CN116732202A - 猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，探针序列如SEQ ID NO.13所示；本发明提供的一种猫衣原体核酸快速检测试剂盒，通过利用RAA技术结合荧光探针技术，建立猫衣原体的实时荧光RAA检测试剂盒，实现对猫衣原体核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达5.3copies/μL，满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。

Description

猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测 方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒及检测方法。

背景技术

在猫的传染性疾病中，猫的上呼吸道感染最为普遍，其致病原包括：病毒(疱疹病毒、杯状病毒等)、细菌(绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、波氏杆菌等)、支原体、衣原体和真菌(隐球菌、孢子丝菌)等。在临床上常见的有疱疹病毒、杯状病毒、支原体、衣原体和波氏杆菌病，其中最容易传染人，并能造成人感染发病的人兽共患病病原为衣原体。衣原体具有广泛的致病性，是一种重要的人兽共患病，能引起人和动物的多种疾病。衣原体科有衣原体属及亲衣原体属两个属。衣原体属(Chlamydia)的成员有：沙眼衣原体(C.trachematis)、鼠衣原体(C.muri darum)及猪衣原体(C.suis)；亲衣原体属(Chlamydophilia)的成员有：牛羊亲衣原体(Cp.pecorum，原为肺炎衣原体)、肺炎亲衣原体(Cp.pneumenice)、鹦鹉热亲衣原体(Cp.psittaci)、流产亲衣原体(Cp.abertus)、猫亲衣原体(Cp.felis)、豚鼠亲衣原体(Cp.caviae)。猫亲衣原体(Cp.felis)原为鹦鹉热亲衣原体猫源株，是由Baker(1942)等人首先报道的，是从患有肺炎的猫体中分离到鹦鹉热衣原体(Chamydia Psittaci)，以后许多学者也从猫体中分离到此种病原，这些病原统称为猫衣原体(C.felis)，并且证实C.felis可引起猫的多种疾病，可致猫结膜炎及鼻炎，也可致肺炎，有可能与胃肠炎及生殖系统疾病有关。感染C.felis的病猫可将衣原体传染于人，给公共卫生安全和人的健康造成危害。

目前尚无高效的猫衣原体疫苗用于预防。因此，及时发现并掌握猫衣原体的流行现状及感染情况对控制该病的传播和制定治疗措施十分关键。现阶段针对猫衣原体的检测方法主要有病原分离培养法、免疫学方法和核酸检测法等。其中，病原分离培养法存在操作复杂、耗时长、仪器设备及操作人员要求高等缺点，不适合早期、现场快速诊断；免疫学方法是使用较为常见的一种技术，但这种方法前提条件是需制备高质量的抗原或特异性抗体，致使检测易出现假阴性或假阳性结果；常见的检测方法是基于核酸的分子检测方法，其中荧光PCR技术比较常见，是当前病原检测的金标准，但该方法需要昂贵的设备和专业的操作人员，而且一般需要两个小时以上的检测时长，很难满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求，且灵敏度和特异性难以让人满意。本发明在重组酶介导等温核酸扩增(recombinant enzyme mediated isothermal nucleicacid amplification，RAA)技术的基础上，进而借助荧光探针技术高灵敏性优势，建立猫衣原体荧光RAA检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒及检测方法。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒，其包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，探针序列如SEQ ID NO.13所示。

优选地，正向引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示；

反向引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.12所示。

优选地，缓冲液包括2.5mmol/L dNTPs、225ng/μL SSB、300ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)和75ng/μL Bsu DNA聚合酶。

优选地，阳性对照为C.felis_pUC57质粒，阴性对照为双蒸水。

优选地，猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测体系为：正向引物和反向引物的浓度为10μM，体积为2μL，探针的浓度为10μM，体积为0.6μL，缓冲液的体积为25μL，醋酸镁的浓度为280mM，体积为5μL，阳性对照和阴性对照的体积为50μL。

一种利用上述的猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测方法，其包括如下步骤：

(1)、针对靶向序列设计引物对，并稀释；

(2)、将稀释后的引物对和靶向序列加入猫衣原体荧光RAA检测试剂盒的检测体系中等温扩增，将扩增产物与酚氯仿进行等体积混合，离心，上清液进行凝胶电泳。

优选地，步骤(1)中，靶向序列如SEQ ID NO.14所示。

优选地，步骤(1)中，引物对的序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.12所示。

优选地，步骤(2)中，离心的转速为5 000rmp，时间为5min。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明提供的一种猫衣原体核酸快速检测试剂盒，通过利用RAA技术结合荧光探针技术，建立C.felis的实时荧光RAA检测试剂盒，实现对猫衣原体核酸的高灵敏度、高特异性的快速检测，具有耗时短、操作简单等优势。猫衣原体常用的检测方法为荧光PCR，其检测限达10copies/μL，本发明试剂盒建立的检测方法灵敏度高于荧光PCR，检测限可达5.3copies/μL。

本发明提供的一种利用猫衣原体核酸快速检测试剂盒检测猫衣原体核酸的方法，在恒温条件下，全程1h内就能完成样品核酸提取以及检测。满足临床一线、基层兽医、宠物医院、经济欠发达等地区开展大规模的现场核酸检测的要求。

附图说明

图1为发明实施例4中不同引物对普通RAA检测结果。

图2为发明实施例4中引物对C.felis1F/C.felis1R普通RAA扩增产物测序后BLAST结果。

图3为发明实施例7中不同引物对荧光RAA检测结果。

图4为发明实施例8中实时荧光RAA敏感性检测结果。

图5为发明实施例9中实时荧光RAA特异性检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种猫衣原体荧光RAA检测试剂盒及检测方法。

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

现有技术中一个检测猫衣原体核酸的普通RAA方法的步骤：针对C.felis基因，筛选靶向序列，设计上、下游引物，将其稀释至工作浓度，与靶向序列一起加入到RAA反应体系中进行等温扩增，将扩增产物与酚氯仿进行等体积混合，5 000rmp离心5min，取上清进行1％凝胶电泳，观察电泳条带是否与目的条带大小一致，将RAA产物进行测序比对，确认扩增序列为C.felis目标序列。

本发明中检测C.felis的实时荧光RAA检测方法的步骤：在靶向基因内设计相应探针建立C.felis荧光RAA检测方法。合成和稀释探针至工作浓度，将引物、探针与靶向序列一起加入到荧光RAA反应体系中，放入荧光PCR仪中进行等温扩增，同时读取荧光值，根据荧光曲线和荧光值判定方法是否成立。

本发明中RAA体系中的无核酸酶水(RNase free water)、缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁(MgAc)均来自齐天基因公司试剂盒(QiTian，产品编号：B00001)；猫衣原体标准DNA、RAA引物对和探针合成均由上海赛恒生物科技有限公司完成；Magen磁珠法抽提试剂盒(Magen，产品编号：Md5416-01)；ABI ViiA 7实时荧光定量PCR仪(可用QT-F1620RAA荧光检测仪等同等仪器代替)。

实施例1

猫衣原体标准DNA的制备及RAA引物对和探针

本实施例针对猫衣原体保守基因16S rRNA(C.felis Fe/Pn-1株16S rRNA，登录号为NR_036876.1，全长1548bp)，筛选出其中一段基因片段(16S rRNA的752位至981位，其cDNA序列如SEQ ID NO.14所示，该基因片段命名为猫衣原体标准DNA)，依据该猫衣原体标准DNA特别设计的RAA引物对以及探针可以高灵敏度和高特异性的检测猫衣原体。

猫衣原体标准DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.14)：

5’-ACCTGACGCTAAGGCGCGAAAGCAAGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCTTGCCGTAAACGATGCATACTTGATGTGGATAGTCTCAACCCTATCCGTGTCGTAGCTAACGCGTTAAGTATGCCGCCTGAGGAGTACACTCGCAAGGGTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAG-3’。

设计的用于扩增猫衣原体标准DNA的RAA引物对，包括正向引物和反向引物(见表1)：

表1C.felis的RAA引物序列

设计的用于结合猫衣原体实时荧光RAA扩增产物的探针(C.felis Probe)，如下：

C.felis Probe：5’-CGATGCATACTTGATGTGGATAGTCTCAACCC[FAM-dT]A(THF)[BHQ1-dT]CCGTGTCGTAGCTAAC(C3-Spacer)-3’(位置821-871)(SEQ ID NO.13)。

实施例2

猫衣原体普通RAA检测试剂盒

本实施例的猫衣原体普通RAA检测试剂盒(50×)包括：

正向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2μL×50＝100μL；

反向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2μL×50＝100μL；

2×缓冲液，体积25μL ×50＝1250μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积5μL×50＝250μL；

ddH₂O，体积14μL ×50＝700μL；

阳性对照，C.felis_pUC57质粒，浓度5.3×10⁵copies/μL，体积50μL；

阴性对照，ddH₂O，体积50μL。

实施例3

猫衣原体普通RAA检测体系

本实施例的猫衣原体普通RAA检测体系(50μL)包括：

正向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2μL；

反向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积5μL；

ddH₂O，体积14μL；

待检样本核酸，体积2μL。

实施例4

猫衣原体普通RAA最佳引物对的筛选和产物验证

本实施例应用普通RAA检测方法对靶向序列SEQ ID NO.14实施检测，验证6对引物的特异性和敏感性。

在相同的检测体系中，应用不同的引物对进行普通RAA检测，产物加入等体积的酚/氯仿混合液充分混匀，5000rpm离心5min，取上清利用1％琼脂糖电泳法分析不同引物的产物扩增效率，检测结果见图1。研究结果表明引物对C.felis1F/C.felis1R、C.felis2F/C.felis2R和C.felis3F/C.felis3R的条带特异性和敏感性均较好。选择引物对C.felis1F/C.felis1R普通RAA扩增产物进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST，结果见图2。研究表明引物对C.felis1F/C.felis1R普通RAA扩增产物序列为猫衣原体，符合RAA检测体系要求。

实施例5

本实施例的猫衣原体实时荧光RAA检测试剂盒(50×)包括：

正向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2.1μL×50＝105μL；

反向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2.1μL×50＝105μL；

探针(C.felis Probe)，浓度10μM，体积0.6μL×50＝30μL；

2×缓冲液，体积25μL×50＝1250μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积5μL×50＝250μL；

ddH₂O，体积13.2μL×50＝660μL；

阳性对照，C.felis_pUC57质粒，浓度5.3×10⁵copies/μL，体积50μL；

阴性对照，ddH₂O，体积50μL。

实施例6

猫衣原体实时荧光RAA检测体系

本实施例的猫衣原体实时荧光RAA检测体系(50μL)包括：

正向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2.1μL；

反向引物(如表1所示)，浓度10μM，体积2.1μL；

探针(C.felis Probe)，浓度10μM，体积0.6μL；

2×缓冲液，体积25μL；

镁离子(醋酸镁)，浓度280mM，体积5μL；

ddH₂O，体积13.2μL；

待检样本核酸，体积2μL。

实施例7

猫衣原体实时荧光RAA最佳引物对的筛选

本实施例应用实时荧光RAA检测方法对靶向序列SEQ ID NO.14实施检测，验证6对引物和探针的特异性和敏感性。

在相同的检测体系中，应用不同的引物对进行实时荧光RAA检测，检测结果见图3。研究结果表明引物对C.felis1F/C.felis1R、C.felis2F/C.felis2R、C.felis3F/C.felis3R、C.felis5F/C.felis5R和探针C.felis Probe的曲线特异性和敏感性均较好，符合实时荧光RAA检测体系要求。结合猫衣原体普通RAA引物对筛选结果，最终确定引物对C.felis1F/C.felis1R为C.felis荧光RAA检测方法的引物。

实施例8

猫衣原体实时荧光RAA灵敏度验证

标准模板质粒DNA的制备：由上海赛恒生物科技有限公司合成猫衣原体标准DNA(SEQ ID NO.14)，并插入到pUC57载体中，构建猫衣原体的标准模板质粒DNA，命名为C.felis_pUC57质粒，继而转化入E.coli大肠杆菌内。猫衣原体标准DNA(SEQ ID NO.14)在添加了200μg/mL(终浓度)氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h后，按照Magen磁珠法抽提试剂盒(Magen，产品编号：Md5416-01)说明书进行质粒提取。通过超微量分光光度计测得提取的C.felis_pUC57质粒浓度为17ng/mL，根据公式(质粒拷贝数copies/μL)＝(6.02×10²³copies/μL)×(质粒浓度g/μL)/(2 942×660g/mol)计算出C.felis_pUC57质粒拷贝数浓度为5.3×10⁶copies/μL。

将C.felis_pUC57质粒进行10倍梯度稀释，制备浓度从5.3×10⁶copies/μL到5.3×10^-1copies/μL的系列浓度的标准模板质粒DNA，将其作为模板DNA(待测样品)。阴性对照：模板DNA用灭菌双蒸水替代。然后按照实施例4实施，结果如图4所示，当模板浓度为5.3×10⁰copies/μL时，荧光曲线仍有上升，则该方法检测猫衣原体的灵敏度可达5.3×10⁰copies/μL。

实施例9猫衣原体实时荧光RAA特异性验证

将C.felis_pUC57质粒、猫杯状病毒、猫疱疹病毒1型、猫传染性腹膜炎病毒、猫细小病毒、猫支原体、波士杆菌的基因组DNA作为模板DNA(浓度为1.00×10⁵copies/μL)。然后按照实施例4实施，结果如图5所示，猫衣原体的检测体系与其他病原体并无交叉反应，特异性较好。

实施例10猫衣原体实时荧光RAA临床样品的核酸检测

为了进一步评价本发明建立的猫衣原体实时荧光RAA核酸快速检测试剂盒及检测方法的效果，对117份临床样品，利用Magen磁珠法病毒抽提试剂盒(磁珠法)(Magen，产品编号：Md5416-01)以及全自动核酸提取仪(KingFisher-700)提取待测样品DNA，分别按照实施例4和猫衣原体荧光定量PCR试剂盒(上海尔创生物科技有限公司，产品编号：EC20210617-01)对样品进行核酸快速检测。

对117份临床样品猫衣原体检测结果进行分析，其中20份为猫衣原体阳性样品，有97份为猫衣原体阴性样品；结果临床样品的检测结果如表2所示，20份阳性检测结果与荧光定量PCR检测一致，96份阴性样品检测结果与荧光定量PCR检测一致，而本发明建立的检测方法的检测结果与荧光定量PCR检测结果敏感性为95.24％，特异性为100％(表2)。

表2实时荧光RAA和荧光定量PCR方法的临床样本检测结果比对

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (9)

1.一种猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：其包括探针、正向引物、反向引物、缓冲液、醋酸镁、阳性对照、阴性对照，所述探针序列如SEQ ID NO.13所示。

2.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述正向引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.11所示；

所述反向引物序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.10和SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括2.5mmol/L dNTPs、225ng/µL SSB、300ng/µL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）和75 ng/µL Bsu DNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为C. felis_pUC57质粒，所述阴性对照为双蒸水。

5.根据权利要求1所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒，其特征在于：所述猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒的检测体系为：正向引物和反向引物的浓度为10μM，体积为2 μL，探针的浓度为10μM，体积为0.6 μL，缓冲液的体积为25 μL，醋酸镁的浓度为280 mM，体积为5 μL，阳性对照和阴性对照的体积为50 μL。

6.一种利用权利要求1-5任一项所述的猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：

（1）、针对靶向序列设计引物对，并稀释；

（2）、将稀释后的引物对和靶向序列加入猫衣原体荧光重组酶介导等温核酸扩增检测试剂盒的检测体系中等温扩增，将扩增产物与酚氯仿进行等体积混合，离心，上清液进行凝胶电泳。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述靶向序列如SEQ IDNO.14所示。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述引物对的序列如SEQID NO.1- SEQ ID NO.12所示。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心的转速为5 000rmp，时间为5min。