CN104878118A - 一种双重定量pcr检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法 - Google Patents

一种双重定量pcr检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，包括以下步骤：(1)引物合成；(2)提取基因组DNA；(3)SYBR Green I荧光定量PCR；(4)绘制SYBR Green I定量PCR溶解曲线；(5)结果判定。本发明方法优点在于可以在封闭状态对扩增产物进行检测，省去常规PCR的后期处理，避免扩增产物污染而引起的假阳性结果，它的敏感度高，还可以对反应开始的靶基因准确定量，线性关系好，做为一项常规实验室检查发出报告只需要2个小时。

Description

一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法
技术领域
本发明涉及一种兔须癣毛癣菌的检测方法，具体涉及一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法。
背景技术
家兔皮肤真菌病是由丝状真菌侵入皮肤角质层及其附属物所引起的一类传染性极强的人畜共患接触性皮肤病。随着养兔业集约化的发展，家兔皮肤真菌病发生也越来越普遍。家兔皮肤真菌病不仅侵害家兔皮毛，严重影响其健康、皮毛质量和经济效益。更重要的是该病能传染给人，对公共卫生事业带来较大的负面影响，因此，该病日益受到国内外医学界和兽医学界的重视。
皮肤真菌主要涉及毛癣菌属(如须癣毛癣菌等)、小孢子菌属(如犬小孢子菌等)和表皮癣菌属(如絮状表皮癣等)，在临床上这些皮肤真菌均可引起脱毛、皮肤红肿及瘙痒等症状，且常常是多种皮肤真菌继发和并发感染。然而，不同皮肤真菌所采取防疫和治疗措施是不同的，因此，对皮肤真菌种类确定至关重要。
临床上常用诊断皮肤真菌方法是直接显微检查，即将皮屑等病料置载玻片上，直接在显微镜观察。该方法快速、简单，但特异性性差，只能检测真菌感染，不能确定真菌的种类。为提高诊断方法的特异性，人们建立病料分离培养方法，这种方法能把分离培养的真菌鉴定到种，由于皮肤真菌生长缓慢，从分离培养到纯化鉴定一般需要3-4周，耗时长，缺乏时效性，临床很少采用，其阳性检出率偏低，仅是直接镜检的40％。
为建立特异、敏感的皮肤真菌检出方法，近年来，研究者建立许多分子生物学方法，包括基于总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹、巢式PCR、反向PCR、复合PCR和PCR-ELISA方法等]。这些方法共同特点是特异、敏感，由于常规PCR需要进行电泳分析，需确定有无扩增以及扩增产物大致长度，因而耗时长，准确性较低，容易出现非特异性扩增，且只能定性判断，不能够定量。家兔皮肤真菌病是由丝状真菌侵入皮肤角质层及其附属物所引起的一类传染性极强的人畜共患接触性皮肤病。随着养兔业集约化的发展，家兔皮肤真菌病发生也越来越普遍。家兔皮肤真菌病不仅侵害家兔皮毛，严重影响其健康、皮毛质量和经济效益。更重要的是该病能传染给人，对公共卫生事业带来较大的负面影响，因此，该病日益受到国内外医学界和兽医学界的重视。
皮肤真菌主要涉及毛癣菌属(如须癣毛癣菌等)、小孢子菌属(如犬小孢子菌等)和表皮癣菌属(如絮状表皮癣等)，在临床上这些皮肤真菌均可引起脱毛、皮肤红肿及瘙痒等症状，且常常是多种皮肤真菌继发和并发感染。然而，不同皮肤真菌所采取防疫和治疗措施是不同的，因此，对皮肤真菌种类确定至关重要。
临床上常用诊断皮肤真菌方法是直接显微检查，即将皮屑等病料置载玻片上，直接在显微镜观察。该方法快速、简单，但特异性性差，只能检测真菌感染，不能确定真菌的种类。为提高诊断方法的特异性，人们建立病料分离培养方法，这种方法能把分离培养的真菌鉴定到种，由于皮肤真菌生长缓慢，从分离培养到纯化鉴定一般需要3-4周，耗时长，缺乏时效性，临床很少采用，其阳性检出率偏低，仅是直接镜检的40％。
为建立特异、敏感的皮肤真菌检出方法，近年来，研究者建立许多分子生物学方法，包括基于总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹、巢式PCR、反向PCR、复合PCR和PCR-ELISA方法等]。这些方法共同特点是特异、敏感，由于常规PCR需要进行电泳分析，需确定有无扩增以及扩增产物大致长度，因而耗时长，准确性较低，容易出现非特异性扩增，且只能定性判断，不能够定量。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测时间短、结果直观、敏感度高、定量准确的双重SYBR Green I荧光定量PCR方法，该方法可同时检测兔皮肤真菌和须癣毛癣菌。本发明为实现其目的采用的技术方案是：
一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，包括以下步骤：
(1)引物合成：
a、皮肤真菌特异引物：
上游引物Dm1：5'-CTGCGGAAGGATCATTAACCCTGGA-3'，
下游引物Dm25'-AAGAGATCCGTCCTGGATGTTGAAAG-3'；
b、须癣毛癣菌特异引物：
上游引物F：5'-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
下游引物R：5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3；
(2)提取基因组DNA：
将须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉接种在土豆葡萄糖液体培养基，27℃摇床培养72h，待出现球形菌丝体后，用八层纱布过滤菌丝，并用PBS清洗2遍，挤干菌丝水分，把收集的菌丝放入研钵中，用液氮研磨，直至菌丝体呈粉末状，收集菌丝体约0.05-0.1g于1.5mLEP管中，按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取基因组DNA；
(3)SYBR Green I荧光定量PCR：
以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉株基因组DNA为模板，Dm1和Dm2为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉株基因组DNA为模板，F和R为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；
(4)绘制SYBR Green I定量PCR溶解曲线：根据SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，绘制溶解曲线；
(5)结果判定：若模板中含有皮肤真菌，在温度86℃—86.5℃会收集荧光信号；若模板中有须癣毛癣菌，在温度88.5℃—89℃会收集荧光信号。
在步骤(3)中SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2×的SYBRPremix Ex Taq12.5μL，皮肤真菌特异引物Dm1、Dm2各0.5μL，须癣毛癣菌特异引物F、S各0.5μL，DNA模板1.0μL，用双蒸水补足至25μL。
在步骤(3)中SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环。
所述的皮肤真菌特异引物、须癣毛癣菌特异引物的浓度配比为1：1。
本发明的有益效果是：研究者建立了兔须癣毛癣菌定量PCR的方法，此方法优点在于可以在封闭状态对扩增产物进行检测，省去常规PCR的后期处理，避免扩增产物污染而引起的假阳性结果，它的敏感度高，还可以对反应开始的靶基因准确定量，线性关系好，做为一项常规实验室检查发出报告只需要2个小时左右。一般建立的定量PCR方法，一次只能检测一种病原，而本发明双重定量PCR方法，不仅快速、特异、敏感，而且还能同时检测皮肤真菌和须癣毛癣菌多种病原，极大提高了诊断效率，节约了成本。利用本发明建立的方法可为规模化兔场开展分子流行病学调查提供检测手段，同时，也为研究其分子发病机理、药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。
本发明建立的用双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测方法，一次反应可以同时检测兔的皮肤真菌和须癣毛癣菌，且可对初始模板进行准确定量，该方法敏感性高，是常规的PCR 100倍，特异性强，与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应；操作简单，耗时短，只需2-3h即可完成整个试验过程，可用于临床兔皮肤真菌病和须癣毛癣菌感染的快速诊断。
Sybre GreenⅠ是一种结合于DNA小沟的荧光染料，与双链DNA有很高的亲和力。当它和双链DNA结合后，能产生增强的荧光信号。Sybre GreenⅠ在485nm波长处被激发，发射荧光波长520nm。荧光信号随着PCR进程与不断生成的PCR产物成正比，并形成荧光扩增曲线。荧光强度的增加有赖于反应液中原始模板的浓度，因此还可进行靶核酸的定量检测。由于SybreGreenⅠ与双链DNA的这种结合是非特异性的，因此要求引物的特异性必须非常好。发明人根据多年的研究及经验分析皮肤真菌和非皮肤真菌的相关序列，然后分析得到皮肤真菌引物和须癣毛癣菌引物，由于皮肤真菌和非皮肤真菌的种类分散、基数大，各个皮肤真菌和非皮肤真菌特点、性质、基因不同，而且有相当一部分还非常接近，不易区分，不能通过常规的手段简单得到引物，发明人经过长期的PCR筛选，最终确定了皮肤真菌特异引物一对和须癣毛癣菌特异引物一对，然而在此之间，发明人克服了难以想象的困惑与艰难，其中在PCR试验过程中会产生非特异产物、引物二聚体等都会形成类似的扩增曲线，这对需要得到特异性强的引物非常有干扰，难以区分，甚至得不到特异性引物或者得到错误的引物，这会严重影响到后期兔皮肤真菌和须癣毛癣菌感染的快速诊断，严重的造成用药错误，甚至危及患者生命健康。
附图说明
图1为SYBR Green I定量PCR溶解曲线。
具体实施方式
1、引物合成：
a、皮肤真菌特异引物：
上游引物Dm1：5'-CTGCGGAAGGATCATTAACCCTGGA-3'，
下游引物Dm25'-AAGAGATCCGTCCTGGATGTTGAAAG-3'；
b、须癣毛癣菌特异引物：
上游引物F：5'-GCAAA GAAG CCTGG AAGAAG-3'，
下游引物R：5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3；
2、提取基因组DNA：
将须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉接种在土豆葡萄糖液体培养基，27℃摇床培养72h，待出现球形菌丝体后，用八层纱布过滤菌丝，并用PBS清洗2遍，挤干菌丝水分，把收集的菌丝放入研钵中，加入适量液氮，待液氮即将挥发殆尽时迅速研磨菌丝，再次加入液氮研磨直至菌丝体呈粉末状，收集菌丝体约0.05-0.1g于1.5mLEP管中，按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取基因组DNA；
3、SYBR Green I荧光定量PCR：
以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉基因组DNA为模板，Dm1和Dm2为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉基因组DNA为模板，F和R为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2×的SYBR Premix ExTaq12.5μL，皮肤真菌特异引物Dm1、Dm2各0.5μL，须癣毛癣菌特异引物F、S各0.5μL，DNA模板1.0μL，用双蒸水补足至25μL；反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环。
4、绘制SYBR Green I定量PCR溶解曲线：根据SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，绘制溶解曲线；
5、结果判定：模板中含有皮肤真菌，熔解解温度在86℃—86.5℃，收集荧光信号，模板中有须癣毛癣菌，熔解解温度在88.5℃—89℃，收集荧光信号。
6、SYBR Green I荧光定量PCR的敏感性试验、特异性试验和重复性试验
(1)敏感性试验
将须癣毛癣菌制备的阳性模板DNA从1.0×109拷贝/μL开始进行10倍等系列稀释至10拷贝/μL，各浓度梯度稀释液分别取1μL作模板，测定SYBRGreen I实时荧光定量PCR的敏感性，并与普通PCR进行对比。结果是常规PCR最低检测稀释倍数为10-8，而定量PCR最低检测稀释倍数为10-10。即SYBRGreen I实时荧光定量PCR的敏感性是常规PCR的100倍。
(2)特异性试验
把犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉接种在土豆葡萄糖液体培养基，27℃摇床培养72h，待出现球形菌丝体后，用八层纱布过滤菌丝，并用PBS清洗2遍，挤干菌丝水分，按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取基因组DNA，作为对照，与须癣毛癣菌同时进行定量PCR，检查其特异性。皮肤真菌犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌和须癣毛癣菌，在熔解解温度86℃-86.5℃，收集荧光信号；只有须癣毛癣菌，在熔解解温度在88.5℃-89℃，收集荧光信号；非皮肤真菌白色念珠菌、烟曲霉无论在熔解解温度在86℃-86.5℃，还是在熔解解温度在88.5℃-89℃，均没有收到荧光信号，提示本方法非常特异性。
(3)重复性试验
将病料基因组DNA进行10倍系列稀释，选3个浓度梯度，每个浓度进行3个平行试验，用SYBRGreenⅠ定量PCR检测，根据Ct值差异计算组内变异系数(CV％)为0.38-2.08％，表示该定量PCR方法稳定，重复性较好。
7、临床实例
从发病的兔场，采集临床病料样品，直接放入研钵中，加入适量液氮，待液氮即将挥发殆尽时迅速研磨菌丝，再次加入液氮研磨直至粉末状，收集病料约0.05-0.1g于1.5mLEP管中，用真菌DNA提取试剂盒(Solarbio试剂盒)提取基因组DN分别提取其基因组DNA，利用建立的SYBR Green I定量PCR方法，进行检测。若熔解温度在86℃-86.5℃，收集荧光信号，可诊断为皮肤真菌病，在熔解温度在88.5℃-89℃，收集荧光信号，可诊断须癣毛癣菌感染。

Claims (4)

1.一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)引物合成：
a、皮肤真菌特异引物：
上游引物Dm1：5'-CTGCGGAAGGATCATTAACCCTGGA-3'，
下游引物Dm25'-AAGAGATCCGTCCTGGATGTTGAAAG-3'；
b、须癣毛癣菌特异引物：
上游引物F：5'-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3'，
下游引物R：5'-GGAGACCATCTGTGAGAGTTG-3；
(2)提取基因组DNA：
将须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉接种在土豆葡萄糖液体培养基，27℃摇床培养72h，待出现球形菌丝体后，用八层纱布过滤菌丝，并用PBS清洗2遍，挤干菌丝水分，把收集的菌丝放入研钵中，用液氮研磨，直至菌丝体呈粉末状，收集菌丝体约0.05-0.1g于1.5mL EP管中，按Solarbio试剂盒说明书的步骤提取基因组DNA；
(3)SYBR Green I荧光定量PCR：
以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉株基因组DNA为模板，Dm1和Dm2为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；以须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉株基因组DNA为模板，F和R为引物进行SYBR Green I荧光定量PCR反应；
(4)绘制SYBR Green I定量PCR溶解曲线：根据SYBR Green I荧光定量PCR反应结果，绘制溶解曲线；
(5)结果判定：若模板中含有皮肤真菌，在温度86℃—86.5℃会收集荧光信号；若模板中有须癣毛癣菌，在温度88.5℃—89℃会收集荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(3)中SYBR Green I荧光定量PCR反应体系为：2×的SYBR Premix Ex Taq12.5μL，皮肤真菌特异引物Dm1、Dm2各0.5μL，须癣毛癣菌特异引物F、S各0.5μL，DNA模板1.0μL，用双蒸水补足至25μL。
3.根据权利要求1所述的一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，其特征在于，在步骤(3)中SYBR Green I荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性60s；94℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行40个循环。
4.根据权利要求1所述的一种双重定量PCR检测兔皮肤真菌及须癣毛癣菌的方法，其特征在于，所述的皮肤真菌特异引物、须癣毛癣菌特异引物的浓度配比为1：1。
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