CN114807401A - 基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用 - Google Patents

基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RPA‑LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用。本发明提供用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。基于所述组合物，本发明还提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法。该方法通过RPA扩增与CRISPR‑Cas12a系统的结合，获得了检测下限为2.7拷贝/μL的灵敏度以及更强的特异性，并且能在1h内检出样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，无需借助大型仪器设备，有助于类鼻疽的快速诊断和筛查。

Description

基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及其应用。
背景技术
类鼻疽(Melioidosis)是由类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,Bp)经呼吸道气溶胶或皮肤破溃接触等途径感染所致的疾病，其自然疫源地为我国海南与东南沿海等亚热带地区。随着近年来人口流动增加，非自然疫源地也相继发生输入性病例。目前BP感染尚无有效治疗方案，无疫苗防护；Bp易获取、易传播、耐药广，被列入国际“生物武器公约”核查清单、美国CDC I类生物恐怖剂；感染临床表现“隐匿”或“似百样病”。若不及时治疗，极易发展为脏器脓肿甚至败血症，临床死亡率10％～60％。因此，针对类鼻疽的快速诊断极为重要。
目前类鼻疽的实验室诊断方法主要包括：细菌分离培养、血清学检测、蛋白质组学分析以及分子生物学方法等。分离培养虽然是感染诊断的金标准，但是耗费周期长，易错过最佳诊疗时机，并且在没有相关经验时容易误鉴定为污染或同种属的其他细菌，导致错误治疗，延误患者病情；血清学检测由于窗口期以及疫区人群背景干扰(海南当地人群血清抗体阳性率6％～20％)，极易造成血清学检测假阴性或假阳性结果；基于蛋白质组学分析的细菌质谱鉴定对细菌样本的浓度和纯度有所要求，且由于地域差异和数据库更新滞后等原因导致某些菌种的检测结果不稳定；目前已报道的分子生物学方法主要是基于PCR方法以及Lamp(环介导的等温扩增)，检测靶基因包括16s rRNA以及III型和VI型分泌系统基因簇等，类鼻疽伯克霍尔德菌与泰国伯克霍尔德菌和鼻疽伯克霍尔德菌的16s rRNA序列差异较小，极易导致鉴定错误；PCR方法在仪器条件、人员操作等方面要求较高，不适用于床旁快速诊断(野外快速检测)；并且Lamp方法容易形成气溶胶污染，导致假阳性结果。因此，亟需提供一种快速、灵敏、特异的类鼻疽检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，以满足对类鼻疽伯克霍尔德菌感染进行快速、准确诊断的需求，能有效避免漏检和误检。
本发明提供的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，其特征在于，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。
所述ssDNA荧光探针的序列可以是TTATT，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记BHQ1淬灭基团。
所述组合物还可以包括重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)反应体系所需的通用试剂和/或CRISPR-Cas12a切割体系所需的通用试剂。
任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，包括任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物。
任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物或所述的试剂盒在类鼻疽伯克霍尔德菌检测中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品的基因组DNA；
S2.以待测样品的基因组DNA为模板，利用上述RPA引物进行重组酶聚合酶恒温扩增反应，得到RPA产物；
S3.将上述crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针与步骤S2得到的RPA产物混合后进行CRISPR-Cas12a切割反应，得到酶切产物；
S4.对步骤S3得到的酶切产物进行荧光信号检测；若酶切产物产生荧光，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若酶切产物无荧光产生，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。
所述荧光信号检测的方法可以是如下a)或b)：
a)将所述酶切产物置于LED蓝光下，裸眼观察酶切产物是否有荧光产生；
b)将所述酶切产物置于荧光定量仪中检测荧光强度；若相对荧光单位高于659，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若相对荧光单位低于659，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。
所述重组酶聚合酶恒温扩增反应的体系和条件可以是：Rehydration Buffer29.5μL，基因组DNA 5μL，10μM RPA正反向引物各2.4μL，RNase free H2O 8.2μL，混匀后加入280mM MgOAc 2.5μL启动反应，于39℃反应20min。
所述CRISPR-Cas12a切割反应的体系和条件可以是：RNase free H2O 5.2μL，10×DNase I Reaction Buffer 2μL，1.34μg/μL LbCas12a 1μL，1.67μg/μL crRNA 0.8μL，10μMssDNA荧光探针1μL，RPA产物10μL，混匀后置于37℃反应30min。
本发明提供的组合物包含类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性RPA引物和crRNA。基于该组合物检测类鼻疽伯克霍尔德菌的原理为：利用特异性RPA引物对病原菌基因组DNA样本进行RPA扩增(重组酶聚合酶恒温扩增)，获得RPA产物；然后在crRNA引导下进行LbCas12a蛋白酶对RPA产物的特异识别与顺式切割，同时激发对反应体系中ssDNA荧光探针的非特异反式切割，从而产生荧光可视信号。
本发明的方法通过RPA扩增与LbCas12a的持续性反式切割，能够检测到浓度低至2.7拷贝/μL的类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA。通过RPA引物与crRNA的双重识别，大大提高了类鼻疽伯克霍尔德菌检测的特异性。采用本发明的方法检测伯克霍尔德菌属的其它菌种(泰国伯克霍尔德菌、洋葱伯克霍尔德菌)、金黄色葡萄球菌以及鲍曼不动杆菌，结果均为阴性。通过反应条件的优化，本发明的方法能在1h内快速检出样本中是否含有类鼻疽伯克霍尔德菌，不需要借助大型仪器设备，有助于类鼻疽的快速诊断和筛查。
附图说明
图1为类鼻疽伯克霍尔德菌可视化检测流程图。
图2为LbCas12a蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果。图中左侧泳道为蛋白分子量标准，右侧泳道为纯化的LbCas12a蛋白。
图3为不同RPA引物的重组酶聚合酶扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。图中的泳道从左到右依次为DNA分子量标准、Bp-p3-F/Bp-p3-R引物的扩增产物、Bp-p2-F/Bp-p2-R引物的扩增产物、Bp-p1-F/Bp-p1-R引物的扩增产物。DNA分子量标准从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp。
图4为不同的RPA产物与crRNA组合的RPA-LbCas12a反应的荧光信号检测结果。横坐标为RPA-LbCas12a反应时间(min)，纵坐标为相对荧光单位(RFU)。Bp-p3-crRNA1表示Bp-p3-F/Bp-p3-R引物扩增的RPA产物与Bp-crRNA1的组合；Bp-p3-crRNA2表示Bp-p3-F/Bp-p3-R引物扩增的RPA产物与Bp-crRNA2的组合；依此类推。
图5为类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的灵敏度评价实验结果。横坐标为RPA-LbCas12a反应时间(min)，纵坐标为相对荧光单位(RFU)。1.35-270000拷贝/μL表示核酸标本中类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组DNA浓度。
图6为类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的特异性评价实验结果。横坐标为RPA-LbCas12a反应时间(min)，纵坐标为相对荧光单位(RFU)。Bp表示类鼻疽伯克霍尔德菌，Bt表示泰国伯克霍尔德菌，Bc表示洋葱伯克霍尔德菌，“金葡”表示金黄色葡萄球菌，“鲍曼”表示鲍曼不动杆菌，阴性对照为正常血液基因组DNA。
图7为类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的ROC曲线。
图8为类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a反应产物在LED蓝光下的可视化检测结果。“阴性”表示阴性对照，“空白”表示空白对照，2.7-270000拷贝/μL表示样品中类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组DNA浓度。
图9为类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a反应产物在实时荧光定量PCR仪中的荧光强度检测结果。横坐标为RPA-LbCas12a反应时间(min)，纵坐标为相对荧光单位(RFU)。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得；使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
以下实施例中使用的类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)是文献(Yao Fang,et al.2012.First Genome Sequence of a Burkholderia pseudomalleiIsolate in China,Strain BPC006,Obtained from a Melioidosis Patient inHainan.Journal of Bacteriology.194(23):6604-6605.)中记载的BPC006菌株，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
以下实施例中使用的泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis,BT)为ATCC700388菌株，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
以下实施例中使用的洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,BC)为ATCC25416菌株，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
以下实施例中使用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为ATCC25923菌株，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
以下实施例中使用的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为ATCC19606菌株，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
以下实施例中使用的LbCas12a表达质粒(PUC57-ZB011)的大肠杆菌(BL21 DE3)购买自南京迈西可生物科技有限公司。
主要试剂与耗材：
Quick DNA/RNA Pathogen miniprep Kit：ZYMO RESEARCH公司，货号R1042。HumanDNA Quantitation Standard：NIST，货号SRM2372a。TwistAmp Basic试剂盒：TwistDx公司，货号TABAS03KIT。T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System：Promega公司，货号P1320。RNA Clean&Concentrator Kits：ZYMO RESEARCH，货号R1015。DNase IReaction Buffer：NEB公司，货号B0303S。NEB buffer：NEB公司，货号B7203S。
实施例1、类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的建立
1、靶标序列的选定
通过分析，我们选定类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株1号染色体(GenBank:CP003781.1)上2381740-2382182bp的核苷酸序列作为类鼻疽伯克霍尔德菌基因检测的靶序列，如SEQ ID NO:10所示。
类鼻疽伯克霍尔德菌基因检测的靶序列(443bp)：
GGGACGCATACACTACCAGATTTGATAGTTTCGTCCTTTCAAAATCTAGACTCTAATAAACTCGCACACTTTTCCCATCACATCGATGGCGATTAACCAATAAATCCAGTGGAGTTAAAAATGGGCAAAGCGAATACCATCGAGCTCACAAACAACACATCATTTACTCTCGTCCTGCATACGATATACGCCAACACGGGCAATTGGTCCGGCGATTATCCGCCGGCCTATTTACGGCCGAACGATACGCTTATTTTTACGAGTACGCTTGATGGAAAAGGAGATCTAAACGGCTCAGCCCGTTTCGACATCCTTGATACAGCGGTCAAGAGATGTCCGGACGCGACCTACGTACAGCTCAACTGGGACAATCCCGTCGGAGCGGACAATGGGGGATCCTCGTCCGTAGTCGGCGCCACAGCACAGTTCTTCAACGTAAGTGG(SEQID NO:10)。
2、RPA引物和crRNA的设计
针对选定的靶序列(SEQ ID NO:10)，我们设计得到多对理论可行的RPA引物和crRNA，经实验验证大部分效果不佳，部分可用的序列如表1和表2所示。
表1候选的RPA引物
Figure BDA0003653471450000051
Figure BDA0003653471450000061
表2候选的crRNA的转录模板
Figure BDA0003653471450000062
备注：crRNA的转录模板序列中，下划线部分为结合LbCas12a蛋白的锚定序列与转录启动子序列，其余部分为向导序列，与RPA扩增产物的碱基互补结合。
通用报告探针(ssDNA)：5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。5’端的FAM为荧光报告基团，3’端的BHQ1为淬灭基团。
委托上海生工生物有限公司合成表1中的RPA引物、表2中的crRNA的转录模板以及上述通用报告探针(ssDNA)。
3、细菌基因组DNA的制备及定量检测
供试细菌：类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株。
采用Quick DNA/RNA Pathogen miniprep Kit(Zymo，R1042)按照试剂盒说明书提取供试细菌的基因组DNA。合成含BPC006靶序列基因的阳性质粒标准品(PUC57-BP-G14-3)，利用国际标准品Human DNA Quantitation Standard(NIST，SRM 2372a)以及PUC57-GAPDH质粒对阳性标准品进行定量。
将类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株的基因组DNA进行梯度稀释，稀释10倍数标记为Bp10-1,依次类推，利用实时荧光定量PCR方法对类鼻疽伯克霍尔德菌的各稀释浓度的基因组DNA进行核酸定量。荧光定量PCR体系(25μL)：10×PCR反应缓冲液(Takara，9151AM)2.5μL，MgCl2溶液3μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，引物及探针混合液7.5μL，待测样本5μL，dUTP(100mM)0.0625μL，dTTP(100mM)0.0625μL，dATP(100mM)0.125μL，dGTP(100mM)0.125μL，dCTP(100mM)0.125μL，DEPC水6.3μL。所述引物及探针混合液为：上游引物(100μM)2.5μL，下游引物(100μM)2.5μL，探针(100μM)5μL，DEPC水365μL。荧光定量PCR程序：37℃处理10分钟；95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，58.3℃退火40秒，进行40个循环。每个循环后收集荧光信号，完成PCR扩增反应及荧光信号收集后分析数据。
荧光定量PCR上游引物序列(5’-3’)：CGCTCACAGTTCCTTTCCC(SEQ ID NO:11)；
荧光定量PCR下游引物序列(5’-3’)：AGTGCAGTTCTTCGCTTGG(SEQ ID NO:12)；
荧光定量PCR探针序列(5’-3’)：GAGATCGGAGGCTTGATAG(SEQ ID NO:13)。
类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组DNA核酸定量实验结果如表3所示，标准曲线计算公式为：CT值＝-3.3797Log(拷贝)+37.593，R2＝0.9962，扩增效率E范围90％～110％。
表3类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA核酸定量实验结果
Figure BDA0003653471450000071
4、LbCas12a蛋白的表达与纯化
将含有LbCas12a表达质粒(PUC57-ZB011)的大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养基(卡那霉素终浓度为50μg/μL)中过夜培养，再按1:100的体积比将过夜培养得到的菌液接种于1L新的LB培养基中，培养至OD600＝0.5-0.6，然后加入0.5M的IPTG 400μL，诱导培养20h。对诱导培养后的菌体进行超声破碎并离心获取上清液。通过Ni柱(GE Healthcare)纯化出上清液中的LbCas12a蛋白，使用超滤管浓缩后，将蛋白定量分装并冻存于-80℃冰箱中。通过SDS-PAGE检测纯化的LbCas12a蛋白。结果如图2所示，在170kD处可见LbCas12a蛋白条带。
5、RPA引物对与crRNA的筛选
(1)RPA产物的制备
配制浓度为10μM的RPA引物(Bp-p1-F、Bp-p1-R、Bp-p2-F、Bp-p2-R、Bp-p3-F、Bp-p3-R)溶液。将类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA溶液稀释103倍后作为模板DNA，以ddH2O代替模板DNA作为阴性对照，采用TwistAmp Basic试剂盒(TwistDx，TABAS03KIT)按照试剂盒说明书进行RPA扩增反应。首先配制如下47.5μL预混液：Primer Free Rehydrationbuffer29.5μL，正反向引物(10μM)各2.4μL，RNase free ddH2O 8.2μL，模板DNA 5μL。将预混液在PCR管中混合均匀，然后吸取2.5μL 280mM醋酸镁溶液(MgOAc)于PCR管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速置于39℃进行RPA反应，于39℃反应20min。反应结束后对产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增情况。
结果如图3所示，引物对Bp-p1-F/Bp-p1-R、Bp-p2-F/Bp-p2-R、Bp-p3-F/Bp-p3-R能分别扩增出大小为369bp、382bp、443bp的条带，将三种RPA产物用于RPA-LbCas12a反应。
(2)crRNA的制备
将1μL Bp-crRNA1的转录模板(10μM)和1.5μL Bp-crRNA的转录模板(10μM)混合，配制成退火反应体系。将1μL Bp-crRNA2的转录模板(10μM)和1.5μL Bp-crRNA的转录模板(10μM)混合，配制成退火反应体系。将退火反应体系放入PCR仪中，95℃预热2min；随后缓慢降温至25℃，降温速度为0.1℃/s。得到线性DNA模板。
使用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System(Promega，P1320)按照产品说明书配制体外转录反应体系：Ribomax express T7 2×buffer 10μL，线性DNA模板2.5μL，Enzyme mix T7 express 2μL，Nuclese-free water补至20μL。将体外转录反应体系置于37℃反应30min，得到体外转录反应液。然后配制以下混合液：NEB buffer(B7203S)5μL，DNase I 4μL，体外转录反应液20μL，DEPC-treated water至100μL。将混合液置于37℃反应20-30min，然后吸取1μL 0.5M EDTA加入混合液中，混合离心后75℃反应10min。使用RNA Clean&Concentrator Kits(ZYMO RESEARCH，R1015)按照产品说明书对混合液中的crRNA进行纯化，得到纯化的Bp-crRNA1和Bp-crRNA2，定量后储存于-80℃备用。
(3)RPA-LbCas12a反应
将制备的三种RPA产物分别作为切割底物，与Bp-crRNA1或Bp-crRNA2进行组合，配制RPA-LbCas12a反应体系(20μL)：RPA产物10μL，crRNA(1.67μg/μL)0.2μL，DNase IReaction Buffer(NEB，B0303S)2μL，LbCas12a(1.34μg/μL)1μL，报告探针ssDNA(10μM)1μL，RNase free ddH2O补至20μL。振荡混匀后瞬时离心，置于Bio-Rad CFX 96实时荧光定量PCR仪中，于37℃反应30min，检测荧光信号强度(RFU)。阴性对照用基因组提取试剂盒QuickDNA/RNA Pathogen miniprep Kit的洗脱液作为RPA反应模板制备RPA产物，然后与crRNA进行RPA-LbCas12a反应。
结果如图4所示，Bp-p3-F/Bp-p3-R引物对的RPA产物与Bp-crRNA1组合进行RPA-LbCas12a反应的荧光信号值高于其它组合。因此，优选Bp-p3-F/Bp-p3-R作为RPA扩增反应的引物对，Bp-crRNA1作为RPA-LbCas12a反应的crRNA。
6、RPA-LbCas12a反应体系的优化
配置如下RPA-LbCas12a反应体系：Bp-p3-F/Bp-p3-R引物对的RPA产物1-10μL，Bp-crRNA1(1.67μg/μL)0.1-1μL，DNase I Reaction Buffer(NEB，B0303S)2μL，LbCas12a(1.34μg/μL)0.5-3μL，报告探针ssDNA(10μM)1μL，RNase free ddH2O补至20μL。将反应体系振荡混匀后瞬时离心，置于Bio-Rad CFX 96实时荧光定量PCR仪中，于37℃反应30min，检测荧光信号强度(RFU)。根据荧光信号检测结果优化RPA-LbCas12a反应体系中RPA产物、Bp-crRNA1和LbCas12a蛋白的反应浓度。
结果如表4-6所示。由表4可知反应体系中的LbCas12a蛋白浓度在67ng/μL或134ng/μL以及PRA产物用量为6μL或10μL时反应体系荧光信号值呈阳性且高于其他组；由表5可知当反应体系中的Bp-crRNA1浓度在67ng/μL，RPA产物用量在10μL时反应体系荧光信号值呈阳性且高于其他组；由表6可知当反应体系中的LbCas12a蛋白浓度在67ng/μL，Bp-crRNA1浓度在67ng/μL时反应体系荧光信号值呈阳性且高于其他组。经过综合分析得出，最佳反应体系中的LbCas12a蛋白浓度为67ng/μL，Bp-crRNA1浓度为67ng/μL，RPA产物用量为10μL。
表4 LbCas12a蛋白和RPA产物在反应体系中的浓度优化实验结果
Figure BDA0003653471450000091
注：LbCas12a蛋白溶液的原始浓度为1.34μg/μL。表中的LbCas12a蛋白浓度为LbCas12a蛋白在反应体系中的终浓度，括号中是反应体系中加入的原溶液体积。
表5 Bp-crRNA1和RPA产物在反应体系中的浓度优化实验结果
Figure BDA0003653471450000092
注：Bp-crRNA1溶液的原始浓度为1.675μg/μL。表中的Bp-crRNA1浓度为Bp-crRNA1在反应体系中的终浓度，括号中是反应体系中加入的原溶液体积。
表6 LbCas12a蛋白和Bp-crRNA1在反应体系中的浓度优化实验结果
Figure BDA0003653471450000101
注：LbCas12a蛋白溶液的原始浓度为1.34μg/μL，Bp-crRNA1溶液的原始浓度为1.675μg/μL。表中的LbCas12a蛋白浓度和Bp-crRNA1浓度分别为LbCas12a蛋白和Bp-crRNA1在反应体系中的终浓度，括号中是反应体系中加入的原溶液体积。
7、RPA反应时间和反应温度的优化实验
将类鼻疽伯克霍尔德菌基因组DNA稀释103倍后作为模板DNA，以ddH2O代替模板DNA作为阴性对照，采用TwistAmp Basic试剂盒(TwistDx，TABAS03KIT)按照试剂盒说明书进行RPA扩增反应。首先配制如下47.5μL预混液：Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，Bp-p3-F/Bp-p3-R引物(10μM)各2.4μL，RNase free ddH2O 8.2μL，模板DNA 5μL。然后将预混液在PCR管中混合均匀，吸取2.5μL 280mM醋酸镁溶液(MgOAc)于PCR管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速放于不同的反应温度(37℃或39℃)下进行不同时间(20-40min)的反应，得到的RPA产物用于CRISPR-Cas12a检测。配制如下RPA-LbCas12a反应体系：不同反应温度和反应时间的RPA产物10μL，Bp-crRNA1(1.67μg/μL)0.8μL，DNase I Reaction Buffer(NEB，B0303S)2μL，LbCas12a(1.34μg/μL)1μL，报告探针ssDNA(10μM)1μL，RNase free ddH2O补至20μL。将反应体系振荡混匀后瞬时离心，置于Bio-Rad CFX 96实时荧光定量PCR仪中，于37℃反应30min，检测荧光信号强度(RFU)。
实验结果如表7所示，将RPA反应体系置于39℃反应20min所得到的RPA产物的RPA-LbCas12a反应的荧光信号最强，故选择39℃反应20min为RPA反应的最优条件。
表7 RPA反应时间与反应温度的优化实验结果
Figure BDA0003653471450000111
经过上述筛选和优化实验，建立了如下类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系：
步骤S1：RPA反应
采用TwistAmp Basic试剂盒(TwistDx，TABAS03KIT)进行RPA扩增反应。配制预混液：Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，Bp-p3-F/Bp-p3-R引物(10μM)各2.4μL，模板DNA 5μL，RNase free ddH2O补至47.5μL。将预混液在PCR管中混合均匀后，吸取2.5μL280mM醋酸镁溶液(MgOAc)于PCR管盖上，盖上盖子后稍离心，迅速放于39℃反应20min，得到RPA产物。
步骤S2：RPA-LbCas12a反应
配制RPA-LbCas12a反应体系：步骤S1得到的RPA产物10μL，Bp-crRNA1(1.67μg/μL)0.8μL，DNase I Reaction Buffer(NEB，B0303S)2μL，LbCas12a(1.34μg/μL)1μL，报告探针ssDNA(10μM)1μL，RNase free ddH2O补至20μL。将反应体系振荡混匀后瞬时离心，置于Bio-Rad CFX 96实时荧光定量PCR仪中，于37℃反应30min，检测荧光信号强度(RFU)。
实施例2、类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的灵敏度和特异性评价
采用Quick DNA/RNA Pathogen miniprep Kit(ZYMO RESEARCH，R1042)从人正常血液样本中提取正常血液基因组DNA，用于以下灵敏度和特异性评价实验。人正常血液样本由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。
1、灵敏度评价
在正常血液基因组DNA溶液中加入经过实时荧光定量PCR定量的类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株的基因组DNA，得到1.35拷贝/μL、2.7拷贝/μL、27拷贝/μL、270拷贝/μL、2700拷贝/μL、27000拷贝/μL、270000拷贝/μL的类鼻疽伯克霍尔德菌核酸标本。分别取各个浓度的类鼻疽伯克霍尔德菌核酸标本5μL作为模板进行RPA扩增，同时以ddH2O为模板进行RPA扩增作为阴性对照，按照实施例1建立的类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系进行检测。
结果如图5所示，本发明的RPA-LbCas12a检测体系的检测下限为2.7拷贝/μL的类鼻疽伯克霍尔德菌核酸标本，具有很高的灵敏度。
2、特异性评价
以正常血液基因组DNA为阴性对照，以类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株的基因组DNA为阳性对照，使用实施例1建立的类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系，检测泰国伯克霍尔德菌(Bt)、洋葱伯克霍尔德菌(Bc)、金黄色葡萄球菌(Sa)、鲍曼不动杆菌的基因组DNA样本，评价该RPA-LbCas12a检测体系对类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性。
结果如图6所示，阴性对照以及泰国伯克霍尔德菌(Bt)、洋葱伯克霍尔德菌(Bc)、金黄色葡萄球菌(Sa)和鲍曼不动杆菌(Ab)的基因组DNA样本的检测结果均为阴性，阳性对照的检测结果为阳性。由此可见，建立的RPA-LbCas12a检测体系对类鼻疽伯克霍尔德菌(Bp)具有良好的特异性，伯克霍尔德菌属的其它菌株以及金葡、鲍曼等菌种对类鼻疽伯克霍尔德菌(Bp)的检测分析无干扰。
实施例3、类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系的ROC曲线验证
本实验使用的正常血液样本为人正常血液样本，由陆军军医大学药学与检验医学系临床微生物与免疫学教研室实验室提供。本实验使用的类鼻疽伯克霍尔德菌液为类鼻疽伯克霍尔德菌BPC006菌株。
首先制备以下样本：
样本1：取正常血液样本20例，分别提取基因组DNA；
样本2：取正常血液样本20例，分别加入一定量的类鼻疽伯克霍尔德菌的菌液，然后分别提取基因组DNA；提取的基因组DNA中类鼻疽菌基因组DNA的拷贝数约为1-2.7拷贝/μL；
样本3：取正常血液样本20例，分别加入一定量的类鼻疽伯克霍尔德菌的菌液，然后分别提取基因组DNA；提取的基因组DNA中类鼻疽菌基因组DNA的拷贝数约为10-27拷贝/μL；
样本4：取正常血液样本20例，分别加入一定量的类鼻疽伯克霍尔德菌的菌液，然后分别提取基因组DNA；提取的基因组DNA中类鼻疽菌基因组DNA的拷贝数约为100-270拷贝/μL；
样本5：金黄色葡萄球菌菌株10例，鲍曼不动杆菌菌株10例，泰国伯克霍尔德菌10例，洋葱伯克霍尔德菌10例，分别提取基因组DNA。
然后按照实施例1建立的类鼻疽伯克霍尔德菌RPA-LbCas12a检测体系对每一例样本进行检测，将得到的荧光信号值(RFU)带入SPSS软件，制作ROC曲线(图7)。SPSS软件分析各样本Ct值的结果如表8所示。AUC(area under ROC)为0.988，约登指数(正确指数)最大为0.933，最大约登指数对应的RFU值659即为阳性判定临界值。
表8
Figure BDA0003653471450000131
备注：a.假设在非参数性的情况下；b.虚无假设：真区域＝0.5。
实施例4、基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物及方法1、基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物
所述组合物包括RPA引物、crRNA、ssDNA荧光探针、RPA反应体系及CRISPR/Cas12a切割检测体系所需的试剂；
所述RPA引物如下：
Bp-p3-F：5’-GGGACGCATACACTACCAGATTT-3’(SEQ ID NO:5)，
Bp-p3-R：5’-CCACTTACGTTGAAGAACTGTGC-3’(SEQ ID NO:6)；
所述crRNA的转录模板序列如下：
上游模板：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’(SEQ ID NO:9)；
下游模板：
5’-TATCGTATGCAGGACGAGAGATCTACACTTAGTAGAAATTACCTATAGTGAGTCGTATTA-3’(SEQ ID NO:7)；
所述ssDNA荧光探针如下：
5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’；
其中FAM和BHQ1修饰的ssDNA荧光探针用于在LED蓝光下裸眼判断检测目标体系中是否存在类鼻疽伯克霍尔德菌。
2、基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法
利用所述组合物可视化检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样品的基因组DNA；
(2)进行如下RPA反应：Primer Free Rehydration buffer 29.5μL，Bp-p3-F/Bp-p3-R引物(10μM)各2.4μL，待测样品的基因组DNA 5μL，用RNase free ddH2O补至47.5μL，混匀后加入2.5μL 280mM醋酸镁溶液(MgOAc)，迅速放于39℃反应20min，得到RPA产物；
(3)进行如下RPA-LbCas12a反应：步骤(2)得到的RPA产物10μL，crRNA(1.67μg/μL)0.8μL，DNase I Reaction Buffer(NEB，B0303S)2μL，LbCas12a(1.34μg/μL)1μL，报告探针ssDNA(10μM)1μL，RNase free ddH2O补至20μL，混匀后于37℃反应30min，得到RPA-LbCas12a产物；
(4)将所述RPA-LbCas12a产物置于LED蓝光下进行裸眼判断，或将所述RPA-LbCas12a产物置于实时荧光定量PCR仪中进行检测；若RPA-LbCas12a产物无荧光亮度或荧光强度低于临界值(RFU＝659)，则表示待测样品未感染类鼻疽伯克霍尔德菌或者感染类鼻疽伯克霍尔德菌的量低于检测下限，若RPA-LbCas12a产物有荧光亮度或荧光强度高于临界值(RFU＝659)，则表示待测样品感染了类鼻疽伯克霍尔德菌。
图8显示了将所述RPA-LbCas12a产物置于LED蓝光下进行裸眼判断的结果，可以看出，当待测样品的基因组DNA中类鼻疽伯克霍尔德菌的基因组DNA浓度大于2.7拷贝/μL时，RPA-LbCas12a产物在LED蓝光下均有荧光亮度，而阴性对照与空白对照均无荧光亮度。图9显示了将所述RPA-LbCas12a产物置于实时荧光定量PCR仪中检测荧光强度的结果。其中，阴性对照以ddH2O为样品进行RPA反应和RPA-LbCas12a反应，空白对照为基因组DNA提取试剂盒Zymo Quick DNA/RNA Pathogen中的核酸洗脱液。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 基于RPA-LbCas12a体系可视化检测类鼻疽的组合物及其应用
<130> P2230478-LJD-CQ-TXH
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p1-F
<400> 1
gctgtatcaa ggatgtcgaa acg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p1-R
<400> 2
ttgcaatcct ccatccattt tcg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p2-F
<400> 3
atctcttgac cgctgtatca agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p2-R
<400> 4
ccttgcaatc ctccatccat ttt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p3-F
<400> 5
gggacgcata cactaccaga ttt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-p3-R
<400> 6
ccacttacgt tgaagaactg tgc 23
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-crRNA1下游模板
<400> 7
tatcgtatgc aggacgagag atctacactt agtagaaatt acctatagtg agtcgtatta 60
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-crRNA2下游模板
<400> 8
ataagcgtat cgttcggcca tatctacact tagtagaaat tacctatagt gagtcgtatt 60
a 61
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bp-crRNA上游模板
<400> 9
taatacgact cactatagg 19
<210> 10
<211> 443
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 类鼻疽伯克霍尔德菌基因检测的靶序列
<400> 10
gggacgcata cactaccaga tttgatagtt tcgtcctttc aaaatctaga ctctaataaa 60
ctcgcacact tttcccatca catcgatggc gattaaccaa taaatccagt ggagttaaaa 120
atgggcaaag cgaataccat cgagctcaca aacaacacat catttactct cgtcctgcat 180
acgatatacg ccaacacggg caattggtcc ggcgattatc cgccggccta tttacggccg 240
aacgatacgc ttatttttac gagtacgctt gatggaaaag gagatctaaa cggctcagcc 300
cgtttcgaca tccttgatac agcggtcaag agatgtccgg acgcgaccta cgtacagctc 360
aactgggaca atcccgtcgg agcggacaat gggggatcct cgtccgtagt cggcgccaca 420
gcacagttct tcaacgtaag tgg 443
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 荧光定量PCR上游引物
<400> 11
cgctcacagt tcctttccc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 荧光定量PCR下游引物
<400> 12
agtgcagttc ttcgcttgg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 荧光定量PCR探针
<400> 13
gagatcggag gcttgatag 19

Claims (10)

1.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物，其特征在于，包括RPA引物、crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针；所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示；所述crRNA的转录模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述ssDNA荧光探针的序列为TTATT，其5’端标记FAM荧光报告基团、3’端标记BHQ1淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)反应体系所需的通用试剂和/或CRISPR-Cas12a切割体系所需的通用试剂。
4.权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物在制备用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的产品中的应用。
5.用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物。
6.权利要求1-3任一所述的用于检测类鼻疽伯克霍尔德菌的组合物或权利要求5所述的试剂盒在类鼻疽伯克霍尔德菌检测中的应用。
7.一种检测类鼻疽伯克霍尔德菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.提取待测样品的基因组DNA；
S2.以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述的RPA引物进行重组酶聚合酶恒温扩增反应，得到RPA产物；
S3.将权利要求1中所述的crRNA、LbCas12a蛋白酶和ssDNA荧光探针与步骤S2得到的RPA产物混合后进行CRISPR-Cas12a切割反应，得到酶切产物；
S4.对步骤S3得到的酶切产物进行荧光信号检测；若酶切产物产生荧光，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若酶切产物无荧光产生，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光信号检测的方法为如下a)或b)：
a)将所述酶切产物置于LED蓝光下，裸眼观察酶切产物是否有荧光产生；
b)将所述酶切产物置于荧光定量仪中检测荧光强度；若相对荧光单位高于659，则判断待测样品中含有类鼻疽伯克霍尔德菌；若相对荧光单位低于659，则判断待测样品中不含有类鼻疽伯克霍尔德菌。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶恒温扩增反应的体系和条件为：Rehydration Buffer 29.5μL，基因组DNA 5μL，10μM RPA正反向引物各2.4μL，RNase-free ddH2O 8.2μL，混匀后加入280mM MgOAc 2.5μL启动反应，于39℃反应20min。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a切割反应的体系和条件为：RNase free ddH2O 5.2μL，DNase I Reaction Buffer 2μL，1.34μg/μLLbCas12a 1μL，1.67μg/μL crRNA 0.8μL，10μM ssDNA荧光探针1μL，RPA产物10μL，混匀后置于37℃反应30min。
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