CN105463124B - 幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用 - Google Patents

幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用。幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系包括多对引物，分别针对菌种鉴定基因（16S rRNA），毒力基因（cagA、vacA‑s1、vacA‑s2、vacA‑m1、vacA‑m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS）。本发明的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒不需要常规培养等步骤，可在同一反应体系对组织样本直接进行幽门螺杆菌的鉴定和多种毒力分析，弥补了常规检测方法通量低、耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学依据，为幽门螺杆菌感染的精准诊断与鉴别诊断和疾病预后判断提供重要参考。

Description

幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测产品以及该产品所用到的检测体系，属于生物技术领域。
背景技术
幽门螺杆菌（H.pylori）是一种革兰阴性、微需氧、弯曲状杆菌，主要寄居在人体胃部。幽门螺杆菌感染与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等发生发展密切相关，因此引起临床的广泛关注。1994年，国际癌症研究机构IARC已将其列为人类I类致癌因子，是目前为止唯一被列为明确对人类致癌的细菌性病原微生物。很多报告认为幽门螺杆菌感染与冠心病、类风湿、肝胆病、肺结核、妊娠呕吐、直结肠癌及多种皮肤病等疾病有关，其致病性与多种毒力基因的表达密切相关。流行病学显示，全球几乎有一半的人口感染此菌，发展中国家甚至高达60%～70%。因此，幽门螺杆菌感染是世界各国需要面对的公共卫生问题。
目前幽门螺杆菌鉴定和毒力检测方法均有其局限性。例如：1）分离培养鉴定：幽门螺杆菌培养成菌落后，经生化反应鉴定。由于幽门螺杆菌培养需要微需氧条件，对营养条件要求苛刻，因此检出率很低，作为常规诊断手段不易推广, 且幽门螺杆菌培养需要一定的时间, 不利于快速诊断。2）组织病理切片染色法：该方法是把患者胃镜检查活检组织切片,染色后可观察到组织中的幽门螺杆菌。该方法受幽门螺杆菌载量影响明显，且操作繁琐、费时，不适于大通量样本的检测。3）尿素酶依赖性试验（尿素呼气试验）：根据标志物不同分为13C呼吸试验及14C呼吸试验，临床应用广泛。缺点是费用高、易受抑菌药物和抑酸药物的影响、敏感度低。4）免疫学检查：检测血清中或唾液和尿液中抗体（IgG）或直接检测粪便中幽门螺杆菌的菌体抗原或者毒素成分。其缺点是不能反映现症感染。5）核酸分析法：包括测序、PCR、寡核苷酸探针杂交等，但是这些检查方法检测位点少，特异性低，通量小，成本较高，且不能做定量分析。幽门螺杆菌致病性与其产生的多种毒力因子密切相关。但是目前常规的检测方法均存在时间长、灵敏度低、费用高、通量低、尤其不能同时进行多种相关因素检测等缺点。
综上所述，如何快速、准确、全面地对幽门螺杆菌进行检测、鉴定和分析是本领域的技术人员迫切亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可以快速、全面、准确、低成本的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒，以及采用该检测体系在制备诊断产品方面的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，可在同一个反应体系中进行其菌种鉴定、定量、毒力和耐药性分析。包括对菌种鉴定基因16S rRNA进行检测的引物,分别对毒力基因cagA、vacA-s1、vacA-s2、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS进行检测的引物,分别对耐药基因23S rRNA的2143位点、rdxA的148位点、pbp1A的1777位点和gyrA的261位点的进行多态性检测的引物,以及分别对幽门螺杆菌的拷贝数进行定量分析的基因ureC和ß-globin进行检测的引物；所述各引物的正向引物的5’端均设有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5’端均设有反向通用引物序列。所述检测体系进行PCR反应后进行毛细管电泳分析。
针对16S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对16S rRNA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对cagA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对cagA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对vacA-s1或vacA-s2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对vacA-s1或vacA-s2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对vacA-m1基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对vacA-m1基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对vacA-m2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对vacA-m2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对iceA1基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对iceA1基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
针对iceA2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对iceA2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
针对dupA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对dupA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
针对oipA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对oipA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
针对luxS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对luxS基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
针对23S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示，对应23S rRNA基因2143位点为碱基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，对应23S rRNA基因2143位点为碱基G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；
针对rdxA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示，对应rdxA基因148位点为碱基C的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示，对应rdxA基因148位点为碱基T的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
针对pbp1A基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示，对应pbp1A基因1777位点为碱基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.28所示，对应pbp1A基因1777位点为碱基G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.29所示；
针对gyrA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示，对应gyrA基因261位点为碱基C或T的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示，对应gyrA基因261位点为碱基G或A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.32所示；
针对ureC基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示，针对ureC基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示；
针对ß-globin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.35所示，以及针对ß- globin基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.36所示；
所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；
所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
针对16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS基因的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、oipA、luxS、和ß-globin基因的反向引物在检测体系中的终浓度均为100nM；针对dupA和ß-globin基因的正向引物在检测体系中的终浓度均为100nM；
针对23S rRNA基因的2143位点、rdxA基因的148位点、pbp1A基因的1777位点和gyrA基因的261位点的正向引物在检测体系中的终浓度均为100nM；对应23S rRNA基因2143位点为碱基A的反向引物在检测体系中的终浓度均为300nM；对应23S rRNA基因2143位点为碱基G的反向引物在检测体系中的终浓度均为350nM；对应rdxA基因148位点为碱基C、对应pbp1A基因1777位点为碱基A、对应gyrA基因261位点为碱基C或T的反向引物、对应rdxA基因148位点为碱基T、对应pbp1A基因1777位点为碱基G的反向引物在检测体系中的终浓度均为400nM；对应gyrA基因261位点为碱基G或A的反向引物在检测体系中的终浓度均为450nM。
上述幽门螺杆菌检测体系还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合酶、带荧光的通用标签混合物和DNA模板；所述带荧光的通用标签混合物中包括反向通用引物和带有荧光标记的正向通用引物。
上述荧光标记为CY5、CY3或FAM等。
上述幽门螺杆菌检测体系还包括阳性对照液和阴性对照液；所述阳性对照物是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照液是无核酸酶超纯水。
上述幽门螺杆菌检测体系反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，带荧光的通用标签混合物和2mmol/L的dNTPs共1体积，25mmol/L的MgCl2溶液2体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶1体积， DNA模板2体积，纯水2体积。
上述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述检测体系制备幽门螺杆菌检测和诊断产品的应用。
本发明为解决上述技术问题提出的又一种技术方案是：一种采用上述检测体系的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测试剂盒。
本发明具有积极的效果：
（1）本发明的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及试剂盒，采用了多对特异性引物和通用引物，将多重PCR扩增反应转化成单重反应，有效避免引物之间相互干扰，等效扩增所有目的基因。优化了反应体系，结合毛细管电泳及荧光检测技术，不同于传统凝胶电泳分析模式，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性。该试剂盒的检测结果无杂峰，特异性高。可检测低至10个拷贝的病原体，灵敏度高。
（2）不需要采用幽门螺杆菌常规的细菌培养等步骤，在同一反应体系直接对组织样本进行菌种鉴定和多种毒力分析，一次检测得出所有结果，弥补了常规检测方法通量低、耗时长和检出率低等缺点，第一时间为临床提供全面、精准、低成本的病原学依据，为幽门螺杆菌感染的精准诊断与鉴别诊断和疾病预后判断提供重要参考。
（3）幽门螺杆菌的16S rRNA基因具有高度的保守性，是用于菌种鉴定的基因。
（4）幽门螺杆菌致病的多样性与其感染量和产生的多种毒力因子密切相关。
ureC基因是单拷贝基因，结合人类基因ß-globin作为内参照，可实现定量分析，使得检测结果的准确性明显提高，监控感染量和治疗效果。
cagA、vacA-s1、vacA-s2、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS基因是用于判断细菌毒力的基因。其中，CagA蛋白是幽门螺杆菌的致病岛cagPAI上cagA基因的编码产物，是幽门螺杆菌感染导致宿主产生炎性反应的重要效应蛋白。vacA基因在所有幽门螺杆菌中存在，但仅有50%左右的幽门螺杆菌菌株有VacA蛋白胨表达。VacA对胃上皮细胞有直接的毒性作用，可造成胃黏膜的损伤和延缓胃上皮的修复。vacA基因结构中存在信号序列区（s区）和中间区（m区）。s区和m区以不同的形式组成vacA基因的5种嵌合体，即s1a/m1，s1a/m2，s1b/m1，s1b/m2，s2/m2。检测vacA-s1、vacA-s2、vacA-m1、vacA-m2基因的表达量，研究其分型对于判断幽门螺杆菌菌株的致病强弱具有重要意义。iceA基因主要有两种等位基因变异：iceA1和iceA2，iceA1基因表达意味着上调幽门螺杆菌与上皮细胞的接触，且与溃疡的发生密切相关。dupA基因与十二指肠球部溃疡的发生有关。oipA编码前炎性外膜蛋白A，与幽门螺杆菌感染后的临床症状、细菌的定植密度、严重的中性粒细胞浸润及较高浓度年末IL-8水平密切相关，且oipA基因信号区的开放状态与cagA、vacA、iceA的基因型的存在有关，对十二指肠溃疡及胃炎有一定指向性。luxS基因编码LuxS蛋白酶，是合成高度保守，能被不同中属细菌识别的信号分子AI-2的基础，组成幽门螺杆菌中革兰阳性和阴性细菌共同的LuxS/AI-2 QS系统。AI-2增加到一定宁都时与luxS蛋白特异性结合并激活转录，调节下游基因表达，与幽门螺杆菌特异性生物膜的形成高度相关，而生物膜的形成在一定程度上提高了其致病性和耐药性。对幽门螺杆菌感染量和毒力相关基因进行检测将为临床诊断、治疗和预防等提供重要参考。
（5）幽门螺杆菌临床治疗的常规药物包括克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和左氧氟沙星。但是其耐药现象日益严重并呈全球性，而且目前常规耐药性检测方法均存在耗时长和灵敏度低等缺点，极大地影响了临床疗效。幽门螺杆菌的23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的多态性与临床耐药密切相关。其中，23S rRNA基因用于判断对于克拉霉素（Clarithromycin）的耐药性。rdxA基因用于判断对于甲硝唑（Metronidazole）的耐药性。pbp1A基因用于判断对于阿莫西林（Amoxicillin）的耐药性。gyrA基因用于判断对于左氧氟沙星（Levofloxacin）的耐药性。对幽门螺杆菌耐药相关基因进行检测将为临床个体化治疗提供重要参考。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂盒对阳性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图2是本发明实施例1的试剂盒对阴性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图3是本发明实施例1的试剂盒对样本1进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图4是本发明实施例1的试剂盒对样本2进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图5是本发明实施例1的试剂盒对样本3进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
图6是本发明实施例1的试剂盒对样本4进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1
一、试剂盒的组成
本实施例的幽门螺杆菌检测试剂盒包括：引物混合物、PCR缓冲液（10×PCRBuffer）、MgCl2溶液、dNTPs、带荧光的通用标签混合物、热启动DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、阳性对照物和阴性对照物。2mmol/L 的dNTPs和带荧光的通用标签混合物混合在一起成为一管试剂。
PCR缓冲液、dNTPs和热启动DNA聚合酶均来自Takara公司（货号：R007A）。
阳性对照液是包括所有目的基因靶点的质粒混合物。
阴性对照液是无核酸酶超纯水。
引物混合物中包括针对16S rRNA基因的正向引物、针对16S rRNA基因的反向引物、针对cagA基因的正向引物、针对cagA基因的反向引物、针对vacA-s1或vacA-s2基因的正向引物、针对vacA-s1或vacA-s2基因的反向引物、针对vacA-m1基因的正向引物、针对vacA- m1基因的反向引物、针对vacA-m2基因的正向引物、针对vacA-m2基因的反向引物、针对iceA1基因的正向引物、针对iceA1基因的反向引物、针对iceA2基因的正向引物、针对iceA2基因的反向引物、针对dupA基因的正向引物、针对dupA基因的反向引物、针对oipA基因的正向引物、针对oipA基因的反向引物、针对luxS基因的正向引物、针对luxS基因的反向引物、针对23S rRNA基因的正向引物、对应23S rRNA基因2143位点为碱基A的反向引物、对应23S rRNA基因2143位点为碱基G的反向引物、针对rdxA基因的正向引物、对应rdxA基因148位点为碱基C的反向引物、对应rdxA基因148位点为碱基T的反向引物、针对pbp1A基因的正向引物、对应pbp1A基因1777位点为碱基A的反向引物、对应pbp1A基因1777位点为碱基G的反向引物、针对gyrA基因的正向引物、对应gyrA基因261位点为碱基C或T的反向引物、对应gyrA基因261位点为碱基G或A的反向引物、针对ureC基因的正向引物、针对ureC基因的反向引物、针对ß-globin基因的正向引物、针对ß-globin基因的反向引物。各引物的特征如表1所示。
表1 引物序列特征表
引物均由上海桑尼生物科技有限公司合成。其中，各正向引物的5’端均设有正向通用引物序列，各反向引物的5’端设有反向通用引物序列。
带荧光的通用标签混合物中包括适量的反向通用引物和带有荧光标记的正向通用引物，荧光标记为CY5（也可以是CY3或FAM等）。
正向通用引物的核苷酸序列为：TGCATGACACTCGAGACTAG，如SEQ ID No.37所示。
反向通用引物的核苷酸序列为：CATGACGACTCACTATACTA，如SEQ ID No.38所示。
二、试剂盒的使用方法
本实施例的幽门螺杆菌检测试剂盒的具体检测步骤如下：
1．样本采集
将幽门螺杆菌患者的胃粘膜活组织标本浸入生理盐水中，采用天根公司的细菌DNA抽提试剂盒提取样本DNA，具体的操作参见抽提试剂盒产品说明书。
获得样本DNA后，经紫外分光光度计测定浓度和OD260/OD280的比值控制样本DNA质量。样本DNA的优选浓度为10 ng/μL～100ng/μL。OD260/OD280的比值的优选范围为1.7～1.9。
2．PCR反应
采用本实施例的试剂盒中的试剂分别与DNA模板（样本DNA、阳性对照液或阴性对照液）配制PCR反应体系，具体组分如表2所示。
表2 PCR反应体系组分表
然后在PCR仪（ABI Veriti 96 well）上进行PCR反应程序，最优反应程序如表3所示。
表3 PCR反应程序表
3、毛细管电泳片段分析。
在96孔样品板的每个孔中加入38.5μL的甲酰胺（Sample Loading Solution， ABsciex公司，货号：608082）和0.5μL 的内标（DNA Size Standard Kit -400 Base Pairs，ABsciex公司，货号：608098），再将1μL的PCR产物加入其中，滴入一滴矿物质油，防止电泳过程中由于高温导致PCR产物挥发。
在另一个96孔缓冲液板的每个孔中加入约250μL的GenomeLab分离缓冲液。
根据毛细管电泳分析仪的操作手册，将样品板和缓冲液板放入机器，运行Frag-3分离程序。执行默认的分析方法，最后保存数据。
针对各个基因的PCR产物片段大小不同,得到的毛细管电泳峰图，其中横坐标表示片段长度，纵坐标表示荧光强度。
4．结果分析
毛细管电泳分析仪自动进行数据分析。
三、试剂盒的检测结果判定
1．试剂盒有效性判定
同时满足下列条件，才可进行结果判定：
1) 阴性对照：在138nt～327nt之间未检测到荧光信号。
2) 阳性对照：在各扩增片段长度处各检测到一个荧光信号，且荧光信号值高于2000。
2. 样本有效性判定：
在138nt～327nt之间：
1) 若检测样本的荧光信号值至少有一个高于200000，则样本加入过量，建议对PCR产物进行适当稀释后再进行毛细管电泳检测。
2) 若检测样本的荧光信号值均低于2000，则样本加入量较低，可适当增加PCR产物加入量或增加PCR反应循环数；若仍然不符合要求，需重新制备样本。
3. 结果判定标准
1）菌株鉴定
16S rRNA和ureC基因的目的片段区域出现了相应的峰且荧光信号值均高于2000，并且16S rRNA和ureC基因对应的特异性峰面积/ß-globin对应的特异性峰面积的比值大于0.1，可以判断感染了幽门螺杆菌。
2）毒力鉴定
cagA、vacA-s1、vacA-s2、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA、luxS基因的目的片段区域出现了相应的峰，荧光信号值均高于2000，并且各毒力基因对应的特异性峰面积/ß-globin对应的特异性峰面积的比值大于0.1，说明患者感染的幽门螺杆菌中含有该毒力基因表达。
3）耐药鉴定
（1）克拉霉素耐药性
当180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明23S rRNA基因2143位点为纯合野生型，当23S rRNA基因2143位点为纯合野生型，对克拉霉素无耐药性。当180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值为0.25～0.7时，定为弱阳性，当23S rRNA基因2143位点为弱阳性时，对克拉霉素有少量耐药性。当180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值为0.7～4时，说明23S rRNA基因2143位点为杂合突变型，当180nt处出现峰面积/175nt处出现峰面积的比值大于4时，说明23S rRNA基因2143位点为纯合突变型，当23S rRNA基因2143位点为纯合突变型或杂合突变型，对克拉霉素有耐药性。
（2）甲硝唑耐药性
当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明rdxA基因148位点为纯合野生型，当rdxA基因148位点为纯合野生型，对甲硝唑无耐药性。当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值为0.25～0.7时，定为弱阳性，当rdxA基因148位点为弱阳性时，对甲硝唑有少量耐药性。当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值为0.7～4时，说明rdxA基因148位点为杂合突变型，当257.6nt处出现峰面积/252.6nt处出现峰面积的比值大于4时，说明rdxA基因148位点为纯合突变型，当rdxA基因148位点为纯合突变型或杂合突变型，对克拉霉素有耐药性。
（3）阿莫西林耐药性
当158.9nt处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明pbp1A基因1777位点为纯合野生型，当pbp1A基因1777位点为纯合野生型，对阿莫西林无耐药性。当158.9nt处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值为0.25～0.7时，定为弱阳性。当pbp1A基因1777位点为弱阳性时，对阿莫西林有少量耐药性。当158.9nt处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值为0.7～4时，说明pbp1A基因1777位点为杂合突变型，当158.9nt处出现峰面积/153.8nt处出现峰面积的比值大于4时，说明pbp1A基因1777位点为纯合突变型，当pbp1A基因1777位点为纯合突变型或杂合突变型，对阿莫西林有耐药性。
（4）左氧氟沙星耐药性
当311nt处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比值小于0.25时，说明gyrA基因261位点为纯合野生型，当gyrA基因261位点为纯合野生型，对左氧氟沙星无耐药性。311nt处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比值为0.25～0.7时，定为弱阳性。当gyrA基因261位点为弱阳性时，对左氧氟沙星有少量耐药性。311nt处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比值为0.7～4时，说明gyrA基因261位点为杂合突变型，311nt处出现峰面积/306nt处出现峰面积的比值大于4时，说明gyrA基因261位点为纯合突变型，当gyrA基因261位点为纯合突变型或杂合突变型，对左氧氟沙星有耐药性。
4）定量分析
当ureC对应的特异性片段（138nt）处出现的峰面积/ß-globin对应的特异性片段（199nt）处出现峰面积的比值大于0.1，说明患者感染了幽门螺杆菌，比值与幽门螺杆菌的拷贝数成正比，比值越大，说明幽门螺杆菌感染越严重。当ureC对应的特异性片段（138nt）处出现的峰面积/ß-globin对应的特异性片段（199nt）处出现峰面积的比值小于0.02，判为感染阴性。当ureC对应的特异性片段（138nt）处出现的峰面积/ß-globin对应的特异性片段（199nt）处出现峰面积的比值为0.02～0.1时，需重新实验。
4．结果判断实例
采用本实施例的试剂盒对阳性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图1所示。16S rRNA、ureC、ß-globin、cagA、vacA-s1、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA、luxS、vacA-s2、23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。该结果非常直观，1个菌种鉴定基因、2个定量基因、10个毒力相关基因、4个耐药性基因均扩增良好。说明各引物之间没有干扰，能同时有效扩增所有目的基因。
采用本实施例的试剂盒对阴性对照进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图2所示，没有出现任何目的基因峰，只在小于100nt处有非特异性背景荧光信号。
采用本实施例的试剂盒对样本1进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图3所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m1、iceA1、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染了幽门螺杆菌，且表达相应毒力因子，对克拉霉素、左氧氟沙星有耐药性，对甲硝唑、阿莫西林没有耐药性。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒对样本2进行PCR反应后利用采用毛细管电泳分析后的图谱如图4所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m2、iceA2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染了幽门螺杆菌，且表达相应毒力因子，对克拉霉素、甲硝唑有耐药性，对阿莫西林、左氧氟沙星没有耐药性。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒对样本3进行PCR反应后采用毛细管电泳分析后的图谱如图5所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的目标片段区域均出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者感染了幽门螺杆菌，且表达相应毒力因子，对阿莫西林有耐药性，对克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星没有耐药性。检测结果非常直观。
采用本实施例的试剂盒对样本4进行PCR反应后利用采用毛细管电泳分析后的图谱如图6所示。16S rRNA、ureC、cagA、vacA-s1、vacA-m1、iceA2、oipA、luxS、23S rRNA、rdxA、pbp1A和gyrA基因的目标片段区域均没有出现相应的峰，但ß-globin基因的目标片段区域出现了相应的峰。根据结果判定标准，说明该患者没有感染幽门螺杆菌。检测结果非常直观。
实施例2
本实施例的幽门螺杆菌检测试剂盒与实施例1的其余部分相同，不同之处在于：引物混合物仅包括针对cagA基因的正向引物、针对cagA基因的反向引物、针对vacA-s1或vacA-s2基因的正向引物、针对vacA-s1 或vacA-s2基因的反向引物、针对vacA-m1基因的正向引物、针对vacA-m1基因的反向引物、针对vacA-m2基因的正向引物、针对vacA-m2基因的反向引物、针对iceA1基因的正向引物、针对iceA1基因的反向引物、针对iceA2基因的正向引物、针对iceA2基因的反向引物、针对dupA基因的正向引物、针对dupA基因的反向引物、针对oipA基因的正向引物、针对oipA基因的反向引物、针对luxS基因的正向引物、针对luxS基因的反向引物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式一一列举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东医院
<120> 幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系及其试剂盒和应用
<130> 无
<160> 38
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工合成
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
catgacgact cactatacta 20

Claims (8)

1.一种幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：包括对菌种鉴定基因16S rRNA进行检测的引物，以及分别对毒力基因cagA、vacA-s1、vacA-s2、vacA-m1、vacA- m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS进行检测的引物；所述各引物的正向引物的5’端均设有正向通用引物序列，所述各引物的反向引物的5’端均设有反向通用引物序列；
针对16S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，针对16S rRNA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
针对cagA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，针对cagA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
针对vacA-s1或vacA-s2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对vacA- s1或vacA-s2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
针对vacA-m1基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，针对vacA-m1基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
针对vacA-m2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，针对vacA-m2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
针对iceA1基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，针对iceA1基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
针对iceA2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，针对iceA2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
针对dupA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，针对dupA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
针对oipA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，针对oipA基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
针对luxS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示，针对luxS基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示；
所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：针对16S rRNA、cagA、vacA-s1、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、dupA、oipA和luxS基因的正向引物在检测体系中的终浓度均为200nM；针对16S rRNA、cagA、vacA-s1、vacA-m1、vacA-m2、iceA1、iceA2、oipA和luxS基因的反向引物在检测体系中的终浓度均为100nM；针对dupA基因的反向引物在检测体系中的终浓度为200nM。
3.根据权利要求1或2所述的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：还包括PCR缓冲液、MgCl2溶液、dNTPs、热启动DNA聚合酶、带荧光的通用标签混合物和DNA模板；所述带荧光的通用标签混合物中包括反向通用引物和带有荧光标记的正向通用引物。
4.根据权利要求3所述的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：所述荧光标记为CY5或CY3或FAM。
5.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：还包括阳性对照液和阴性对照液；所述阳性对照液是包括所有目的基因靶点的质粒混合物；所述阴性对照液是无核酸酶超纯水。
6.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测体系，其特征在于：反应时体系中的组分用量为10×的PCR缓冲液1体积，带荧光的通用标签混合物和2mmol/L的dNTPs共1体积，25mmol/L的MgCl2溶液2体积，引物混合物1体积，5U/μL的热启动DNA聚合酶1体积， DNA模板2体积，纯水2体积；所述DNA模板的使用量为5～50ng/体系。
7.一种采用如权利要求1所述的检测体系的幽门螺杆菌鉴定和毒力多重基因检测试剂盒。
8.一种采用如权利要求1所述的检测体系制备幽门螺杆菌的检测和诊断产品的应用。
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