CN111778344A

CN111778344A - Rpa-lfd可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111778344A
Application number: CN202010557999.5A
Authority: CN
Inventors: 周晓农; 胡薇; 邓王平; 洪清华; 许静; 徐斌; 李石柱
Original assignee: Fudan University; National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Fudan University; National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明公开了一种RPA‑LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法，引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明以SjCHGCS19基因为靶序列设计了RPA引物及探针，并采用RPA扩增技术结合侧流层析试纸条法，实现了血吸虫核酸的敏感、快速可视化检测。本发明中的检测方法对日本血吸虫基因组DNA检测限可达1fg并有望用于曼氏血吸虫及埃及血吸虫的通用检测，该方法可检出感染早期小鼠血清中血吸虫循环核酸，操作简单且快速，无需特殊仪器，反应温度与室温接近，可肉眼观察结果，有利于实现现场血吸虫中间宿主的早期敏感快速检测，及血吸虫病传播风险高危环境的及时敏感监测。

Description

RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫循环核酸的引物、探针、反应体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，流行于全球78个国家和地区，被WHO列为极易复现的被忽视热带病之一。中国仅流行日本血吸虫病，经过70年的积极防治，我国血吸虫病感染率及感染度已降低至历史极低水平。同时，随着全球一体化进程的提速，人员流动愈发频繁，境外输入性血吸虫病病例不断出现，已成为我国血吸虫病防治工作面临的新挑战及新困难。新形势下，现有病原学及免疫学诊断技术在血吸虫检测敏感性、早期检测及输入性血吸虫鉴别检测方面的弊端日趋明显，尚不足以满足消除阶段对血吸虫病疫情及时、敏感及有效监测的需求。近年来，检测血吸虫特异核酸序列的多种分子诊断方法已有诸多报道，展示了核酸检测在血吸虫感染检测中的应用价值。然而，这些方法大多基于PCR、巢式PCR、实时定量PCR及数字PCR等，其敏感性及特异性方面虽具有优势，但因大多依赖昂贵的仪器设备、操作繁琐、耗时较长等特点，一定程度上限制了其推广应用，因此迫切需要探索更为简便的核酸检测方法用于血吸虫病的检测与监测。

重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)技术，是近年来备受关注且迅速发展的等温扩增技术，其依据T4噬菌体核酸复制机制，利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因的扩增。已有文献中关于日本血吸虫核酸检测技术的诊断应用价值Meta分析结果提示，等温扩增技术的诊断效能优于依赖变温扩增设备的PCR类技术；等温扩增技术中，RPA又具有明显的诊断优势。然而目前报道的基于RPA或RAA的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核酸检测方法大多以日本血吸虫非长末端重复序列反转录转座子(Schistosoma japonicum non-long terminal repeatretrotransposons，SjR2)片段为靶标，其特异性较好，但敏感性不够理想，且需借助相应的仪器，不适宜基层应用。本课题组前期以SjR2序列为靶标，建立了基于RPA技术的电化学DNA传感器检测方法，其敏感性虽高，但仍需借助一定的检测设备，限制了其在现场的推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种可视化快速检测血吸虫核酸的检测方法，该方法具有敏感性高、检测快速、简单便携、无需借助昂贵仪器即可肉眼观察检测结果、适用于实验室及现场血吸虫病的早期诊断、鉴定和筛查的特点。

为解决上述技术问题，本发明根据登录号为FN356221.1的日本血吸虫SjCHGCS19基因序列，设计并提供了以下技术方案。

第一方面，本发明提供一对RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的特异性RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列为：

上游引物RPA-PF:5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'(如SEQ ID NO.1所示)；

下游引物RPA-PR:5'-BIOTIN-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'(如SEQ IDNO.2所示)。

作为一个优选的实例，所述引物中，下游引物(RPA-PR)的5'端为生物素化修饰。

第二方面，本发明提供一种RPA-LFD可视化检测血吸虫核酸的RPA-NFO探针，所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGA TAT-ph-3'(如SEQ ID NO.3所示)。

具体地，所述探针的核苷酸序列中，5'端为荧光素修饰(FAM)，第33个碱基为四氢呋喃残基(THF)，3'为磷酸基团封闭(ph)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合。前述的引物及探针，其扩增的特异性片段为日本血吸虫非长末端逆转录转座子SjCHGCS19(Genbank No.FN356221)的第474-656bp间的序列，大小为183bp，扩增序列为：

AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAACATCATCCAGTGTTATGCACCCACCAACGACGGCAACGACGAGGACAAAGATCAGTTTTATGATAGGCTTCAGTCAATTATAGCGAAGTGTCCAGGAAAGGATCTGACAATCCTGATGGGGGACCTAAATGCCAAAGTCGGAATGGACAACACT(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明还提供前述的引物及探针的组合用于制备成RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒的应用。

第三方面，本发明提供一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对，和如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针。

优选的，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂。RPA扩增反应体系试剂是指除了引物对、探针及模板之外的RPA扩增反应体系中的所有试剂组分。所述RPA扩增反应体系试剂包含：RPA反应缓冲液、RPA扩增试剂、醋酸镁、双蒸水。其中，RPA扩增试剂是指依赖重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的作用，实现目的基因扩增的试剂。所述RPA扩增试剂的组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

优选的，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条(LFD)。

优选的，所述试剂盒还可以包括阴性对照品。在一种实施方式中，所述阴性对照品为双蒸水。

优选的，所述试剂盒还可以包括阳性对照品。在一种实施方式中，所述阳性对照品为血吸虫基因组DNA。

第四方面，本发明公开一种RPA-LFD可视化检测日本血吸虫核酸的方法，其步骤为：

1)提取待测样本中的总DNA；

2)RPA扩增：将如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对、如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针、RPA反应缓冲液、总DNA模板及醋酸镁混合于含RPA扩增试剂的反应管中配置成RPA反应体系，反应温度设为30～45℃，反应时间为10～30min，进行RPA扩增；设置双蒸水为阴性对照，血吸虫基因组DNA为阳性对照；

3)LFD检测RPA扩增产物：采用侧流层析试纸条(LFD)检测RPA扩增产物；将扩增产物稀释后，滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条样品垫垂直插入稀释液中，室温反应5-10min，肉眼观察结果。当试纸条检测线及质控线均显色(出现紫色条带)，表明RPA扩增产物为阳性，样本中含有血吸虫DNA；若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物，样本中无血吸虫DNA；若质控线未显色，表明实验结果无效。

作为一个具体的实施例，所述RPA扩增试剂组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及外切酶。

作为一个具体的实施例，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

作为一个具体的实施例，所述侧流层析试纸条为Milenia Genline Hybridetect-1试纸条。

作为一个具体的实施例，所述RAP反应体系通常为50ul反应体系：向含RPA组分的冻干粉中加入29.5μl Rehydration Buffer，2-2.5μl 10μM的上游引物、2-2.5μl 10μM的下游引物，2-2.5μl 10μM的醋酸镁、1-5μl DNA模板，用双蒸水补足到50μl。

优选的，RPA扩增的较佳条件为：反应温度为39℃，反应时间为20min。

优选的，LFD检测RPA扩增产物的较佳条件为：将扩增产物稀释50倍后，取10μl滴加于侧流层析试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入PBST中，室温反应5min，肉眼观察结果。

为实现对日本血吸虫核酸的敏感、快速及简便的检测，本发明选取SjCHGCS19序列，设计了新型的RPA引物及探针，结合RPA技术及侧流层析试纸条法建立了日本血吸虫核酸可视化快速敏感检测方法，并对其检测日本血吸虫核酸的敏感性、特异性及循环核酸早期检测可行性进行初步评价。本发明中通过引入荧光标记的探针及生物素标记的引物，在RPA反应过程中，产生大量一端FAM标记、另一端生物素标记的双链DNA产物。RPA反应液滴加于金标试纸条并随试纸条层析移动时，标记有FAM和生物素的扩增产物与纳米金偶联抗体及检测线上的配体形成复合物使纳米金聚集显色，出现检测线。试纸条上的质控线包被有二抗，可与游离的FAM探针及FAM抗体标记的纳米金粒结合而显色，出现质控线，以指示结果的有效性。

本发明以非长末端逆转录转座子重复序列SjCHGCS19为靶序列，设计了新型的RPA扩增引物及RPA-nfo探针，将重组酶聚合酶扩增与侧流试纸条结合，建立了RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的方法。本发明公开的RPA-LFD方法在30～45℃反应10min即可肉眼检出血吸虫阳性条带，在39℃，20min的最佳反应条件下，其最低可检出10^-6ng(1fg)日本血吸虫成虫基因组DNA，比以SjR2为靶标的LFD-RPA检测方法(检出限5fg)及基于SjCHGCS19靶标的巢式PCR方法(检出限21.5fg)敏感性更高。本发明的方法检测华支睾吸虫及卫氏并殖吸虫基因组DNA时基本无交叉反应，检测曼氏血吸虫及埃及血吸虫基因组DNA时出现阳性结果，提示可以用于日本血吸虫、曼氏血吸虫及埃及血吸虫的通用检测。

本发明最低可成功检出含10^-2ng(10pg)日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性血清及40条日本血吸虫尾蚴感染小鼠7、21和35d血清DNA样本中的SjCHGCS19片段，显示了该方法用于血清等复杂样品中痕量血吸虫循环核酸检测的可行性及优良性能，同时提示该方法用于血吸虫早期(童虫期)、中期(未产卵成虫期)及晚期(产卵期)感染宿主血清DNA检测的潜在应用价值该方法可检出实验室血吸虫感染小鼠血清中DNA片段，具有早期检测价值。

综上，本发明的有益效果为：本研究提供的RPA-LFD检测方法及试剂盒操作简单，无需特殊仪器设备(如荧光检测仪、电泳仪、电化学DNA传感器等)，反应温度范围宽，常用温度与室温接近，反应快速，可肉眼观察结果，具有较强的血吸虫病防治现场应用潜力。该方法能在小鼠感染后短时间内检出血清中血吸虫循环核酸，具有早期检测价值，可以用于血吸虫感染的早期检测，为及时发现血吸虫病传播的高危风险环境及血吸虫感染中间宿主(如钉螺)进行非诊断为目的实验室早期鉴定及筛查，并为我国输入性血吸虫病的敏感监测提供技术储备。

附图说明

图1为实施例2中RPA-LFD检测日本血吸虫基因组DNA的反应条件优化的试纸条显色结果图。其中，A：不同反应温度的检测结果；B：不同反应时间的检测结果。1～7:反应温度分别为20、25、30、35、40、45和50℃；8～14：反应时间分别为0、5、10、15、0、25、30min。

图2为实施例3中RPA-LFA检测日本血吸虫基因组DNA的敏感性及特异性评价的试纸条显色结果图。其中，A：RPA-LFD检测梯度浓度日本血吸虫基因组DNA结果；B：RPA-LFD检测多种吸虫基因组DNA结果。1～7：分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7ng日本血吸虫基因组DNA；8、9：双蒸水；10～14：分别为华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫和日本血吸虫基因组DNA。

图3为实施例4中RPA-LFD检测鼠血清中日本血吸虫循环DNA的效果评价的试纸条显色结果图。其中，A：RPA-LFD检测模拟阳性鼠血清中循环DNA结果；B：RPA-LFD检测日本血吸虫感染鼠血清中循环DNA结果。1：双蒸水；2～6：分别为含10²ng、10ng、1ng、10^-1ng和10^-2ng日本血吸虫基因组DNA的模拟阳性血清DNA样本；7～10：分别为血吸虫感染前、感染后7、21和35d小鼠血清DNA样本。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：模板DNA、引物及探针的制备

1)模板DNA制备：采用组织DNA抽提试剂盒(

Blood&Tissue kit，购自Qiagen公司)提取日本血吸虫成虫、曼氏血吸虫成虫、埃及血吸虫虫卵、卫氏并殖吸虫囊蚴、华支睾吸虫成虫(五种寄生虫均由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供)的基因组DNA。将10^-2ng、10^-1ng、1ng、10ng及10²ng日本血吸虫成虫基因组DNA分别混入500μl正常小鼠血清中，采用E.Z.N.A.^TM Circulating DNA Kit抽提模拟阳性血清、血吸虫感染前及感染后7、21和35d小鼠血清中的游离DNA。

2)引物及探针设计：以SjCHGCS19基因片段为靶序列，采用Primer primer 5软件结合BLAST设计RPA引物及探针，扩增产物长度为183bp。所有引物及探针DNA由上海生工生物科技有限公司合成。

上游引物(RPA-PF)为：5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'；

下游引物(RPA-PR)为：5'-Biotin-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'

探针(RPA-nfo probe)：

FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGATAT-ph(5'端氨基修饰)；其中，[THF]是四氢呋喃(tetrahydrofuran)残基，为核酸外切酶的识别位点；ph代表磷酸基团，用以阻断DNA链的延伸。

实施例2：RPA-LFD检测日本血吸虫基因组DNA方法的建立及条件优化

1)RPA-LFD检测方法的建立：

参照

nfo kit说明书，将实施例1设计的上、下游引物(10μmol/L)各2.1μl，实施例1设计的探针(10μmol/L)0.6μl、反应缓冲液29.5μl、ddH₂O 12.2μl，模板DNA 1μl，MgAc₂ 2.5μl配置成50μl的混合体系，加入RPA反应管溶解冻干粉，充分混匀后于水浴锅中反应，以双蒸水为阴性对照。反应温度设置为8个梯度：15、20、25、30、35、40、45和50℃，反应扩增时间设置为7个梯度：0、5、10、15、20、25和30min，其他条件相同，以确定最佳的RPA反应温度和时间。

采用Milenia GenLine HybriDetect 1侧流层析试纸条检测RPA扩增产物。将扩增产物稀释50倍后，取10μl滴加于试纸条样品垫上，然后将试纸条样品垫垂直插入200μlPBST中，室温反应5min，肉眼观察结果。

当试纸条检测线及质控线均出现红色条带，表明RPA扩增产物为阳性，若只质控线显色，表明RPA无目标扩增产物；若质控线未显色，表明实验结果无效。

2)RPA-LFD检测日本血吸虫反应温度及时间条件优化结果：

在反应30min条件下，RPA-LFD在所设置的15、20、25、30、35、40、45和50℃梯度温度条件下质控线均出现条带，其中30～45℃范围内检测线条带均较明显，且35～40℃范围内检测线条带颜色最深(图1的A)，表明30～45℃为RPA适合反应温度区间，35～40℃为最佳反应温度，因此选择RPA试剂盒推荐的39℃作为后续实验扩增温度。

在39℃扩增温度条件下，扩增10min即达到可检出的产物水平；10～20min内，阳性条带随着反应时间的增加逐渐增强，20min基本达到饱和(图1的B)。为满足低浓度模板的检测效率并提高时效性，同时避免非特异性扩增反应的产生，选择20min作为后续性能评价的反应时间。

实施例3：RPA-LFD检测日本血吸虫敏感性及特异性评价

选择39℃，20min作为RPA扩增条件，将日本血吸虫基因组DNA模板设置为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7ng等8个浓度梯度，以此评价RPA-LFD检测敏感性。

以曼氏血吸虫、埃及血吸虫、卫氏并殖吸虫、华支睾吸虫基因组DNA各1ng为模板，评价RPA-LFD检测的特异性。

结果显示：除双蒸水及10^-7ng组外，10^-1～10^-6ng组均可见明显检测线条带，且随模板量增加，检测线颜色逐渐加深(图2的A)，RPA-LFD对日本血吸虫基因组DNA的最低检出限可达10^-6ng(1fg)。特异性评价结果显示，RPA-LFD检测日本血吸虫与卫氏并殖吸虫和华支睾吸虫无交叉反应，具有特异性；但与曼氏血吸虫及埃和血吸虫存在较强的交叉反应(图2的B)，具有通用性；提示本发明所采用的SjCHGCS19序列和引物具有血吸虫属特异性，有望用于日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫的通用检测。

实施例4：RPA-LFD检测小鼠血清中血吸虫循环核酸的效果评价

采用优化的实验条件，对模拟阳性血清DNA进行RPA-LFD检测，考察该方法检测血清中循环血吸虫核酸的可行性及性能。

选取40条血吸虫尾蚴感染小鼠(6～8周龄C57小鼠，购自上海杰斯捷实验动物有限公司(动物生产许可证号为SCXK(沪)2018-0004))感染前及感染后7、21、35d血清DNA作为模板进行RPA-LFD检测，考察该方法检测血吸虫感染血清样本中循环核酸的性能，评价其早期检测价值。

结果显示，RPA-LFD检测含10^-2、10^-1、1、10及10²ng日本血吸虫基因组DNA模拟阳性血清时，试纸条上均可见阳性检测线，且条带颜色深度随血清中DNA浓度增加而增强(图3的A)，而正常血清组无检测线。RPA-LFD检测感染后7、21和35d的血清DNA时，均出现肉眼可见阳性检测线，其中7d及21d组检测线较淡，35d组检测线条带颜色最深，而感染前血清DNA组未出现阳性检测线(图3的B)。结果显示了本发明用于血清等复杂样品中痕量血吸虫循环核酸检测的可行性及优良性能，同时提示本发明用于血吸虫早期(童虫期)、中期(未产卵成虫期)及晚期(产卵期)感染宿主血清DNA检测的潜在应用价值该方法可检出实验室血吸虫感染小鼠血清中DNA片段，具有早期检测价值，用于以非诊断为目的实验室早期鉴定及筛查。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）

复旦大学

<120> RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物、探针、试剂盒及方法

<130> CPC-NP-20-102016

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 正向引物()

<400> 1

aagacaatga agaaggggat tacaatgaac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 反向引物()

<400> 2

agtgttgtcc attccgactt tggcatttag 30

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 探针()

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> n为四氢呋喃

<400> 3

cttaaagcga gggagagcgg caggaccaga tgnattgacc cctgagatat 50

<210> 4

<211> 183

<212> DNA

<213> SjCHGCS19

<400> 4

aagacaatga agaaggggat tacaatgaac atcatccagt gttatgcacc caccaacgac 60

ggcaacgacg aggacaaaga tcagttttat gataggcttc agtcaattat agcgaagtgt 120

ccaggaaagg atctgacaat cctgatgggg gacctaaatg ccaaagtcgg aatggacaac 180

act 183

Claims

1.一对RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物：5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'；

下游引物：5'-Biotin-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述下游引物的5'端为生物素化修饰，所述一对引物所扩增的特异性片段为日本血吸虫非长末端逆转录转座子SjCHGCS19的第474-656bp间的序列，大小为183bp，扩增序列为：

AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAACATCATCCAGTGTTATGCACCCACCAACGACGGCAACGACGAGGACAAAGATCAGTTTTATGATAGGCTTCAGTCAATTATAGCGAAGTGTCCAGGAAAGGATCTGACAATCCTGATGGGGGACCTAAATGCCAAAGTCGGAATGGACAACACT。

3.一种RPA-LFD可视化检测血吸虫核酸的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGATAT-ph-3'，

其中，FAM表示5'端为荧光素修饰，THF表示第33个碱基为四氢呋喃残基，ph表示3'为磷酸基团封闭。

4.一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的引物与探针的组合，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

上游引物：5'-AAGACAATGAAGAAGGGGATTACAATGAAC-3'；

下游引物：5'-Biotin-AGTGTTGTCCATTCCGACTTTGGCATTTAG-3'；

所述探针的核苷酸序列为：

5'-FAM-CTTAAAGCGAGGGAGAGCGGCAGGACCAGATG[THF]ATTGACCCCTGAGATAT-ph-3'。

5.如权利要求4所述的引物与探针的组合用于制备成RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒的应用。

6.一种RPA-LFD可视化快速检测血吸虫核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如SEQ ID NO.1～2所示的引物对，和如SEQ ID NO.3所示的探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RPA扩增反应体系试剂；所述RPA扩增反应体系试剂包含：RPA反应缓冲液、RPA扩增试剂、醋酸镁、双蒸水；其中，所述RPA扩增试剂的组分包括：噬菌体重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP以及核酸外切酶。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括侧流层析试纸条。

9.一种非诊断目的的RPA-LFD可视化检测日本血吸虫核酸的方法，其特征在于，包括步骤：

1)提取待测样本中的总DNA；

2)RPA扩增：将如SEQ ID NO.1～2所示的RPA引物对、如SEQ ID NO.3所示RPA-nfo探针、RPA反应缓冲液、总DNA模板及醋酸镁混合于含RPA扩增试剂的反应管中配置成RPA反应体系，反应温度设为30～45℃，反应时间为10～30min，进行RPA扩增；以双蒸水为阴性对照，以血吸虫基因组DNA为阳性对照；

3)LFD检测RPA扩增产物：采用侧流层析试纸条检测RPA扩增产物，将扩增产物稀释后，滴加于侧流层析试纸条的样品垫上，然后将样品垫垂直插入稀释液中，室温反应5-10min，肉眼观察结果。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，RPA的反应体系为50ul,包含：29.5μl Rehydration Buffer，2-2.5μl 10μM上游引物，2-2.5μl 10μM下游引物，2-2.5μl 10μM醋酸镁，1-5μl DNA模板，用双蒸水补足到50μl。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，RPA扩增的条件为：反应温度为39℃，反应时间为20min。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，LFD检测的条件为：将扩增产物稀释50倍后，取10μl滴加于样品垫上，然后将样品垫垂直插入PBST中，室温反应5min，肉眼观察结果。