CN101676409A - Ⅰ、ⅱ型单纯疱疹病毒荧光定量pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对I、II型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。本发明针对DNA酶高度保守区设计引物进行PCR，同时在扩增序列中间设计了荧光探针，通过对反应的退火温度和引物、探针、镁离子等浓度进行优化，建立了单纯疱疹病毒I、II型实时荧光PCR的检测方法。本发明的试剂盒在保证灵敏度、准确度的情况下，操作简单、快速，降低了临床检测的劳动强度，同时降低了临床PCR诊断的成本，延续了荧光定量PCR检测方法的快速简便性能。此方法可用于I、II型单纯疱疹病毒定量检测，具有实际的临床应用价值。

Description

Ⅰ、Ⅱ型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测不同基因分型单纯疱疹病毒I、II(herpessimplex virus，HSV I、II)型血清DNA的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

单纯疱疹病毒在我国亦为常见性传播病之一，本病发病率高，可通过胎盘及产道感染新生儿，导致流产及新生儿死亡，与宫颈癌的发生也有关，危害较大，又无特效疗法，已受到人们的重视。在国外，生殖器疱疹的发病率在性病中仅次于淋病和梅毒，居性病发病率的第三位，在由病毒所引起的性传播疾病中占第一位。单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科(herpesviridae)。疱疹病毒科是一群中等大小的双链DNA病毒，有100个以上成员，根据理化性质分为α、β、γ三个疱疹病毒亚科。疱疹病毒感染的宿主范围极为广泛，可感染人类和其他脊椎动物，包括哺乳类、鱼类、两栖类、鸟类、有袋类等。疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织.疱疹病毒感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏的趋向，严重威胁人类健康。

单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99％是由I型疱疹病毒感染引起的。II型疱疹病毒主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处，是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。据有关统计资料显示，生殖器疱疹的病原体90％为II型疱疹病毒，仅10％为I型疱疹病毒。

用荧光探针定量PCR技术检测HSV-DNA的意义

(一)虽然分离培养法是检测HSV的金标法，但其有费时、繁琐的缺点。临床上常用的ELISA和间接免疫荧光法(IFA)来检测HSV特异性抗体，但在在疾病早期(即病毒“窗口期”)血液中不易检测到病毒抗体，此时，宜首选荧光探针定量PCR法进行检测。研究证实，在生殖器溃疡愈合过程中，荧光探针定量PCR检测无症状排毒更为敏感。因此，对于疱疹已结痂者，或无痂状排毒的患者，用荧光探针定量PCR法检测单纯疱疹病毒可作为首选方法。

(二)对处于育龄期的女性患者来说，HSV的感染应引起高度重视，以免因HSV感染而导致胎儿畸形的可能性发生。由于HSV感染与宫颈癌关系密切，曾经感染或已经感染有生殖器疱疹的妇女，应特别警惕生殖器疱疹感染引发的宫颈癌变。因此，荧光探针定量PCR检测对早期筛查HSV感染、预防宫颈癌的发生有十分重要的意义。

(三)对临床上由HSV-I型或HSV-II型感染所致的疱疹性角膜炎、咽炎、脑膜炎、生殖器各类疱疹、宫颈癌、先天性及新生儿感染、胎儿畸形等各种疾病，特异、敏感、快速、方便的PCR技术对其原发感染或潜伏感染，可先于免疫学抗体出现前做出HSV感染的早期诊断。

(四)通用型可以检测HSV-I或HSV-II的感染。

(五)可以用于考核疗效与预后，并可进行HSV分子病毒学及流行病学研究。HSV感染经治愈后，其荧光探针PCR法检测HSV-DNA呈阴性，而这时抗体检测仍可为阳性结果。

在过去十年中，由于分子生物技术的引入，使单纯疱疹病毒的研究在分子水平上取得了突破性的进展，单纯疱疹病毒I、II型(HSV-I、II)基因组的全序列已经基本弄清，利用核酸PCR技术检测HSV已成为临床检验的发展方向。

本发明即利用荧光定量PCR技术对单纯疱疹病毒进行检测，具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高等特点，可进行快速定性定量检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种精确简便的用于定量单纯疱疹病毒I、II型的方法；本发明的另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。

基于上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的目的通过下述技术方案实现：分析所有已报道的单纯疱疹病毒I、II型的基因组序列，选择了一组高度保守的基因序列，并分别设计引物和荧光探针。在常规PCR检测技术的基础上，添加一条标记了两个荧光基团的核苷酸探针，荧光报告基团(R)标记在探针的5’端，荧光淬灭基团(Q)标记在3’端，两者构成能量转移结构，即荧光报告基团所发射的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在扩增反应过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异性结合在目的扩增片断上的荧光探针酶切降解，荧光淬灭基团(Q)的抑制作用消失，报告基团荧光信号增强，从而进行单纯疱疹病毒I、II型的检测。

本发明的优点：

1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000copies/ml，说明其具有良好的灵敏度。

2)本发明提供的引物和探针对于不含有单纯疱疹病毒的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。

3)由于本发明采用单纯疱疹病毒I、II型的DNA聚合酶高度保守基因作为扩增的目的基因，避免了假阴性结果的产生。

4)由于本发明采用了荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR-电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。

本发明提供了用于单纯疱疹病毒I、II型检测的实时荧光PCR引物对及探针。其中所述的特异性地针对其DNA聚合酶高度保守基因的引物对和探针的核苷酸序列为：

引物序列为：正向引物P1：5’-ACGTCTTTTCGCACTCGA-3’，正向引物的反向互补序列为：5’-TCGAGTGCGAAAAGACGT-3’；反向引物P2：5’-TGGAGGTGCGGTTGATAA-3’，反向引物的反向互补序列为：5’-TTATCAACCGCACCTCCA-3’；以及该引物对的上游引物向5’端延伸10个碱基、下游引物向3’端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物及互补序列；

荧光探针序列为：5’-ACCAGATCCACGCCCTTGA-3’，探针的反向互补序列为5’-TCAAGGGCGTGGATCTGGT-3’，以及该探针向5’端延伸10个碱基、向3’端延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。

单纯疱疹病毒I、II型PCR通用引物和探针设计完成后，采用在先BLAST分析其序列的特异性，结果表明此通用引物和探针设计区域为单纯疱疹病毒I、II型所特有的，没有发现同源序列或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

所述的荧光探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，FAM、JOE和HEX。可用于本发明的报告荧光染料包括但不限于，例如，Eclips和TAMRA。

本发明的一个优选实施方案中，引物的扩增长度为141bp，探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，5’端标记报告荧光染料为FAM，3’端标记的淬灭荧光染料为TAMRA。

在利用本发明所述方法对待测样本进行检测时，可直接取一定量的本发明试剂，按照确立的反应体系和条件进行检测并判定结果。

具体实施方式：

1.引物和探针设计：通过分别对所有已知的单纯疱疹病毒基因组序列及进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(单纯疱疹病毒I、II型的DNA聚合酶高度保守基因，其序列见附录)，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内尽量避免有互补序列。最优引物、探针序列组合如下：

正向引物P1：5’-ACGTCTTTTCGCACTCGA-3’

反向引物P2：5’-TGGAGGTGCGGTTGATAA-3’

荧光探针序列为：5’-ACCAGATCCACGCCCTTGA-3’

2.反应体系的建立和优化：反应体系得建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：利用临床待检单纯疱疹病毒样本作为待检样品，利用碱热裂解法的方法提取单纯疱疹病毒DNA。

2.1引物浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将HSV的引物浓度分别从0.1μmol/L至1.0μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。

2.2探针浓度的优化在反应体系中其他条件相同的情况下，将HSV的探针浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L做倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳的引物终浓度为0.2μmol/L。

2.3镁离子浓度的优化在反应体系中其他条件不变的前提下，将镁离子浓度从1.0mmol/L至4mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的镁离子浓度为2.5mmol/L。

2.4Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位U计)的优化试验结果，选定2U为最佳Taq酶用量。

2.5dNTPs浓度的优化在反应体系中，将dNTPs浓度从0.1mmol/L至1mmol/L以0.1mmol/L递增，经过多次重复试验结果分析比较，确定最佳的dNTPs浓度为0.3mmol/L。

利用上述引物、探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光定量PCR反应体系为50μL，所需各组分及相应浓度见表1。

表1 优化后的PCR反应体系

组分	终浓度
		10×PCR反应缓冲液	1×
上游引物浓度	0.2μmol/L
		下游引物浓度	0.2μmol/L
探针浓度	0.2μmol/L
		镁离子浓度	2.5mmol/L
dNTPs浓度	0.3mmol/L
		Taq酶用量	2U
模板	2μL
		补水至	50μL

注：1)在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整；

2)使用的仪器不同时，应将反应参数作适当调整。

3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。

4.PCR反应条件如下：

93℃→2分钟，1个循环

93℃ 40秒→56℃ 45秒，10个循环

93℃ 30秒→55℃ 40秒，30个循环。(采集荧光信号)

5.检测步骤

5.1选取引物和探针；

5.2制备待测模板，可采用碱热裂解方法提取单纯疱疹病毒DNA；

5.3反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定最佳探针浓度；c、确定最佳镁离子浓度；d、确定最佳Taq使用量；e、确定最佳dNTPs浓度；

5.4选择仪器的检测方式

5.5上机检测。

实施例1----I、II型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

选取引物对探针，将待检的单纯疱疹病毒减毒株培养物用碱热裂解方法提取基因组DNA。具体步骤如下：

1)标本试管中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀；

2)吸取液体转至1.5ml离心管，12,000rpm离心5分钟再重复一次；

3)沉淀直接加40ul核酸提取液(DNA)充分混匀(提取液用前需室温溶解并充分混匀)；

4)沸水浴10分钟，转至4℃静置5分钟；

5)12,000rpm离心3分钟；

6)取上清液2ul做PCR反应。

在50μl荧光PCR反应体系中，加入以上提取的单纯疱疹病毒基因组DNA 2μl，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，若待测培养物中含有单纯疱疹病毒则显示阳性扩增曲线(见图1)，其检测灵敏度可达1×10³copies/ml。若待检样本中不含单纯疱疹病毒则无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度及特异性(灵敏度试验结果见图2、3，特异性试验结果见图4)。

实施例2----临床检测

用上述方法对115例临床样本进行检测，其中单纯疱疹患者42例，检出阳性率99％，准确率98.6％，并且能够对单纯疱疹病毒I、II型进行准确定量分析，远远优于酶联免疫吸附测定(ELISA)方法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对单纯疱疹病毒进行快速定量检测。此外，单纯疱疹病毒I、II型荧光定量PCR检测方法降低了临床样品PCR诊断的工作量和诊断的成本，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是单纯疱疹病毒阳性扩增曲线图

图2是灵敏度试验结果图

图3是灵敏度试验结果图

图4是特异性试验结果图

附录

单纯疱疹病毒I型DNA酶高度保守基因序列

1      ATGTTTTCCG GTGGCGGCGG CCCGCTGTCC CCCGGAGGAA AGTCGGCGGCCAGGGCGGCG

61     TCCGGGTTTT TTGCGCCCGC CGGCCCTCGC GGAGCCGGCC GGGGACCCCCGCCTTGTTTG

121    AGGCAAAACT TTTACAACCC CTACCTCGCC CCAGTCGGGA CGCAACAGAAGCCGACCGGG

181    CCAACCCAGC GCCATACGTA CTATAGCGAA TGCGATGAAT TTCGATTCATCGCCCCGCGG

241    GTGCTGGACG AGGATGCCCC CCCGGAGAAG CGCGCCGGGG TGCACGACGGTCACCTCAAG

301    CGCGCCCCCA AGGTGTACTG CGGGGGGGAC GAGCGCGACG TCCTCCGCGTCGGGTCGGGC

361    GGCTTCTGGC CGCGGCGCTC GCGCCTGTGG GGCGGCGTGG ACCACGCCCCGGCGGGGTTC

421    AACCCCACCG TCACCGTCTT TCACGTGTAT GACATCCTGG AGAACGTGGAGCACGCGTAC

481    GGCATGCGCG CGGCACAGTT CCACGCGCGG TTTATGGACG CCATCACACCGACGGGGACC

541    GTCGTCACGC TCCTGGGCCT GACTCCGGAA GGCCACCGGG TGGCCGTTCACGTTTACGGC

601    ACGCGGCAGT ACTTTTACAT GAACAAGGAG GAGGTTGACA GGCACCTACAATGCCGCGCC

661    CCACGAGATC TCTGCGAGCG CATGGCCGCG GCCCTGCGCG AGTCCCCGGGCGCGTCGTTC

721    CGCGGCATCT CCGCGGACCA CTTCGAGGCG GAGGTGGTGG AGCGCACCGACGTGTACTAC

781    TACGAGACGC GCCCCGCTCT GTTTTACCGC GTCTACGTCC GAAGCGGGCGCGTGCTGTCG

841    TACCTGTGCG ACAACTTCTG CCCGGCCATC AAGAAGTACG AGGGTGGGGTCGACGCCACC

901    ACCCGGTTCA TCCTGGACAA CCCCGGGTTC GTCACCTTCG GCTGGTACCGTCTCAAACCG

961    GGCCGGAACA ACACGCTAGC CCAGCCGCGG GCCCCTATGG CCTTCGGGACATCCAGCGAC

1021   GTCGAGTTTA ACTGTACGGC GGACAACCTG GCCATCGAGG GGGGCATGAGCGACCTACCG

1081   GCATACAAGC TCATGTGCTT CGATATCGAA TGCAAGGCGG GGGGGGAGGACGAGCTGGCC

1141   TTTCCGGTGG CCGGGCACCC GGAGGACCTG GTCATCCAGA TATCCTGTCTGCTCTACGAC

1201   CTGTCTACCA CCGCCCTGGA GCACGTCCTC CTGTTTTCGC TCGGTTCCTGCGACCTCCCC

1261   GAATCCCACC TGAACGAGCT GGCGGCCAGG GGCCTGCCCA CGCCCGTGGTTCTGGAATTC

1321    GACAGCGAAT TCGAGATGCT GTTGGCCTTC ATGACCCTTG TGAAACAGTACGGCCCCGAG

1381    TTCGTGACCG GGTACAACAT CATCAACTTC GACTGGCCCT TCTTGCTGGCCAAGCTGACG

1441    GACATTTACA AGGTCCCCCT GGACGGGTAC GGCCGCATGA ACGGCCGGGGCGTGTTTCGC

1501    GTGTGGGACA TAGGCCAGAG CCACTTCCAG AAGCGCAGCA AGATAAAGGTGAACGGCATG

1561    GTGAACATCG ACATGTACGG GATTATAACC GACAAGATCA AACTCTCGAGCTACAAGCTC

1621    AACGCCGTGG CCGAAGCCGT CCTGAAGGAC AAGAAGAAGG ACCTGAGCTATCGCGACATC

1681    CCCGCCTACT ACGCCGCCGG GCCCGCGCAA CGCGGGGTGA TCGGCGAGTACTGCATACAG

1741    GATTCCCTGC TGGTGGGCCA GCTGTTTTTT AAGTTTTTGC CCCATCTGGAGCTCTCGGCC

1801    GTCGCGCGCT TGGCGGGTAT TAACATCACC CGCACCATCT ACGACGGCCAGCAGATCCGC

1861    GTCTTTACGT GCCTGCTGCG CCTGGCCGAC CAGAAGGGCT TTATTCTGCCGGACACCCAG

1921    GGGCGATTTA GGGGCGCCGG GGGGGAGGCG CCCAAGCGTC CGGCCGCAGCCCGGGAGGAC

1981    GAGGAGCGGC CAGAGGAGGA GGGGGAGGAC GAGGACGAAC GCGAGGAGGGCGGGGGCGAG

2041    CGGGAGCCGG AGGGCGCGCG GGAGACCGCC GGCCGGCACG TGGGGTACCAGGGGGCCAGG

2101    GTCCTTGACC CCACTTCCGG GTTTCACGTG AACCCCGTGG TGGTGTTCGACTTTGCCAGC

2161    CTGTACCCCA GCATCATCCA GGCCCACAAC CTGTGCTTCA GCACGCTCTCCCTGAGGGCC

2221    GACGCAGTGG CGCACCTGGA GGCGGGCAAG GACTACCTGG AGATCGAGGTGGGGGGGCGA

2281    CGGCTGTTCT TCGTCAAGGC TCACGTGCGA GAGAGCCTCC TCAGCATCCTCCTGCGGGAC

2341    TGGCTCGCCA TGCGAAAGCA GATCCGCTCG CGGATTCCCC AGAGCAGCCCCGAGGAGGCC

2401    GTGCTCCTGG ACAAGCAGCA GGCCGCCATC AAGGTCGTGT GTAACTCGGTGTACGGGTTC

2461    ACGGGAGTGC AGCACGGACT CCTGCCGTGC CTGCACGTTG CCGCGACGGTGACGACCATC

2521    GGCCGCGAGA TGCTGCTCGC GACCCGCGAG TACGTCCACG CGCGCTGGGCGGCCTTCGAA

2581    CAGCTCCTGG CCGATTTCCC GGAGGCGGCC GACATGCGCG CCCCCGGGCCCTATTCCATG

2641    CGCATCATCT ACGGGGACAC GGACTCCATA TTTGTGCTGT GCCGCGGCCTCACGGCCGCC

2701    GGGCTGACGG CCATGGGCGA CAAGATGGCG AGCCACATCT CGCGCGCGCTGTTTCTGCCC

2761    CCCATCAAAC TCGAGTGCGA AAAGACGTTC ACCAAGCTGC TGCTGATCGCCAAGAAAAAG

2821    TACATCGGCG TCATCTACGG GGGTAAGATG CTCATCAAGG GCGTGGATCTGGTGCGCAAA

2881    AACAACTGCG CGTTTATCAA CCGCACCTCC AGGGCCCTGG TCGACCTGCTGTTTTACGAC

2941    GATACCGTAT CCGGAGCGGC CGCCGCGTTA GCCGAGCGCC CCGCAGAGGAGTGGCTGGCG

3001    CGACCCCTGC CCGAGGGACT GCAGGCGTTC GGGGCCGTCC TCGTAGACGCCCATCGGCGC

3061    ATCACCGACC CGGAGAGGGA CATCCAGGAC TTTGTCCTCA CCGCCGAACTGAGCAGACAC

3121    CCGCGCGCGT ACACCAACAA GCGCCTGGCC CACCTGACAG TGTATTACAAGCTCATGGCC

3181    CGCCGCGCGC AGGTCCCGTC CATCAAGGAC CGGATCCCGT ACGTGATCGTGGCCCAGACC

3241    CGCGAGGTAG AGGAGACGGT CGCGCGGCTG GCCGCCCTCC GCGAGCTAGACGCCGCCGCC

3301    CCAGGGGACG AGCCCGCCCC CCCCGCGGCC CTGCCCTCCC CGGCCAAGCGCCCCCGGGAG

3361    ACGCCGTCGC ATGCCGACCC CCCGGGAGGC GCGTCCAAGC CCCGCAAGCTGCTGGTGTCC

3421    GAGCTGGCCG AGGATCCCGC ATACGCCATT GCCCACGGCG TCGCCCTGAACACGGACTAT

3481    TACTTCTCCC ACCTGTTGGG GGCGGCGTGC GTGACATTCA AGGCCCTGTTTGGGAATAAC

3541    GCCAAGATCA CCGAGAGTCT GTTAAAAAGG TTTATTCCCG AAGTGTGGCACCCCCCGGAC

3601    GACGTGGCCG CGCGGCTCCG GGCCGCAGGG TTCGGGGCGG TGGGTGCCGGCGCTACGGCG

3661    GAGGAAACTC GTCGAATGTT GCATAGAGCC TTTGATACTC TAGCATGA

单纯疱疹病毒II型DNA酶高度保守基因序列

1      ATGTTTTCCG GTGGCGGCGG CCCGCTGTCC CCCGGAGGAA AGTCGGCGGCCAGGGCGGCG

61     TCCGGGTTTT TTGCGCCCGC CGGCCCTCGC GGAGCCGGCC GGGGACCCCCGCCTTGTTTG

121    AGGCAAAACT TTTACAACCC CTACCTCGCC CCAGTCGGGA CGCAACAGAAGCCGACCGGG

181    CCAACCCAGC GCCATACGTA CTATAGCGAA TGCGATGAAT TTCGATTCATCGCCCCGCGG

241    GTGCTGGACG AGGATGCCCC CCCGGAGAAG CGCGCCGGGG TGCACGACGGTCACCTCAAG

301    CGCGCCCCCA AGGTGTACTG CGGGGGGGAC GAGCGCGACG TCCTCCGCGTCGGGTCGGGC

361    GGCTTCTGGC CGCGGCGCTC GCGCCTGTGG GGCGGCGTGG ACCACGCCCCGGCGGGGTTC

421    AACCCCACCG TCACCGTCTT TCACGTGTAT GACATCCTGG AGAACGTGGAGCACGCGTAC

481    GGCATGCGCG CGGCACAGTT CCACGCGCGG TTTATGGACG CCATCACACCGACGGGGACC

541    GTCGTCACGC TCCTGGGCCT GACTCCGGAA GGCCACCGGG TGGCCGTTCACGTTTACGGC

601    ACGCGGCAGT ACTTTTACAT GAACAAGGAG GAGGTTGACA GGCACCTACAATGCCGCGCC

661    CCACGAGATC TCTGCGAGCG CATGGCCGCG GCCCTGCGCG AGTCCCCGGGCGCGTCGTTC

721    CGCGGCATCT CCGCGGACCA CTTCGAGGCG GAGGTGGTGG AGCGCACCGACGTGTACTAC

781    TACGAGACGC GCCCCGCTCT GTTTTACCGC GTCTACGTCC GAAGCGGGCGCGTGCTGTCG

841    TACCTGTGCG ACAACTTCTG CCCGGCCATC AAGAAGTACG AGGGTGGGGTCGACGCCACC

901    ACCCGGTTCA TCCTGGACAA CCCCGGGTTC GTCACCTTCG GCTGGTACCGTCTCAAACCG

961    GGCCGGAACA ACACGCTAGC CCAGCCGCGG GCCCCTATGG CCTTCGGGACATCCAGCGAC

1021   GTCGAGTTTA ACTGTACGGC GGACAACCTG GCCATCGAGG GGGGCATGAGCGACCTACCG

1081   GCATACAAGC TCATGTGCTT CGATATCGAA TGCAAGGCGG GGGGGGAGGACGAGCTGGCC

1141   TTTCCGGTGG CCGGGCACCC GGAGGACCTG GTCATCCAGA TATCCTGTCTGCTCTACGAC

1201   CTGTCTACCA CCGCCCTGGA GCACGTCCTC CTGTTTTCGC TCGGTTCCTGCGACCTCCCC

1261   GAATCCCACC TGAACGAGCT GGCGGCCAGG GGCCTGCCCA CGCCCGTGGTTCTGGAATTC

1321   GACAGCGAAT TCGAGATGCT GTTGGCCTTC ATGACCCTTG TGAAACAGTACGGCCCCGAG

1381   TTCGTGACCG GGTACAACAT CATCAACTTC GACTGGCCCT TCTTGCTGGCCAAGCTGACG

1441   GACATTTACA AGGTCCCCCT GGACGGGTAC GGCCGCATGA ACGGCCGGGGCGTGTTTCGC

1501   GTGTGGGACA TAGGCCAGAG CCACTTCCAG AAGCGCAGCA AGATAAAGGTGAACGGCATG

1561   GTGAACATCG ACATGTACGG GATTATAACC GACAAGATCA AACTCTCGAGCTACAAGCTC

1621   AACGCCGTGG CCGAAGCCGT CCTGAAGGAC AAGAAGAAGG ACCTGAGCTATCGCGACATC

1681   CCCGCCTACT ACGCCGCCGG GCCCGCGCAA CGCGGGGTGA TCGGCGAGTACTGCATACAG

1741    GATTCCCTGC TGGTGGGCCA GCTGTTTTTT AAGTTTTTGC CCCATCTGGAGCTCTCGGCC

1801    GTCGCGCGCT TGGCGGGTAT TAACATCACC CGCACCATCT ACGACGGCCAGCAGATCCGC

1861    GTCTTTACGT GCCTGCTGCG CCTGGCCGAC CAGAAGGGCT TTATTCTGCCGGACACCCAG

1921    GGGCGATTTA GGGGCGCCGG GGGGGAGGCG CCCAAGCGTC CGGCCGCAGCCCGGGAGGAC

1981    GAGGAGCGGC CAGAGGAGGA GGGGGAGGAC GAGGACGAAC GCGAGGAGGGCGGGGGCGAG

2041    CGGGAGCCGG AGGGCGCGCG GGAGACCGCC GGCCGGCACG TGGGGTACCAGGGGGCCAGG

2101    GTCCTTGACC CCACTTCCGG GTTTCACGTG AACCCCGTGG TGGTGTTCGACTTTGCCAGC

2161    CTGTACCCCA GCATCATCCA GGCCCACAAC CTGTGCTTCA GCACGCTCTCCCTGAGGGCC

2221    GACGCAGTGG CGCACCTGGA GGCGGGCAAG GACTACCTGG AGATCGAGGTGGGGGGGCGA

2281    CGGCTGTTCT TCGTCAAGGC TCACGTGCGA GAGAGCCTCC TCAGCATCCTCCTGCGGGAC

2341    TGGCTCGCCA TGCGAAAGCA GATCCGCTCG CGGATTCCCC AGAGCAGCCCCGAGGAGGCC

2401    GTGCTCCTGG ACAAGCAGCA GGCCGCCATC AAGGTCGTGT GTAACTCGGTGTACGGGTTC

2461    ACGGGAGTGC AGCACGGACT CCTGCCGTGC CTGCACGTTG CCGCGACGGTGACGACCATC

2521    GGCCGCGAGA TGCTGCTCGC GACCCGCGAG TACGTCCACG CGCGCTGGGCGGCCTTCGAA

2581    CAGCTCCTGG CCGATTTCCC GGAGGCGGCC GACATGCGCG CCCCCGGGCCCTATTCCATG

2641    CGCATCATCT ACGGGGACAC GGACTCCATA TTTGTGCTGT GCCGCGGCCTCACGGCCGCC

2701    GGGCTGACGG CCATGGGCGA CAAGATGGCG AGCCACATCT CGCGCGCGCTGTTTCTGCCC

2761    CCCATCAAAC TCGAGTGCGA AAAGACGTTC ACCAAGCTGC TGCTGATCGCCAAGAAAAAG

2821    TACATCGGCG TCATCTACGG GGGTAAGATG CTCATCAAGG GCGTGGATCTGGTGCGCAAA

2881    AACAACTGCG CGTTTATCAA CCGCACCTCC AGGGCCCTGG TCGACCTGCTGTTTTACGAC

2941    GATACCGTAT CCGGAGCGGC CGCCGCGTTA GCCGAGCGCC CCGCAGAGGAGTGGCTGGCG

3001    CGACCCCTGC CCGAGGGACT GCAGGCGTTC GGGGCCGTCC TCGTAGACGCCCATCGGCGC

3061    ATCACCGACC CGGAGAGGGA CATCCAGGAC TTTGTCCTCA CCGCCGAACTGAGCAGACAC

3121    CCGCGCGCGT ACACCAACAA GCGCCTGGCC CACCTGACAG TGTATTACAAGCTCATGGCC

3181    CGCCGCGCGC AGGTCCCGTC CATCAAGGAC CGGATCCCGT ACGTGATCGTGGCCCAGACC

3241    CGCGAGGTAG AGGAGACGGT CGCGCGGCTG GCCGCCCTCC GCGAGCTAGACGCCGCCGCC

3301    CCAGGGGACG AGCCCGCCCC CCCCGCGGCC CTGCCCTCCC CGGCCAAGCGCCCCCGGGAG

3361    ACGCCGTCGC ATGCCGACCC CCCGGGAGGC GCGTCCAAGC CCCGCAAGCTGCTGGTGTCC

3421    GAGCTGGCCG AGGATCCCGC ATACGCCATT GCCCACGGCG TCGCCCTGAACACGGACTAT

3481    TACTTCTCCC ACCTGTTGGG GGCGGCGTGC GTGACATTCA AGGCCCTGTTTGGGAATAAC

3541    GCCAAGATCA CCGAGAGTCT GTTAAAAAGG TTTATTCCCG AAGTGTGGCACCCCCCGGAC

3601    GACGTGGCCG CGCGGCTCCG GGCCGCAGGG TTCGGGGCGG TGGGTGCCGGCGCTACGGCG

3661    GAGGAAACTC GTCGAATGTT GCATAGAGCC TTTGATACTC TAGCATGA

引物对扩增目的片段

单纯疱疹病毒I型：2771～2911

TCGAGTGCGA AAAGACGTTC ACCAAGCTGC TGCTGATCGC CAAGAAAAAG TACATCGGCG

TCATCTACGG GGGTAAGATG CTCATCAAGG GCGTGGATCT GGTGCGCAAA AACAACTGCG

CGTTTATCAA CCGCACCTCC A

单纯疱疹病毒II型：2786～2926

TCGAGTGCGA AAAAACGTTC ACCAAGCTGC TGCTCATCGC CAAGAAAAAG TACATCGGCG

TCATCTGCGG GGGCAAGATG CTCATCAAGG GCGTGGATCT GGTGCGCAAA AACAACTGCG

CGTTTATCAA CCGCACCTCC A

序列表

<110>扬子江药业集团北京海燕药业有限公司

<120>I、II型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<400>1

acgtcttttc                                                    gcactcga

18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<400>2

tggaggtgcg                                                    gttgataa

18

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>5’端连有荧光基团FAM，3’端连有淬灭基团TAMRA

<400>3

accagatcca                                                    cgcccttga

19

Claims (8)

1.用于I、II型单纯疱疹病毒荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和实时荧光PCR的引物对及探针。

2.权利要求1所述的引物对及探针，其中所述引物对的序列为：

正向引物P1：5’-ACGTCTTTTCGCACTCGA-3’

反向引物P2：5’-TGGAGGTGCGGTTGATAA-3’

荧光探针序列为：5’-ACCAGATCCACGCCCTTGA-3’

该探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。

3.权利要求2所述的引物对及探针，其中所述的报告荧光染料选自FAM、JOE和HEX。

4.权利要求3所述的引物对及探针，其中所述的报告荧光染料为FAM。

5.权利要求2所述的引物对及探针，其中所述的淬灭荧光染料选自Eclipse和TAMRA。

6.权利要求5所述的引物对及探针，其中所述的淬灭荧光染料为TAMRA。

7.一种用于检测单纯疱疹病毒I、II型的实时荧光PCR检测方法，该方法包括下列步骤：

1)使用权利要求1-6中任一项所述的引物对及探针，与PCR扩增用的PCR缓冲液及DNA聚合酶混合，得到检测PCR反应液；

2)向上述PCR反应液中加入提取的待检样本的基因组DNA；

3)将步骤2)中建立的扩增反应体系置于荧光PCR仪上；

4)设置对应的荧光通道，按照本发明确立的反应条件进行荧光PCR反应扩增，反应结束后读取并记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct值)；

5)根据各样本的反应循环数，依据建立的判定标准对待测样本进行定性分析，判定样本中是否含有单纯疱疹病毒。

8.权利要求7所述方法，其中所述的判定标准为：如果待测样本的Ct值＜27，判定为阳性；若27＜Ct值＜30，则建议重新对样本进行检测，若样本仍Ct值＜30，则判定为阳性，否则为阴性；若Ct＝30，则判定为阴性。

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