大蠊分子标准样品PCR特异性检测的上游

引物

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(25)

<400> COI-1

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> COI-2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 根据序列特异性而设计，作为褐斑大蠊分子标准样品PCR特异性检测的下游

引物

<220>

<221> Artificial Sequence

<222> (1)..(26)

<400> COI-2

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims

1.褐斑大蠊分子标准样品，其特征在于：采集褐斑大蠊成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到褐斑大蠊的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量1μg±0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8-2.0；（4）易溶于水或Tris-EDTA缓冲液中。

2.根据权利要求1所述的褐斑大蠊分子标准样品，其特征在于：所述DNA纯度：OD260/280=1.85。

3.褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步为褐斑大蠊DNA提取：

第二步为核酸标准样品的制备：

将测定浓度后的DNA按1μg±0.1μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装100管，然后冻干，冻干温度为-50℃，压强为2.66Pa，冻干所得即为目的标准品。

4.根据权利要求3所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：所述第一步中褐斑大蠊DNA提取的具体步骤为：

（1）动物组织裂解：

取2-25mg的动物组织置于2mL离心管中，用剪刀剪成碎块；

加入180μL的Buffer GL、20μL的蛋白酶K和10μL的浓度为10mg/mL的RNase A，于56℃水浴

中温浴2-3小时，至动物组织完全裂解，后12,000rpm离心2分钟，去除杂质；

（2）向裂解液中加入200μL Buffer GB 和200μL 无水乙醇，充分混匀；

心2分钟，弃滤液；

（5）在Buffer WB中加入56mL无水乙醇，混匀后，将700μL的Buffer WB加入至离心柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将离心柱安置于原来的收集管上，12,000 rpm离心2分钟；

（9）12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。

5.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：所述操作步骤（5）中沿离心柱的管壁四周加入Buffer WB。

6.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：所述步骤（8）中灭菌水或洗脱缓冲液加热至65℃。

7.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：对制得的标准样品进行定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA：

取制备的核酸标准样品，加入50μL的Tris-EDTA，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物COI-1和COI-2进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

上游引物COI-1: 5’- GGTCA ACAAATCATA AAGATATTGG -3’

下游引物COI-2: 5’- TAAACTTCAG GGTGA CCAAA AAATCA -3’

反应体系：

模板 1.0 μL

上游引物COI-1 1.0 μL

下游引物COI-2 1.0 μL

Taq酶 0.5 U

dNTP 2.0 μL

10×Buffer 2.5 μL

Total 25.0 μL

反应条件：

94℃ 3min

95℃ 30s

50℃ 45s

72℃ 1min 循环35次

72℃ 7min。

8.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：对制得的标准样品进行DNA完整性、浓度及纯度检测：

DNA浓度(ng/μl)=OD260×50。

9.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：对制得的标准样品进行均匀性、稳定性分析：

10.根据权利要求3或4所述的褐斑大蠊分子标准样品的制备方法，其特征在于：对制得的标准样品进行灵敏度检验：将制得的分子标准品稀释至10ng/μl，作为母液，然后按10倍浓度梯度进行稀释并进行PCR检测，由条带不可见时对应的标准品浓度判定该标准品的灵敏度。