CN104017907A - 一种hpv高危型荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)高危型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；所述PCR反应液中包含高危HPV16型和18型的引物探针序列以及内标的引物探针序列。本发明的目的在于提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的高危型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒。应用该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒的DNA核酸片段进行快速共同荧光PCR检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断及宫颈癌的早期筛查。
Description
技术领域
本发明提供一种人乳头瘤病毒(HPV)高危型荧光PCR检测试剂盒。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一类分子量较小的无包膜的双链环状DNA病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据HPV不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为高危型和低危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。
HPV在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽，发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿瘤为宫颈癌。全世界每年约有50万妇女宫颈癌新发病例，其中亚洲约占38万；每年约有27万女性死于子宫颈癌。在不同地区、不同经济状况的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着显著的差别，其中80％的病例发生在发展中国家。我国每年约有15万宫颈癌新发病例，每年约有3万人死于子宫颈癌，其死亡率居妇科肿瘤的第二位。近年来，宫颈癌病人数目在逐渐上升，并呈年轻化的趋势。
对宫颈癌的病因学研究可知，高危HPV持续感染是子宫颈癌的主要致病因素，99.7％宫颈癌患者存在HPV感染。临床研究显示，从HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年。因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手段。在检出的所有型别中主要有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68型。早期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，因此，快速、准确的检测出HPV高危型的感染对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率等具有重要的意义。
目前，国内外对于宫颈癌的早期筛查方法主要有细胞学检测和分子生物学检测。细胞学的检测方法，有宫颈巴氏(Pap)涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查(TCT)等多种。宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30％。TCT法大大改进了细胞学检查的准确性，逐渐取代传统的巴氏法。可观察宫颈上皮血管微小变化的阴道镜检查虽敏感、准确，但会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。由于宫颈HPV感染多为隐性亚临床感染，且HPV不能在培养环境中稳定生长，大部分HPV感染无临床症状或为亚临床感染但可致严重后果，因此，该感染不能作为一个普通的临床疾病或通过常规筛查计划或性传播疾病调查得以发现，只能通过HPV DNA检测得知。
因此，分子生物学技术渐渐显现了其在检测上的优势，目前认为PCR技术是检测HPVDNA及分型的最好方法。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，能动态反应患者治疗前、后病原体动态变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。大量研究表明用PCR技术检测HPV DNA的阳性率远高于其他检测技术，是当今用于HPV感染诊断最常用的有力工具，且能更好的应用于HPV致病、致癌机理的研究之中。
结合国内情况，在临床高危型人乳头瘤病毒感染的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前已有少量荧光PCR诊断试剂盒在临床高危HPV感染诊断中常规使用，但是缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确快速诊断的需要。
运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。
目前国内临床上主要采用煮沸法对人乳头瘤病毒的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。
临床上检测高危HPV-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。
国内已有一些基于实时荧光定量PCR技术定量检测高危HPV-DNA的试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的高危型HPV-DNA提取方法主要是煮沸法，其核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。且这些试剂盒的检测灵敏度不高，约在10000copies/ml左右；还因没有设置阳性内对照(即内标)，无法监控假阴性，和一般没有预防PCR产物污染的措施。且现有荧光PCR一管法HPV检测试剂，所能检测的型别一般是8-13种，型别少。另外，受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测高危型HPV-DNA特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于解决现有高危型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的高危型人乳头瘤病毒荧光定量PCR检测试剂盒。应用该试剂盒，可以对疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等未知样本中的高危型人乳头瘤病毒的DNA核酸片段进行快速共同荧光PCR检测，检测结果可用于高危型人乳头瘤病毒感染的辅助诊断及宫颈癌的早期筛查。
因此，本发明提供一种HPV高危型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型和内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：AGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT，
16型下游引物：CATCCGTGCTTACAACCTTAGAT，
16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
18型上游引物：ATGCCGCCACGTCTAATGT，
18型下游引物：TGATAAAGGACGCGATTTACAAG，
18型探针：CCTTTAGCCCAGTGTTCCCCAATAGC；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG，
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG，
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC。
使用本发明所述试剂盒时，若待测样本中含有高危HPV中的16型和/或18型，则可方便快速地将其检测出来。
优选地，所述PCR反应液中还包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV中一种或多种型的引物探针序列；
其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
31型上游引物：CAAAGACCGTTGTGTCCAGAAG，
31型下游引物：CGCATGTTTACACTTGGGTTTC，
31型探针：CAACGTCCTGTCCACCTTCCTCCTATG；
33型上游引物：AATATACAGGAAGGGGAGGATGAT，
33型下游引物：GTTTGCAGCACGATCAACAAC，
33型探针：TCCTCCGCAGCACTTTGTGAACATG；
35型上游引物：GGACGAAAATGAAGATGACTGTG，
35型下游引物：TGTGTGTTTGCTCCTCCTGTG，
35型探针：AATGCTTGTGCTGTCTCTGTTTCTGCCT；
39型上游引物：TGCCCGATCCTAATAAATTCAGT，
39型下游引物：ATGGGTGTCCACTAATACCAACAC，
39型探针：CTGCCCACCTCCACCCCTACACA；
45型上游引物：GGATACAAAGACTAACTATTATACAACATGG，
45型下游引物：AAATGCCATATCACTTTCATCTGT，
45型探针：CATTATCAAATGCCCATTGTACCATTTCTGA；
51型上游引物：ATGGCATTTGCTGGAACAATCA，
51型下游引物：GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG，
51型探针：GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG；
52型上游引物：GGAGGACCCTGAAGGTACAGAG，
52型下游引物：TTTGTTTTTCTATTATTGCCTCTACTTC，
52型探针：CCAGCCTGTACATCCCTCCCTTTCG；
53型上游引物：GTGCTCGTGTGCATTATTATTATGAT，
53型下游引物：GCATAAATATCATATAGGCCATCAAAT，
53型探针：AGACAATAATGGCTGCATTTCAATTTC；
56型上游引物：CCAGAGAGTCCCACGCAAAG，
56型下游引物：GCAGGGTGGTTGTTGTTGTTG，
56型探针：CACACATCAGCGACACAGACAATACCGA；
58型上游引物：GAGGATGGTGACATGGTAGATACAG，
58型下游引物：ACTGTTACAAATATCAATAGGCACATC，
58型探针：TAGCCTGCAATGTACCAAAGTCCATGC；
59型上游引物：CTTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
59型下游引物：CTGTATCTGTTGCATTTTCATCCTC，
59型探针：CGTCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC；
66型上游引物：ACCAGAATGGATACAAAGACAAACAC，
66型下游引物：CTATTTGGCTATCATCTGTTACTTCATT，
66型探针：TCAAATGCCCACTGCACCATTTTAGA；
68型上游引物：TGCAGGACATTGGACACTACATT，
68型下游引物：TTTAAGTCACCAAAGGCAAATTC，
68型探针：TACCTCTGTCCGTTGTAGTTGCCTTCTG。
在本发明的一个具体实施方式中，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这15种高危HPV型的引物探针序列和内标的引物探针序列。使用该试剂盒时，若待测样本中存在检测量以上的这15种HPV高危型中的任意一种或多种，则试剂盒的检测结果呈阳性。
优选地，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
本发明还提供一种HPV高危型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型和内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：AGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT，
16型下游引物：CATCCGTGCTTACAACCTTAGAT，
16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
18型上游引物：ATGCCGCCACGTCTAATGT，
18型下游引物：TGATAAAGGACGCGATTTACAAG，
18型探针：CCTTTAGCCCAGTGTTCCCCAATAGC；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG，
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG，
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC。
优选的，所述PCR反应液中还包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV中一种或多种型的引物探针序列；其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为如上所示序列。
更加优选地，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这15种高危HPV型的引物探针序列和内标的引物探针序列。
本发明还提供一种核酸释放剂在HPV高危型荧光PCR检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种能检测15种高危型人乳头状瘤病毒的检测试剂盒，它至少由以下组分组成：
①核酸释放剂：莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L(质量/体积)，氯化钾(KCl)50～200mmol/L(质量/体积)，十二烷基磺酸钠(SDS)0.01％～2％(质量/体积)，乙醇0.05％～1％(体积/体积)；
②PCR反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.05mmol/L～0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1μmol/L～0.3μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物HPV16-F与HPV16-R、HPV18-F与HPV18-R、HPV31-F与HPV31-R、HPV33-F与HPV33-R、HPV35-F与HPV35-R、HPV39-F与HPV39-R、HPV45-F与HPV45-R、HPV51-F与HPV51-R、HPV52-F与HPV52-R、HPV53-F与HPV53-R、HPV56-F与HPV56-R、HPV58-F与HPV58-R、HPV59-F与HPV59-R、HPV66-F与HPV66-R、HPV68-F与HPV68-R；0.1μmol/L～0.3μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针HPV16-P、HPV18-P、HPV31-P、HPV33-P、HPV35-P、HPV39-P、HPV45-P、HPV51-P、HPV52-P、HPV53-P、HPV56-P、HPV58-P、HPV59-P、HPV66-P、HPV68-P；0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物IC-F与IC-R；0.05μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P。所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP；所述用于靶多核苷酸扩增的上下游引物及用于靶多核苷酸检测的探针的碱基对序列见表1，所述用于内标的引物和探针序列同样见表1。
表1
③酶混合液：耐热DNA聚合酶(Taq酶)1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)0.05U/μl～0.2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用；
④HPV高危型定量参考品：来源于使用HPV高危型企业定量线性参考品L1～L5定值后的HPV高危型强阳性质粒，该HPV高危型定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00～5.00E+07copies/ml(A)、1.00～5.00E+06copies/ml(B)、1.00～5.00E+05copies/ml(C)、1.00～5.00E+04copies/ml(D)；
⑤HPV高危型阳性对照：为临床医院收集的HPV高危型强阳性样本，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml。
⑥HPV高危型阴性对照：为灭菌生理盐水。
实施例2
将实施例1中的检测试剂盒用于检测疣体表面脱落细胞、妇女宫颈上皮细胞、生殖道分泌物等待测样本中的高危HPV-DNA的操作步骤是：
一、在试剂准备区进行试剂准备
根据待测样本、阴性对照、阳性对照以及定量参考品A～D数量，按比例取相应量的PCR反应液(38～44μl/人份)、酶混合液(1～2μl/人份)充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
二、在样本处理区进行样本处理
1)每个PCR反应管中加入核酸释放剂2～5μl(建议深吸浅打，避免出现气泡)，并在不同的PCR反应管中加入待测样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品各3～5μl；
2)间隔10分钟以上，每管加入PCR-mix40～45μl，盖上管盖。
三、在扩增与分析区进行PCR扩增
1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度。
2)荧光检测通道选择：选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测HPV16和18等15种型别；选择HEX或VIC通道(Reporter:VIC,Quencher:None)检测内标；参比荧光(Passive Reference)设置为none。
3)荧光定量PCR反应条件为：
表2
4)结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)；仪器软件根据各样本Ct值大小，通过4个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为HPV高危型(共15种类型)-DNA阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示(Undet)显示，可以判为HPV高危型(共15种类型)-DNA阴性。
本发明中的试剂盒可用于对HPV共15种高危型的普遍筛查，若待测样本中存在检测量以上的这15种HPV高危型中的任意一种或多种，则试剂盒的结果呈阳性。本发明提供的试剂盒的检测结果可用于HPV高危型(共15种类型)感染的诊断和宫颈癌的早期筛查。对使用该试剂盒检测得到的结果呈阳性的待测样本，还可进一步使用高危HPV分型检测试剂盒进行分型检测，从而用于宫颈癌的早期筛查和病变的随访治疗。
本发明仅能检测出相应这15种型别HPV DNA，不能检测出其他型别HPV DNA及非HPV病原体DNA，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。同时，本发明对高危型HPV-DNA的提取方法进行了比较和优化，选择了核酸释放的方法，采用强烈的蛋白变性剂，快速破坏病原体外壳蛋白结构，释放出病原体核酸，无需加热即可完成DNA的释放和提取，检测灵敏度可达400copies/ml，定量线性范围为400copies/ml～4.00E+09copies/ml。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。
本发明的试剂盒检测中国食品药品检定研究院的人乳头瘤病毒全基因组分型参考品、企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100％，定量线性参考品、灵敏度参考品的检测结果符合质量标准。且精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10％，浓度变异系数<50％。特异性试验表明：与常见性病病原体(CT、NG、HSV、UU等)以及与低危型HPV(6、11、40、42、43、44型等)无交叉反应。
DNA不同提取方法对HPV高危型(共15种类型)-DNA检测的影响试验表明：通过同时检测梯度稀释样本发现，本发明的核酸快速释放法与煮沸法提取核酸的检测结果没有明显差异，而本发明方法操作更为简便快速，无需加热。同时，煮沸法试剂没有内标监测，如提取的DNA中有PCR抑制物存在时，会导致HPV高危型阳性样本检测为阴性，即出现假阴性，本发明的快速检测试剂盒中加入内标的引物和探针序列，可以有效监控假阴性的存在。另外，PCR产物污染的预防试验表明：PCR反应体系中加入适量的UNG酶可以预防PCR产物污染。
Claims (8)
1.一种HPV高危型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括核酸释放剂和PCR反应液，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％；所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型和内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：AGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT，
16型下游引物：CATCCGTGCTTACAACCTTAGAT，
16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
18型上游引物：ATGCCGCCACGTCTAATGT，
18型下游引物：TGATAAAGGACGCGATTTACAAG，
18型探针：CCTTTAGCCCAGTGTTCCCCAATAGC；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG，
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG，
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV中一种或多种型的引物探针序列；
其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为，
31型上游引物：CAAAGACCGTTGTGTCCAGAAG，
31型下游引物：CGCATGTTTACACTTGGGTTTC，
31型探针：CAACGTCCTGTCCACCTTCCTCCTATG；
33型上游引物：AATATACAGGAAGGGGAGGATGAT，
33型下游引物：GTTTGCAGCACGATCAACAAC，
33型探针：TCCTCCGCAGCACTTTGTGAACATG；
35型上游引物：GGACGAAAATGAAGATGACTGTG，
35型下游引物：TGTGTGTTTGCTCCTCCTGTG，
35型探针：AATGCTTGTGCTGTCTCTGTTTCTGCCT；
39型上游引物：TGCCCGATCCTAATAAATTCAGT，
39型下游引物：ATGGGTGTCCACTAATACCAACAC，
39型探针：CTGCCCACCTCCACCCCTACACA；
45型上游引物：GGATACAAAGACTAACTATTATACAACATGG，
45型下游引物：AAATGCCATATCACTTTCATCTGT，
45型探针：CATTATCAAATGCCCATTGTACCATTTCTGA；
51型上游引物：ATGGCATTTGCTGGAACAATCA，
51型下游引物：GCTTAAAGTTACTTGGAGTAAATGTTGG，
51型探针：GGAAACCGCAGCAGTGGCAGTG；
52型上游引物：GGAGGACCCTGAAGGTACAGAG，
52型下游引物：TTTGTTTTTCTATTATTGCCTCTACTTC，
52型探针：CCAGCCTGTACATCCCTCCCTTTCG；
53型上游引物：GTGCTCGTGTGCATTATTATTATGAT，
53型下游引物：GCATAAATATCATATAGGCCATCAAAT，
53型探针：AGACAATAATGGCTGCATTTCAATTTC；
56型上游引物：CCAGAGAGTCCCACGCAAAG，
56型下游引物：GCAGGGTGGTTGTTGTTGTTG，
56型探针：CACACATCAGCGACACAGACAATACCGA；
58型上游引物：GAGGATGGTGACATGGTAGATACAG，
58型下游引物：ACTGTTACAAATATCAATAGGCACATC，
58型探针：TAGCCTGCAATGTACCAAAGTCCATGC；
59型上游引物：CTTTGTGTGTCCGTGGTGTGC，
59型下游引物：CTGTATCTGTTGCATTTTCATCCTC，
59型探针：CGTCCCCTCCCCGTCTGTACCTTC；
66型上游引物：ACCAGAATGGATACAAAGACAAACAC，
66型下游引物：CTATTTGGCTATCATCTGTTACTTCATT，
66型探针：TCAAATGCCCACTGCACCATTTTAGA；
68型上游引物：TGCAGGACATTGGACACTACATT，
68型下游引物：TTTAAGTCACCAAAGGCAAATTC，
68型探针：TACCTCTGTCCGTTGTAGTTGCCTTCTG。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这15种高危HPV型的引物探针序列和内标的引物探针序列。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸释放剂、PCR反应液、酶混合液、HPV高危型定量参考品、HPV高危型阳性对照和HPV高危型阴性对照。
5.一种HPV高危型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型和内标的引物探针序列；
其中，用于16型、18型和内标扩增和检测的引物探针序列分别为，
16型上游引物：AGATGTCTCTTTGGCTGCCTAGT，
16型下游引物：CATCCGTGCTTACAACCTTAGAT，
16型探针：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA；
18型上游引物：ATGCCGCCACGTCTAATGT，
18型下游引物：TGATAAAGGACGCGATTTACAAG，
18型探针：CCTTTAGCCCAGTGTTCCCCAATAGC；
内标上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG，
内标下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG，
内标探针：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包含高危HPV31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这13种高危HPV中一种或多种型的引物探针序列；其中，用于这13种高危HPV型扩增和检测的引物探针序列分别为如权利要求2中所示序列。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中包含高危HPV16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、66型和68型这15种高危HPV型的引物探针序列和内标的引物探针序列。
8.一种核酸释放剂在HPV高危型荧光PCR检测中的应用，所述核酸释放剂包含莎梵婷(surfactin)0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。
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Denomination of invention: Kit for fluorescent PCR (Polymerase Chain Reaction) detection of high-risk HPV (Human Papilloma Virus) Effective date of registration: 20170711 Granted publication date: 20151014 Pledgee: Ningbo free trade zone Terry with equity investment partnership (limited partnership)|Suzhou equity equity investment center (limited partnership)|Ningbo Meishan Bonded Port District, Jun and equity investment partnership (limited partnership)|Chen Bang Pledgor: Hunan Gene Technology Co.|Hunan San Xiang Biological Technology Co. Ltd. Registration number: 2017430000042 |
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| CP03 | Change of name, title or address |
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Date of cancellation: 20200217 Granted publication date: 20151014 Pledgee: Suzhou Lirui equity investment center (limited partnership)|Triton equity investment partnership (limited partnership)|JUNHE Tongrui equity investment partnership (limited partnership)|Chenbang Pledgor: SANSURE BIOTECH Inc. Registration number: 2017430000042 |