CN112877408A - 一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法及试剂盒 - Google Patents

一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法及试剂盒 Download PDF

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CN112877408A CN202011600280.1A CN202011600280A CN112877408A CN 112877408 A CN112877408 A CN 112877408A CN 202011600280 A CN202011600280 A CN 202011600280A CN 112877408 A CN112877408 A CN 112877408A
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甘奇
孟萌
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Abstract

本发明创造提供了一种用环介导等温扩增检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法和试剂盒。通过查阅文献筛选了7种毒力基因类型进行检测，其中针对cagA、vacA s2、vacA m1、vacA m2、iceA1、iceA2、babA2、oipA、dupA、luxS设计了5条引物，针对vacA s1设计了6条引物进行检测。这种检测方法具有特异性强，操作简便，成本低，反应时间短的优点，不需要昂贵的反应仪器，可以在水浴锅或金属浴中完成反应，并且反应完成后无需电泳等后续检测手段，直接通过肉眼便能观察反应结果。本发明首次将幽门螺杆菌的毒力基因进行一系列完整的检测，针对不同的毒力基因设计出相应的LAMP引物并进行筛选。

Description

一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的 方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的试剂盒。
背景技术
幽门螺杆菌(H.pylori)是一种革兰氏阴性、弯曲的微嗜氧菌，在20世纪80年代早期由Warren 和Marshall在胃活检中首次发现，它主要分布在胃粘膜组织中，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。据统计，全世界的患病率达20％～80％，其中发达国家患病率为34.7％，发展中国家患病率为50.8％。Hp的感染与慢性胃炎、上消化道溃疡、胃黏膜化生等消化道疾病密切相关，被WHO 列入Ⅰ类致癌因子。
我国是幽门螺杆菌感染的高发国家(59％感染率)，针对幽门螺杆菌的研究至关重要。幽门螺旋杆菌感染率高，并且感染者能够发展成严重的肠胃疾病包括胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡，淋巴瘤，甚至胃癌等疾病。疾病结果的发病机理被认为是由宿主，环境和细菌毒力因子之间复杂的相互作用所介导的。幽门螺杆菌进入人体内的第一步是定植。幽门螺杆菌通过自身尿素酶的表达来提高周围微环境的pH值，其尾部鞭毛可提供动力，使得其可以快速穿过胃酸环境，并潜入环境较为中性的胃壁的深层黏膜层。然后，幽门螺杆菌通过外膜蛋白和黏附素在胃黏膜上建立永久性的定植，并利用宿主的黏膜保护使其成为自己的栖身之地，进而引起宿主的慢性炎症和组织损伤，最终可能导致人体的消化性溃疡和胃癌的发生。目前根据Hp菌株cagA和vacA及其相应蛋白表达的有无将Hp菌株分成两型:Ⅰ型,含cagA基因,可表达VacA毒素和CagA蛋白,此型为高毒力株；Ⅱ型,不含cagA基因,不表达VacA毒素和CagA蛋白,此型为低毒力株。Held等研究发现CagA阳性的患者患胃腺癌的危险是 CagA阴性的7.4倍,表明感染CagA是胃癌发生的危险因素之一，而iceA1、iceA2、babA2、oipA、dupA、 luxS基因的表达会对人的胃粘膜产生一定的损伤，会增加胃炎和胃溃疡等发生的概率。
日本学者Notomi于2000年在Nucleic Acids Res杂志上公开了环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification,缩写LAMP)，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV 等疾病的检测中，其针对靶基因的6个区域设计4种特异引物和环状引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，在60-65℃之间恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，相比于普通PCR，具有成本低，特异性高，灵敏性高，反应时间短，易于操作等优点。最重要的是，LAMP结果的检测很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，仅通过肉眼观察是否变色或者有无绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
发明内容
本发明提供了一种特异性检测幽门螺杆菌主要毒力基因的可视化检测方法及试剂盒。
为了检测幽门螺杆菌的主要毒力基因类型。本发明检测幽门螺杆菌的cagA、vacAs1、vacA s2、vacA m1、vacA m2、iceA1、iceA2、babA2、oipA、dupA、luxS等基因。所用引物如下：
1、检测cagA所用引物
cagA-F3:5’-TCTGCCAAACAATCTTTTGC-3’
cagA-B3:5’-TGGTTCTTGATTGATTGCTTC-3’
cagA-FIP:5’-TTCTGCTTCTTGCCTTTCTTTCAAGAATCATTATAGGGAATCAAATCCG-3’
cagA-BIP:5’-ATGGAGAGCCTACTGGTGGGTTTGACATCAGAAGATTGTTCT-3’
cagA-LF:5’-GCCCATGAACTTTTGATCCGT-3’
2、检测vacA s1所用引物
vacA-S1-F3:5’-CCTCTGGTTTCTCTTGCTT-3’
vacA-S1-B3:5’-TCTGGGGTTTTATTGGCT-3’
vavA-S1-FIP:5’-CACGGTTGTGAAAAAGGCGGTAGTAGGAGCGTTAGTCAGC-3’
vacA-S1-BIP:5’-CATTGTTGGGGGGATCGCTACTCTTCGGCTTGTTTGAGC-3’
vacA-S1-LB:5’-GGTCTCAGGGCTTCTTAGCT-3’
vacA-S1-LF:5’-ATGACTTTGTTGCGGTGT-3’
3、检测vacA s2所用引物
vacA-S2-F3:5’-CCTTAATCGTAAATGCAACAGAA-3’
vacA-S2-B3:5’-GACTCTCGCTGTGTATGG-3’
vacA-S2-FIP:5’-CGGTGTGTTTGTTGTATTTCCATTTATTTTCTAGTCTAAAGTCGCAC-3’
vacA-S2-BIP:5’-CAATCGCCCTATTATTTCTCTCGCTGATCATTTGGCGTGTTAGC-3’
vacA-S2-LB:5’-GGTGTTAATGGGCACCGAAC-3’
4、检测vacA m1所用引物
vacA-M1-F3:5’-AACTATCTGGTCCGAGGC-3’
vacA-M1-B3:5’-CCATTGGTACCTGTAGAAACA-3’
vacA-M1-FIP:5’-GGTCGCGCTGTCTATATCATTATTAAGTGGCAACCTTAAATGTAGG-3’
vacA-M1-BIP:5’-TACAAACCGCTCATCAAGATTAACAACCAATGATTTTCGCTTTCA-3’
vacA-M1-LB:5’-CAAGATCTCATTAAAAATACAG-3’
5、检测vacA m2所用引物
vacA-M2-F3:5’-TAGTGGATAGCGCGACTG-3’
vacA-M2-B3:5’-GTTGTTGTTATAAAGGGCTAGG-3’
vavA-M2-FIP:5’-CGCCCTTTCACTAAAACATGTTCTTTTACAAACCACTCATTAAGATCA-3’
vacA-M2-BIP:5’-GGAGTGCAAGGCGCTAGTTATTTGAATTGCTCTTGCAGAT-3’
vacA-M2-LB:5’-ATATTTCTGCAAGCAACACC-3’
6、检测iceA1所用引物
iceA1-F3:5’-CTTGAATGGCTATAATACCGAAT-3’
iceA1-B3:5’-ATCATCAAAAGTCTGTGTGTT-3’
iceA1-FIP:5’-CGCGCAACATTGTTGCTTATAGGTGTTTTTAACCAAAGTATCTGT-3’
iceA1-BIP:5’-GTGTGCGTGGCAACTCTGAAAGAAACTCTTGAATCATCCTTG-3’
iceA1-LB:5’-TAGAAGTGGATCATAAAGACGGCC-3’
7、检测iceA2所用引物
iceA2-F3:5’-GAGAATGGTATCCATAAGAGAAC-3’
iceA2-B3:5’-ACTGCTCATTAAAACACCG-3’
iceA2-FIP:5’-CTTTGATGTGGTTACAGCCACTACTTATGGTAGTAACGCTATTAATGTG-3’
iceA2-BIP:5’-AAGGACCTACTAGAAAATAGGGCACTAGAAAAACAGCGACACC-3’
iceA2-LB:5’-GCAAAAGCTTTGGCGCATT-3’
8、检测babA2所用引物
babA2-F3:5’-CGGAACGGTGAATGTAAGCT-3’
babA2-B3:5’-AGGCACACCGTCTAATTGG-3’
babA2-FIP:5’-GTCGTGGTTCCGCCATGTTGGTACACATGCTCAGGGGAAGG-3’
babA2-BIP:5’-CGGCAAAAGCGTAACCACCACAGACACGTTGGGTGTTACCT-3’
babA2-LF:5’-GTGGCTTTTTCCGAGCAGTT-3’
9、检测oipA所用引物
oipA-F3:5’-AAAAAAAGCATCAAGGCATG-3’
oipA-B3:5’-TCATCGCCATAGCGATCA-3’
oipA-FIP:5’-ACTTGCAAACCAAGTGCTACCTTAGAAAATCTTCAGGGCTTGT-3’
oipA-BIP:5’-ACAATCTCACCCCTTTCAATCAAGTTCATCATTATTCCAACGAACG-3’
oipA-LB:5’-CAAGAGTCGCACGATTTTTCAGT-3’
10、检测dupA所用引物
dupA-F3:5’-CAAAAGAACACAACAAACCTT-3’
dupA-B3:5’-GTAGATAATCACTTGAGAAAGGT-3’
dupA-FIP:5’-CGAGCGCGTTAGCGATATAGGGATGAAACTAAAGACTACATTATGC-3’
dupA-BIP:5’-CAAGCTAGAAAGATCAACGGAACACTCTTTGCTTTATCAATGCCTAA-3’
dupA-LB:5’-TTTGCATGGCGTTTCA-3’
11、检测luxS所用引物
luxS-F3:5’-CAACCCATAGGCGACCAATC-3’
luxS-B3:5’-ATGTGCGTATCGCTGATCG-3’
luxS-FIP:5’-GGACATGCCAAGCTTGCACTCTATTAGCATGGTTGCGGATGA-3’
luxS-BIP:5’-CTTTGTTGGGCTGCTTGAAGCGAAAAGGGCGTTAATGGGGAT-3’
luxS-LF：5’-TAGAGCATTTAGTCGCTGAGA-3’
具体的，进一步应用环介导等温扩增法利用上述引物组检测幽门螺杆菌的毒力基因类型，确定所检测的菌株是否为高毒力菌株。
所述扩增产物的检测步骤如下：
(1)配制LAMP体系：100μm的外引物F3和B3各0.1μl；100μm的内引物FIP和BIP各0.4μl；100μm 的环引物LF和LB各0.25μl；2x反应缓冲液12.5μl；Bst DNA酶1μl；模板DNA 2μl；荧光染料1μl，加去离子水补足至25μl。
(2)进行扩增反应：LAMP反应条件为63℃反应60min，然后85℃下灭活5min。
(3)判断结果：通过肉眼观察颜色变化或者利用荧光确定是否含有该毒力基因。
具体的，(1)中所述2x缓冲液包含以下组分：终浓度为40mM Tris-Hcl(PH 8.8)；终浓度为20Mm 的Kcl；终浓度为16mM的MgSO4；终浓度为20mM的(NH4)2SO4；0.2％的Tween 20；终浓度为1.6M 的Betaine；终浓度为2.8mM的dNTPs。
具体的，(1)中所述的荧光染料为钙黄绿素—氯化锰混合液。配制的具体方法如下：
1.1M氢氧化钠溶液的配制(配10mL)：
称取0.4g氢氧化钠固体，溶于10ml灭菌超纯水中，混匀。
2.6.5mM钙黄绿素的配制(50ml)：
称取0.162g钙黄绿素放在2ml离心管中，先加1.2ml 1M氢氧化钠助溶，25000rpm离心2分钟后转移至50ml离心管中，再加38.8ml已灭菌的超纯水，混匀，此时得到的溶液pH为8.0～8.5，并于超净台中用0.22μm滤膜过滤除菌，配制成浓度为6.5mM的钙黄绿素。
3.1.0ml荧光染料的配制：
取1个2ml离心管，先加入500μl已经灭菌的超纯水，再加入以上所述200μl钙黄绿素溶液，13μl二氯化锰，最后加287μl超纯水补齐至1.0ml。
具体的，(3)中所述的用肉眼判读颜色结果具体为：若反应产物为橙色透明液体，则表明该菌株不含此毒力基因；若反应产物为绿色浑浊的液体，则认为该菌株含有此毒力基因。
本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。
本发明为生物技术领域提供了一种快速检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法。
本发明提供了一种可视化检测幽门螺杆菌毒力基因的试剂盒，该试剂盒包括：以上所述引物组、2x反应缓冲液、Bst DNA酶、荧光染料、去离子水。
本发明有益效果包括：
(1)采用本发明检测方法可以检测幽门螺杆菌的主要毒力基因，在临床上有重要的指导意义。
(2)相比于其他的检测体系，此方法是在反应前加入荧光染料，一步到位，无需在反应结束后开盖，避免了因开盖造成的气溶胶污染。
(3)本试剂盒中所含荧光染料为钙黄绿素和二氯化锰混合溶液。环介导等温扩增在合成大量核酸的同时，还会产生大量的副产物焦磷酸离子。荧光染料中所含的钙黄绿素初始因与锰离子结合而处于荧光淬灭状态，但是随着环介导等温扩增反应的进行，因为被反应副产物焦磷酸离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离从而发出荧光，进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光得到进一步的增强。由于环介导等温扩增反应过程中涉及到多条引物，引物间很容易发生非特异性结合产生引物二聚体，使结果造成误判。基于荧光染料检测的原理是结合反应副产物焦磷酸离子而不是扩增产物DNA，故不会存在因引物二聚体引起的假阳性问题。
(4)本试剂盒反应结果易读，既可以通过目视来观察结果，阳性为绿色液体，阴性为橙色液体，还可以通过紫外照射判读结果，在紫外光的照射下，阳性会发出亮绿色的荧光，而阴性则无荧光产生。
(5)本发明判读结果的方式不仅包含目视和荧光，还可以通过使用实时定量荧光PCR仪收集每分钟的荧光信号，避免误差。
(6)扩增时不需要设置温度变化和循环，在水浴锅或者金属浴中即可完成反应，适用于在基层医院推广，具有很广阔的应用前景。
附图说明
图1为cagA基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图2为vacA s1基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图3为vacA s2基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图4为vacA m1基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图5为vacA m2基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图6为iceA1基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图7为iceA2基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图8为babA2基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图9为oipA基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图10为dupA基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图11为luxS基因LAMP引物退火位点以及扩增方向
图12为检测标准菌株43504毒力基因结果图
图13为检测标准菌株26695毒力基因结果图
图14为检测临床菌株毒力基因结果图
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的实施例做进一步的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
首先在NCBI网站上查找上述毒力基因的序列，用DNAMAN 8软件比对出目的基因的保守区，根据保守区，使用在线软件Primer Explorer v5设计出LAMP引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，
所得引物序列如下。
检测cagA所用引物
正向外引物F3:5’-TCTGCCAAACAATCTTTTGC-3’
反向外引物B3:5’-TGGTTCTTGATTGATTGCTTC-3’
正向内引物FIP:5’-TTCTGCTTCTTGCCTTTCTTTCAAGAATCATTATAGGGAATCAAATCCG-3’
反向内引物BIP:5’-ATGGAGAGCCTACTGGTGGGTTTGACATCAGAAGATTGTTCT-3’
正向环引物LF:5’-GCCCATGAACTTTTGATCCGT-3’
检测vacA s1所用引物
正向外引物F3:5’-CCTCTGGTTTCTCTTGCTT-3’
反向外引物B3:5’-TCTGGGGTTTTATTGGCT-3’
正向内引物FIP:5’-CACGGTTGTGAAAAAGGCGGTAGTAGGAGCGTTAGTCAGC-3’
反向内引物BIP:5’-CATTGTTGGGGGGATCGCTACTCTTCGGCTTGTTTGAGC-3’
正向环引物LF:5’-ATGACTTTGTTGCGGTGT-3’
反向环引物LB:5’-GGTCTCAGGGCTTCTTAGCT-3’
检测vacA s2所用引物
正向外引物F3:5’-CCTTAATCGTAAATGCAACAGAA-3’
反向外引物B3:5’-GACTCTCGCTGTGTATGG-3’
正向内引物FIP:5’-CGGTGTGTTTGTTGTATTTCCATTTATTTTCTAGTCTAAAGTCGCAC-3’
反向内引物BIP:5’-CAATCGCCCTATTATTTCTCTCGCTGATCATTTGGCGTGTTAGC-3’
反向环引物LB:5’-GGTGTTAATGGGCACCGAAC-3’
检测vacA m1所用引物
正向外引物F3:5’-AACTATCTGGTCCGAGGC-3’
反向外引物B3:5’-CCATTGGTACCTGTAGAAACA-3’
正向内引物FIP:5’-GGTCGCGCTGTCTATATCATTATTAAGTGGCAACCTTAAATGTAGG-3’
反向内引物BIP:5’-TACAAACCGCTCATCAAGATTAACAACCAATGATTTTCGCTTTCA-3’
反向环引物LB:5’-CAAGATCTCATTAAAAATACAG-3’
检测vacA m2所用引物
正向外引物F3:5’-TAGTGGATAGCGCGACTG-3’
反向外引物B3:5’-GTTGTTGTTATAAAGGGCTAGG-3’
正向内引物FIP:5’-CGCCCTTTCACTAAAACATGTTCTTTTACAAACCACTCATTAAGATCA-3’
反向内引物BIP:5’-GGAGTGCAAGGCGCTAGTTATTTGAATTGCTCTTGCAGAT-3’
反向环引物LB:5’-ATATTTCTGCAAGCAACACC-3’
检测iceA1所用引物
正向外引物F3:5’-CTTGAATGGCTATAATACCGAAT-3’
反向外引物B3:5’-ATCATCAAAAGTCTGTGTGTT-3’
正向内引物FIP:5’-CGCGCAACATTGTTGCTTATAGGTGTTTTTAACCAAAGTATCTGT-3’
反向内引物BIP:5’-GTGTGCGTGGCAACTCTGAAAGAAACTCTTGAATCATCCTTG-3’
反向环引物LB:5’-TAGAAGTGGATCATAAAGACGGCC-3’
检测iceA2所用引物
正向外引物F3:5’-GAGAATGGTATCCATAAGAGAAC-3’
反向外引物B3:5’-ACTGCTCATTAAAACACCG-3’
正向内引物FIP:5’-CTTTGATGTGGTTACAGCCACTACTTATGGTAGTAACGCTATTAATGTG-3’
反向内引物BIP:5’-AAGGACCTACTAGAAAATAGGGCACTAGAAAAACAGCGACACC-3’
反向环引物LB:5’-GCAAAAGCTTTGGCGCATT-3’
检测babA2所用引物
正向外引物F3:5’-CGGAACGGTGAATGTAAGCT-3’
反向外引物B3:5’-AGGCACACCGTCTAATTGG-3’
正向内引物FIP:5’-GTCGTGGTTCCGCCATGTTGGTACACATGCTCAGGGGAAGG-3’
反向内引物BIP:5’-CGGCAAAAGCGTAACCACCACAGACACGTTGGGTGTTACCT-3’
正向环引物LF:5’-GTGGCTTTTTCCGAGCAGTT-3’
检测oipA所用引物
正向外引物F3:5’-AAAAAAAGCATCAAGGCATG-3’
反向外引物B3:5’-TCATCGCCATAGCGATCA-3’
正向内引物FIP:5’-ACTTGCAAACCAAGTGCTACCTTAGAAAATCTTCAGGGCTTGT-3’
反向内引物BIP:5’-ACAATCTCACCCCTTTCAATCAAGTTCATCATTATTCCAACGAACG-3’
反向环引物LB:5’-CAAGAGTCGCACGATTTTTCAGT-3’
检测dupA所用引物
正向外引物F3:5’-CAAAAGAACACAACAAACCTT-3’
反向外引物B3:5’-GTAGATAATCACTTGAGAAAGGT-3’
正向内引物FIP:5’-CGAGCGCGTTAGCGATATAGGGATGAAACTAAAGACTACATTATGC-3’
反向内引物BIP:5’-CAAGCTAGAAAGATCAACGGAACACTCTTTGCTTTATCAATGCCTAA-3’
反向环引物LB:5’-TTTGCATGGCGTTTCA-3’
检测luxS所用引物
正向外引物F3:5’-CAACCCATAGGCGACCAATC-3’
反向外引物B3:5’-ATGTGCGTATCGCTGATCG-3’
正向内引物FIP:5’-GGACATGCCAAGCTTGCACTCTATTAGCATGGTTGCGGATGA-3’
反向内引物BIP:5’-CTTTGTTGGGCTGCTTGAAGCGAAAAGGGCGTTAATGGGGAT-3’
正向环引物LF：5’-TAGAGCATTTAGTCGCTGAGA-3’
反应体系(25μL)
成分 原液 用量 终浓度
2x缓冲液 12.5μL
F3 100μM 0.1μL 0.4μM
B3 100μM 0.1μL 0.4μM
FIP 100μM 0.4μL 1.6μM
BIP 100μM 0.4μL 1.6μM
LF 100μM 0.25μL 1.0μM
LB 100μM 0.25μL 1.0μM
Bst DNA酶 8000U/ml 1.0μL 0.32U/μL
荧光染料 1.0μL
核酸模板 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O 补充至25μL
2x反应缓冲液组成成分及浓度
Figure BDA0002870814270000061
荧光染料为钙黄绿素—氯化锰混合液。配制的具体方法如下：
1. 1M氢氧化钠溶液的配制(配10mL)：
称取0.4g氢氧化钠固体，溶于10ml灭菌超纯水中，混匀。
2. 6.5mM钙黄绿素的配制(50ml)：
称取0.162g钙黄绿素放在2ml离心管中，先加1.2ml 1M氢氧化钠助溶，25000rpm离心2分钟后转移至50ml 离心管中，再加38.8ml已灭菌的超纯水，混匀，此时得到的溶液PH为8.0～8.5，并于超净台中用0.22μm 滤膜过滤除菌，配制成浓度为6.5mM的钙黄绿素。
3. 1.0ml荧光染料的配制：
取1个2ml离心管，先加入500μl已经灭菌的超纯水，再加入以上所述200μl钙黄绿素溶液，13μl二氯化锰，最后加287μl超纯水补齐至1.0ml。
DNA提取步骤：
1、将幽门螺杆菌标准菌株和临床分离株在哥伦比亚培养基上接种，进行划线培养，两天之后，用接种环刮下，溶于PBS溶液中。
2、将细菌分装在1.5毫升的离心管中，12000rpm离心2min，弃上清。
3、加入180微升的Buffer GL、20微升的ProteinaseK、10微升的RNase A，用枪头充分吹打混匀，在56℃水浴温浴10min。
4、加入200微升的Buffer GB和200微升的无水乙醇，混匀。
5、将Spin Column放在Collection Tube上，溶液转移至Spin Column中，12000rpm离心2min，弃掉滤液。
6、向Spin Column中加入500微升的Buffer WA，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
7、向Spin Column中加入700微升的Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
8、又一次向Spin Column中加入700微升的Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉滤液。
9、将上述弃掉滤液之后的管再次12000rpm离心2min。
10、将Spin Column放在新的1.5毫升的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50微升的Elution buffer，室温静置5min。
11、12000rpm离心2min，洗脱DNA。离心下来的溶液即提取的DNA。
所述扩增产物的检测步骤如下：
配制LAMP体系：100μm的外引物F3和B3各0.1μl；100μm的内引物FIP和BIP各0.4μl；100μm的环引物LF和LB各0.25μl；2x反应缓冲液12.5μl；Bst DNA酶1μl；模板DNA 2μl；荧光染料1μl，加去离子水补足至25μl。
进行扩增反应：LAMP反应条件为63℃反应60min，然后85℃下灭活5min。
判断结果：通过肉眼观察颜色变化或者荧光确定是否含有该毒力基因。
图12表示了标准菌株43504的毒力基因类型，结果与文献中报道的类型一致。A图表明了各种基因在每分钟的荧光信号情况，结果表明标准菌株的毒力基因型为：cagA、vacAs1/m1、iceA2、babA2、oipA、 luxS。B图为目视结果，通过肉眼观察颜色的变化来确定是否含有该毒力基因。从1～12分别为cagA、vacA s1、vacA s2、vacA m1、vacA m2、iceA1、iceA2、babA2、oipA、dupA、luxS、阴性对照。结果判读标准：绿色液体为阳性，橙色液体为阴性。C图为在365nm紫外光照射下的结果。1～12与B图一致。结果判读标准：在紫外光的照射下，发出亮绿色的荧光为阳性，而无荧光产生的则为阴性。
图13表示了标准菌株26695的毒力基因类型。A图为目视结果，通过肉眼观察颜色的变化来确定是否含有该毒力基因。从1～12分别为cagA、vacA s1、vacA s2、vacA m1、vacAm2、iceA1、iceA2、babA2、 oipA、dupA、luxS、阴性对照。结果判读标准：绿色液体为阳性，橙色液体为阴性。B图为在365nm紫外光照射下的结果。1～12与A图一致。结果判读标准：在紫外光的照射下，发出亮绿色的荧光为阳性，而无荧光产生的则为阴性。如图所示，标准菌株26695的毒力基因类型为cagA、vacA s1/m1、iceA2、babA2、 oipA、luxS。
图14表示了检测临床分离株的毒力基因结果，A图为目视结果，通过肉眼观察颜色的变化来确定是否含有该毒力基因。从1～12分别为cagA、vacA s1、vacA s2、vacA m1、vacAm2、iceA1、iceA2、babA2、 oipA、dupA、luxS、阴性对照。结果判读标准：绿色液体为阳性，橙色液体为阴性。B图为在365nm紫外光照射下的结果。1～12与A图一致。结果判读标准：在紫外光的照射下，发出亮绿色的荧光为阳性，而无荧光产生的则为阴性。如图所示，临床分离株的毒力基因类型为vacA s1/m2、iceA1、oipA、dupA、luxS。
序列表
<110> 南开大学
<120> 一种使用环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型的方法及试剂盒
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 1
tctgccaaac aatcttttgc 20
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ttctgcttct tgcctttctt tcaagaatca ttatagggaa tcaaatccg 49
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gcccatgaac ttttgatccg t 21
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cggtgtgttt gttgtatttc catttatttt ctagtctaaa gtcgcac 47
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caatcgccct attatttctc tcgctgatca tttggcgtgt tagc 44
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ccattggtac ctgtagaaac a 21
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tacaaaccgc tcatcaagat taacaaccaa tgattttcgc tttca 45
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caagatctca ttaaaaatac ag 22
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gttgttgtta taaagggcta gg 22
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cgccctttca ctaaaacatg ttcttttaca aaccactcat taagatca 48
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ggagtgcaag gcgctagtta tttgaattgc tcttgcagat 40
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atatttctgc aagcaacacc 20
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cttgaatggc tataataccg aat 23
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<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
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cgcgcaacat tgttgcttat aggtgttttt aaccaaagta tctgt 45
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<212> DNA
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
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gtgtgcgtgg caactctgaa agaaactctt gaatcatcct tg 42
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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gtagataatc acttgagaaa ggt 23
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<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
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caagctagaa agatcaacgg aacactcttt gctttatcaa tgcctaa 47
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atgtgcgtat cgctgatcg 19
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ggacatgcca agcttgcact ctattagcat ggttgcggat ga 42
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ctttgttggg ctgcttgaag cgaaaagggc gttaatgggg at 42
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<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
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tagagcattt agtcgctgag a 21

Claims (12)

1.一种检测幽门螺杆菌毒力基因类型的检测方法，其特征在于，使用环介导等温扩增方法，提高了检测效率，时间短，且效率高。
2.如权利要求1所述，其特征在于，检测引物包括：
检测cagA所用引物
cagA-F3:5’-TCTGCCAAACAATCTTTTGC-3’
cagA-B3:5’-TGGTTCTTGATTGATTGCTTC-3’
cagA-FIP:5’-TTCTGCTTCTTGCCTTTCTTTCAAGAATCATTATAGGGAATCAAATCCG-3’
cagA-BIP:5’-ATGGAGAGCCTACTGGTGGGTTTGACATCAGAAGATTGTTCT-3’
cagA-LF:5’-GCCCATGAACTTTTGATCCGT-3’；
检测vacAs1所用引物
vacAs1-F3:5’-CCTCTGGTTTCTCTTGCTT-3’
vacAs1-B3:5’-TCTGGGGTTTTATTGGCT-3’
vavAs1-FIP:5’-CACGGTTGTGAAAAAGGCGGTAGTAGGAGCGTTAGTCAGC-3’
vacAs1-BIP:5’-CATTGTTGGGGGGATCGCTACTCTTCGGCTTGTTTGAGC-3’
vacAs1-LB:5’-GGTCTCAGGGCTTCTTAGCT-3’
vacAs1-LF:5’-ATGACTTTGTTGCGGTGT-3’；
检测vacAs2所用引物
vacAs2-F3:5’-CCTTAATCGTAAATGCAACAGAA-3’
vacAs2-B3:5’-GACTCTCGCTGTGTATGG-3’
vacAs2-FIP:5’-CGGTGTGTTTGTTGTATTTCCATTTATTTTCTAGTCTAAAGTCGCAC-3’
vacAs2-BIP:5’-CAATCGCCCTATTATTTCTCTCGCTGATCATTTGGCGTGTTAGC-3’
vacAs2-LB:5’-GGTGTTAATGGGCACCGAAC-3’；
检测vacAm1所用引物
vacAm1-F3:5’-AACTATCTGGTCCGAGGC-3’
vacAm1-B3:5’-CCATTGGTACCTGTAGAAACA-3’
vacAm1-FIP:5’-GGTCGCGCTGTCTATATCATTATTAAGTGGCAACCTTAAATGTAGG-3’
vacAm1-BIP:5’-TACAAACCGCTCATCAAGATTAACAACCAATGATTTTCGCTTTCA-3’
vacAm1-LB:5’-CAAGATCTCATTAAAAATACAG-3’；
检测vacAm2所用引物
vacAm2-F3:5’-TAGTGGATAGCGCGACTG-3’
vacAm2-B3:5’-GTTGTTGTTATAAAGGGCTAGG-3’
vavAm2-FIP:5’-CGCCCTTTCACTAAAACATGTTCTTTTACAAACCACTCATTAAGATCA-3’
vacAm2-BIP:5’-GGAGTGCAAGGCGCTAGTTATTTGAATTGCTCTTGCAGAT-3’
vacAm2-LB:5’-ATATTTCTGCAAGCAACACC-3’；
检测iceA1所用引物
iceA1-F3:5’-CTTGAATGGCTATAATACCGAAT-3’
iceA1-B3:5’-ATCATCAAAAGTCTGTGTGTT-3’
iceA1-FIP:5’-CGCGCAACATTGTTGCTTATAGGTGTTTTTAACCAAAGTATCTGT-3’
iceA1-BIP:5’-GTGTGCGTGGCAACTCTGAAAGAAACTCTTGAATCATCCTTG-3’
iceA1-LB:5’-TAGAAGTGGATCATAAAGACGGCC-3’；
检测iceA2所用引物
iceA2-F3:5’-GAGAATGGTATCCATAAGAGAAC-3’
iceA2-B3:5’-ACTGCTCATTAAAACACCG-3’
iceA2-FIP:5’-CTTTGATGTGGTTACAGCCACTACTTATGGTAGTAACGCTATTAATGTG-3’
iceA2-BIP:5’-AAGGACCTACTAGAAAATAGGGCACTAGAAAAACAGCGACACC-3’
iceA2-LB:5’-GCAAAAGCTTTGGCGCATT-3’；
检测babA2所用引物
babA2-F3:5’-CGGAACGGTGAATGTAAGCT-3’
babA2-B3:5’-AGGCACACCGTCTAATTGG-3’
babA2-FIP:5’-GTCGTGGTTCCGCCATGTTGGTACACATGCTCAGGGGAAGG-3’
babA2-BIP:5’-CGGCAAAAGCGTAACCACCACAGACACGTTGGGTGTTACCT-3’
babA2-LF:5’-GTGGCTTTTTCCGAGCAGTT-3’；
检测oipA所用引物
oipA-F3:5’-AAAAAAAGCATCAAGGCATG-3’
oipA-B3:5’-TCATCGCCATAGCGATCA-3’
oipA-FIP:5’-ACTTGCAAACCAAGTGCTACCTTAGAAAATCTTCAGGGCTTGT-3’
oipA-BIP:5’-ACAATCTCACCCCTTTCAATCAAGTTCATCATTATTCCAACGAACG-3’
oipA-LB:5’-CAAGAGTCGCACGATTTTTCAGT-3’；
检测dupA所用引物
dupA-F3:5’-CAAAAGAACACAACAAACCTT-3’
dupA-B3:5’-GTAGATAATCACTTGAGAAAGGT-3’
dupA-FIP:5’-CGAGCGCGTTAGCGATATAGGGATGAAACTAAAGACTACATTATGC-3’
dupA-BIP:5’-CAAGCTAGAAAGATCAACGGAACACTCTTTGCTTTATCAATGCCTAA-3’
dupA-LB:5’-TTTGCATGGCGTTTCA-3’；
检测luxS所用引物
luxS-F3:5’-CAACCCATAGGCGACCAATC-3’
luxS-B3:5’-ATGTGCGTATCGCTGATCG-3’
luxS-FIP:5’-GGACATGCCAAGCTTGCACTCTATTAGCATGGTTGCGGATGA-3’
luxS-BIP:5’-CTTTGTTGGGCTGCTTGAAGCGAAAAGGGCGTTAATGGGGAT-3’
luxS-LF：5’-TAGAGCATTTAGTCGCTGAGA-3’。
3.如权利要求2所述引物组在基于环介导等温扩增法检测幽门螺杆菌毒力基因类型中的应用。
4.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
配制LAMP体系：100μm的外引物F3和B3各0.1μl；100μm的内引物FIP和BIP各0.4μl；100μm的环引物LF和LB各0.25μl；2x反应缓冲液12.5μl；Bst DNA酶1μl；模板DNA 2μl；荧光染料1μl，加去离子水补足至25μl。
5.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，LAMP反应条件为63℃反应60min，然后85℃下灭活5min。
6.如权利要求1所述检测方法，其特征在于，通过肉眼观察颜色变化或者荧光确定是否含有该毒力基因。
7.一种检测幽门螺杆菌毒力基因类型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求2中所述引物组、2x反应缓冲液、Bst DNA酶、荧光染料、去离子水。
8.如权利要求7中所述试剂盒，其特征在于，2x缓冲液包含以下组分：终浓度为40mMTris-Hcl(pH 8.8)；
终浓度为20Mm的Kcl；终浓度为16mM的MgSO4；终浓度为20mM的(NH4)2SO4；0.2％的Tween20；终浓度为1.6M的Betaine；终浓度为2.8mM的dNTPs。
9.如权利要求7中所述试剂盒，其特征在于，所述荧光染料是指钙黄绿素—氯化锰混合液。配制的具体方法如下：
首先，配制1M氢氧化钠溶液(配10mL)：称取0.4g氢氧化钠固体，溶于10ml灭菌超纯水中，混匀。
其次，配制6.5mM钙黄绿素(50ml)：称取0.162g钙黄绿素放在2ml离心管中，先加1.2ml1M氢氧化钠助溶，25000rpm离心2分钟后转移至50ml离心管中，再加38.8ml已灭菌的超纯水，混匀，此时得到的溶液pH为8.0～8.5，并于超净台中用0.22μm滤膜过滤除菌，配制成浓度为6.5mM的钙黄绿素。
最后，配制1.0ml荧光染料：取1个2ml离心管，先加入500μl已经灭菌的超纯水，再加入以上所述200μl钙黄绿素溶液，13μl二氯化锰，最后加287μl超纯水补齐至1.0ml。
10.如权利要求7中所述试剂盒，其特征在于，用肉眼判读颜色结果具体为：若反应产物为橙色透明液体，则表明该菌株不含此毒力基因；若反应产物为绿色浑浊的液体，则认为该菌株含有此毒力基因。
11.如权利要求7中所述试剂盒，其特征在于，(用荧光判读颜色结果具体为：在365nm紫外光的照射下，发出亮绿色的荧光为阳性，表明该菌株含有此毒力基因；而无荧光产生的则为阴性，表明该菌株不含此毒力基因。
12.权利要求7-11任一项所述试剂盒，应用于检测幽门螺杆菌毒力基因类型。
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