CN107881261A

CN107881261A - 检测猪圆环病毒3型的lamp引物组、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN107881261A
Application number: CN201711409788.1A
Authority: CN
Inventors: 勾红潮; 李春玲; 蒋智勇; 蔡汝健; 宋帅; 李艳; 楚品品; 杨冬霞
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-23
Filing date: 2017-12-23
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明公开了一种快速检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用。该引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示的引物组；试剂盒包括上述的引物组、反应试剂；该试剂盒的使用方法如下：首先配制交叉引物扩增反应体系；恒温反应所得产物直接进行肉眼判读：阳性结果为黄色，阴性结果为红色。该试剂盒操作简单、成本低廉，反应快速，特异性好，结果易于观察，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属重要成员。2016年以前，人们通常认为猪圆环病毒包括两个基因型，即PCV1和PCV2。PCV1是从猪肾上皮细胞系(PK-15)中发现，对猪无致病性。而PCV2则是严重危害养猪业的病原体之一，与PCV2相关的疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、呼吸系统疾病、繁殖障碍和肠道疾病等。

2016年，Phan T.G.等报道了圆环病毒新的基因型-猪圆环病毒3型(PCV3)在美国的流行，后续在我国湖北、广东某些发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内也检测出PCV3。截至目前，我国已有13个省猪场存在PCV3感染与流行，且主要分布于中东部地区。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡。不同胎龄胎儿均可发生流产。

由于PCV3具有传播途径多、传播速度快、流行范围广、危害严重等特点，因此尽快研发适用于出入境口岸与兽医临床的PCV3快速检测试剂盒显得十分必要。目前，PCV3的检测包括DNA测序、中和试验、免疫组化和荧光定量PCR等技术。然而，这些技术在应用过程中或熟练的操作人员，或需要昂贵的仪器设备，不适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。环介导等温核酸扩增(LAMP)技术作为一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点，近年来已被广泛应用于病原体检测。为了方便结果判别，通常在LAMP反应体系中加入金属离子指示剂，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等，通过反应管的颜色变化观察结果。但遗憾的是，目前这些颜色变化之间色差不大，且通常需要较长的反应时间(60min)。专利检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组(申请号：201710757261.1，申请日：2017-08-29；公开号：CN107312875A，公开日：2017-11-03)将LAMP技术应用于PCV3的检测，但该方法所需反应时间较长(60min)，且灵敏度较低(76ng/μL)，仍不能满足出入境口岸或兽医基层对快速、灵敏检测方法的基本需求。

研究表明，当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的p H值降低。本发明基于此特性进行研究，将PH指示剂甲酚红用于LAMP反应的结果判别，并组装了猪圆环病毒3型的新型LAMP检测试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种猪圆环病毒3型的LAMP快速检测试剂盒及应用，该试剂盒具有高特异性、高敏感性、可视化、操作方法简单的特点。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组，由外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB组成；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的LAMP试剂盒，包括上述的检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组。

进一步地，该试剂盒还包括(NH₄)₂SO₄溶液、KCl溶液、Tween-20溶液、甲酚红溶液、KOH溶液、甜菜碱溶液、dNTP混合物溶液、Bst WarmStart^TMDNA聚合酶、MgSO₄溶液。

进一步地，该试剂盒包括：浓度为100mmol/L的(NH4)₂SO₄溶液2.5μL，终浓度为10mmol/L；浓度为500mmol/L的KCl溶液2.5μL，终浓度为50mmol/L；浓度为1％的Tween-20溶液2.5μL，终浓度为0.1％；浓度为1mmol/L的甲酚红溶液3.0μL，终浓度为0.12mmol/L；浓度为100mmol/L的KOH溶液1.0μL，终浓度为4mmol/L；浓度为10mol/L的甜菜碱溶液2.5μL，终浓度为1mol/L；浓度为10mmol/L的dNTP混合物溶液2.0μL，终浓度为0.8mmol/L；浓度为8U/μL的Bst WarmStart^TM DNA聚合酶1.0μL，终浓度为0.32U/μL；浓度为10μmol/L的外引物F3 0.5μL，终浓度为0.2mmol/L；浓度为10μmol/L的外引物B3 0.5μL，终浓度为0.2mmol/L；浓度为10μmol/L的内引物FIP 3.0μL，终浓度为1.2mmol/L；浓度为10μmol/L的内引物BIP 3.0μL，终浓度为1.2mmol/L；浓度为10μmol/L的环引物LoopF 3.0μL，终浓度为0.4mmol/L；浓度为10μmol/L的LoopB 3.0μL，终浓度为0.4mmol/L；浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液1.5μL，终浓度为6mM。

本发明还公开了一种上述的引物组或试剂盒在检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型中的应用。

本发明还公开了一种检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型的方法，包括以下步骤：

1)用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3-4任一权利要求所述的试剂盒对待测样品进行LAMP扩增，得到扩增产物；

2)结果判读：直接肉眼判读，

a)阴性：若扩增产物呈现红色，证明待测样品没有猪圆环病毒3型感染；

b)阳性：若扩增产物呈现黄色，证明待测样品为猪圆环病毒3型感染。

进一步地，步骤1)中所述的恒温反应的时间为30min；恒温反应的温度为63℃。

进一步地，步骤1)中待测样品的模板为浓度为10⁵拷贝/μL的猪圆环病毒3型ORF2基因。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)由于LAMP检测方法成本低廉，在63℃实现等温扩增，不需要复杂且昂贵的PCR仪，因此本发明提供的试剂盒使用成本低。

2)本发明所提供的试剂盒反应迅速，可以在30min内完成反应。

3)本发明提供的试剂盒得到的反应结果直观准确，通过肉眼观察颜色直接进行判定，无需进行复杂操作。

4)本发明提供的试剂盒特异性好，对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肾细胞传代系PK-15、清洁级猪肺脏组织都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到100拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因，比PCR方法敏感性高10倍。

5)本发明所述的LAMP检测试剂盒可快速、敏感的检测猪圆环病毒3型，该试剂盒操作简单、成本低廉、反应快速、结果易于观察，特异性好，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明不同温度下反应的电泳亮度关系图，其中，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1～7依次对应反应温度为60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃的反应产物，8为空白对照；

图2是本发明不同浓度内引物(FIP+BIP)与电泳亮度关系图，泳道M为DNA MarkerDL2000，泳道1～7依次对应内引物(FIP+BIP)浓度为0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM的反应产物，8为空白对照；

图3是本发明不同浓度环引物(LoopF+LoopB)与电泳亮度关系图，泳道M为DNAMarker DL2000，泳道1～7依次对应环引物(LoopF+LoopB)浓度为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM反应产物，8为空白对照；

图4是本发明提供的LAMP试剂盒特异性实验中的结果图，其中：1是以猪圆环病毒2型基因组DNA为模板的检测结果；2是以猪细小病毒基因组DNA为模板的检测结果；3是以伪狂犬病毒Bartha-K61株基因组DNA为模板的检测结果；4是以血清5型副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板的检测结果；5是以血清2型猪链球菌基因组DNA为模板的检测结果；6是以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA为模板的检测结果；7是以猪肾细胞传达系PK-15基因组DNA为模板的检测结果；8是以清洁级猪肺脏组织基因组DNA为模板的检测结果，9是空白对照；10是以猪圆环病毒3型ORF2基因为模板的检测结果；

图5是本发明提供的LAMP试剂盒敏感性试验结果图；其中，泳道M为DNA MarkerDL2000，1为10⁵拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；10⁴拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；3为10³拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；4为10²拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；5为10拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；6为1拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；

图6是本发明利用PCR方法进行敏感性试验的结果图；其中，1为10⁵拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；10⁴拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；3为10³拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；4为10²拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；5为10拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；6为1拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因；

图7是本发明提供的LAMP试剂盒检测临床病料的结果图；其中，1-6为兽医临床收集的疑似圆环病毒感染猪的肺脏组织基因组DNA；

图8是本发明利用PCR方法进行临床病料检测得到的图；其中，1-6为兽医临床收集的疑似圆环病毒感染猪的肺脏组织基因组DNA。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明技术研制了猪圆环病毒3型LAMP检测方法，通过优化反应条件与反应体系，使得猪圆环病毒3型的检测过程更加方便、快速、灵敏。本发明技术提供的检测试剂盒在整个使用过程不需要复杂仪器，核酸样品制备与扩增程序简便，容易在兽医基层建立与开展。

实施例中所涉及的材料：

a)猪圆环病毒3型ORF2基因由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Bst WarmStart^TMDNA聚合酶购自New England公司；MgSO₄(100mM)购自New England公司；甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；KOH购自Sigma公司；甲酚红购自Macklin公司；(NH₄)₂SO₄购自Sigma公司；KCl购自Sigma公司；Tween-20购自Sigma公司；病毒核酸提取试剂盒购自Magen(美基)生物(R4410-03)；伪狂犬病活疫苗(Bartha-K61株)、猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)、猪细小病毒油乳剂灭活疫苗购自上海海利生物技术有限公司；PK-15细胞购自上海拜力生物技术有限公司。

b)以下生物材料均已在文献“副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重PCR方法的建立与应用.中国兽医学报,2009(9):第1155-1157页.”中公开：血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌。

实施例1LAMP引物的设计和合成

根据引物设计原则，针对猪圆环病毒3型ORF2基因的保守区域序列，应用LAMP引物在线设计软件PrimerExplorer V5进行内引物和外引物的设计，按照我们的经验保证引物的GC含量在40％～60％之间。根据经验筛选理论值最优的引物组后，继续应用软件PrimerExplorer V5进行环引物的设计。序列如表1所示，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μM，-20℃保存。

表1猪圆环病毒3型的LAMP检测引物组

实施例2LAMP引物在检测待测病毒中的应用

一、核酸标准品的制备

将上海生工生物工程技术服务有限公司合成的猪圆环病毒3型ORF2基因进行核酸浓度测定后，用超纯水稀释至10⁵拷贝/μL的浓度，作为核酸标准品。

二、LAMP检测方法的建立

以浓度为10⁵拷贝/μL的猪圆环病毒3型ORF2基因为模板，应用筛选获得的理论值最优的1套引物(如表1所示)进行交叉引物扩增，并对得到产物进行琼脂糖凝胶(质量体积比2％)电泳检测。

三、LAMP反应条件的优化

1.反应温度的优化

为了得到最优化的反应温度，分别设置60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃进行交叉等温扩增反应，反应时间是30min，反应体系如表2所示。反应产物通过2％琼脂糖凝胶(质量体积比)电泳检测，从多次重复试验中确定最佳反应温度，结果如图1所示，说明最佳反应温度为63℃。

2.反应体系的优化

主要对内引物、环引物浓度进行优化，反应产物通过2％琼脂糖凝胶(质量体积比)电泳检测。

通过设置不同终浓度的内引物(FIP+BIP)：0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM、1.2μM、1.4μM、1.6μM，其他成分的用量如表2所示(结果如图2所示)。检测条件为63℃恒温30min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系(25μL)如表2所示。

通过设置不同终浓度的环引物(LoopF+LoopB)：0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM，其他成分的用量如表2所示(结果如图3所示)。检测条件为63℃恒温30min。根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系(25μL)如表2所示。

表2优化的猪圆环病毒3型LAMP反应体系

四、LAMP检测方法的特异性、敏感性分析

1.特异性分析

使用猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒Bartha-K61株、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肾细胞传达系PK-15、清洁级猪肺脏组织的基因组DNA为模板检测体系的特异性。反应体系如表2所示，反应条件为步骤1确定的优化条件。得到的结果如图4所示：以猪圆环病毒3型ORF2基因(标记10)为模板的反应产物呈现天蓝色，以猪圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒Bartha-K61株、血清5型副猪嗜血杆菌、血清2型猪链球菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肾细胞传达系PK-15、清洁级猪肺脏组织的基因组DNA分别为模板反应产物呈现紫色。结果显示检测体系的特异性良好，可特异的检测到猪圆环病毒3型。

2.敏感性分析

取1μL浓度为10⁵拷贝/μL的猪圆环病毒3型ORF2基因DNA，依次加入9μL的灭菌纯水进行10倍梯度稀释，各取1μL稀释后样品液进行LAMP检测(反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤1确定的优化条件)与PCR检测。PCR所使用的引物是F3与B3引物，反应体系如表3所示：

表3PCR反应体系

PCR程序如下：94℃预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s为一个循环，运行35个循环，最后72℃延伸8min，4℃保存。

比较LAMP检测法与PCR琼脂糖凝胶电泳检测方法的敏感性。结果如图5和6所示，LAMP检测法最低可以检测到10²拷贝的猪圆环病毒3型ORF2基因DNA，比PCR琼脂糖凝胶电泳的敏感性高10倍。相比之下，本发明提供的交叉等温扩增-测流层析检测方法敏感性高，操作更加简单(等温反应)，而且用时更短(只需30min)，结果比较直观(肉眼判别)。

实施例3疑似PCV3感染猪的病料组织检测

从临床采集疑似PCV3感染猪的肺脏6份，取临床病料2-3mg，充分研磨后加入1ml生理盐水。反复冻融3次，离心去上清液。吸取上清液200μL，按照病毒RNA/DNA提取试剂盒的操作说明进行病毒的核酸提取。各取1μL提取的核酸进行LAMP检测(反应体系如表2所示，除了模板有变化；反应条件为步骤1确定的优化条件)与PCR检测。结果如图7和8所示，LAMP检测法和PCR琼脂糖凝胶电泳检测法均可检测出5份阳性病料，二者的符合率为100％。

在本发明中关键试剂为甲酚红，LAMP反应的发生可促进体系PH值由碱性变成酸性，甲酚红的加入可使反应管由红色变为黄色，这种色差的变化更明显，更能清晰的指示反应结果。

本方法的关键参数为反应时间短，仅需30min，灵敏度高，结果判定直观(阳性黄色，阴性红色)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用

<130> 2017

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ccgggacata aatgctccaa 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

ccacaaacac ttggctcca 19

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ctcacccagg acaaagcctc ttcattgaac ggtggggtca t 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tggtttcggg gtgaagtaac ggagacgacc cttatgcgga a 41

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cccaccccat ggctcaa 17

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

gtcataactt tacgagtgga ac 22

Claims

1.一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组，其特征在于，由外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LoopF和环引物LoopB组成；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种检测猪圆环病毒3型的LAMP试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括(NH₄)₂SO₄溶液、KCl溶液、Tween-20溶液、甲酚红溶液、KOH溶液、甜菜碱溶液、dNTP混合物溶液、Bst WarmStart^TMDNA聚合酶、MgSO₄溶液。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：浓度为100mmol/L的(NH4)₂SO₄溶液2.5μL，终浓度为10mmol/L；浓度为500mmol/L的KCl溶液2.5μL，终浓度为50mmol/L；浓度为1％的Tween-20溶液2.5μL，终浓度为0.1％；浓度为1mmol/L的甲酚红溶液3.0μL，终浓度为0.12mmol/L；浓度为100mmol/L的KOH溶液1.0μL，终浓度为4mmol/L；浓度为10mol/L的甜菜碱溶液2.5μL，终浓度为1mol/L；浓度为10mmol/L的dNTP混合物溶液2.0μL，终浓度为0.8mmol/L；浓度为8U/μL的Bst WarmStart^TM DNA聚合酶1.0μL，终浓度为0.32U/μL；浓度为10μmol/L的外引物F3 0.5μL，终浓度为0.2mmol/L；浓度为10μmol/L的外引物B30.5μL，终浓度为0.2mmol/L；浓度为10μmol/L的内引物FIP 3.0μL，终浓度为1.2mmol/L；浓度为10μmol/L的内引物BIP 3.0μL，终浓度为1.2mmol/L；浓度为10μmol/L的环引物LoopF3.0μL，终浓度为0.4mmol/L；浓度为10μmol/L的LoopB 3.0μL，终浓度为0.4mmol/L；浓度为100mmol/L的MgSO₄溶液1.5μL，终浓度为6mM。

5.权利要求1-2所述的引物组或权利要求3-4任一权利要求所述的试剂盒在检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型中的应用。

6.一种检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)结果判读：直接肉眼判读，

7.根据权利要求6所述的检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，步骤1)中所述的恒温反应的时间为30min；恒温反应的温度为63℃。

8.根据权利要求6所述的检测待测样品是否感染猪圆环病毒3型的方法，其特征在于，步骤1)中待测样品的模板为浓度为10⁵拷贝/μL的猪圆环病毒3型ORF2基因。