JP7374377B2 - チフス菌の検査キット、その製造方法及びその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、チフス菌の検査キット、その製造方法及びその用途に関し、微生物検出の技術分野に属する。
サルモネラ属のチフス血清型（Ｓ．Ｔｙｐｈｉ）は、ヒトの宿主制限病原体であり、それによるチフスは、依然として重大な公衆衛生問題である。全世界で毎年約１０９０万人がチフスに感染し、約１０万人が死亡し、子供の感染率が最も高いと推定されている。チフス菌は、主に糞便により汚染された水又は食物を介して拡散する。患者が汚染された食物又は水を摂取した後、チフス菌は、腸粘膜に侵入して全身に拡散し、高熱、肝脾腫、皮疹等の急性症状を引き起こす。チフス菌による症状及び兆候が非特異的であり、臨床症状により直接的に診断することが困難であり、そのため、実験室検査は、診断にとって重要である。
現在、実験室でチフス診断に使う究極の判断基準は、依然として細菌の分離培養であるが、血液中の細菌数及び抗菌薬の使用の影響を受けて、血液培養の陽性率は、骨髄培養よりも低い。しかしながら、骨髄の抽出は、患者の治療過程における感染リスクを増加させ、また、分離培養の時間が長いため、早期診断に不利である。したがって、最も一般的な診断方法は、血清学に関するビダール反応である。しかしながら、この反応は、マラリア、デング熱、ブルセラ症等の他の感染性病原体と深刻な交差反応が存在し、偽陽性の結果を生成しやすく、誤診率の増加をもたらし、ビダール反応の力価も地域及び年齢によって大きく異なる。したがって、詳細な背景資料がない場合、単純な血清学的診断は、正確ではなく、意味がない。ＥＬＩＳＡ方法は、ビダール反応に比べて敏感で特異的な診断方法であり、ある文献では、ＥＬＩＳＡが抗体検出上でより優れており、ＥＬＩＳＡがビダール反応の代わりに血清抗体をモニタリングすることができることが記載されている。現在、市販の抗体検査キットには、Ｔｕｂｅｘ ｔｅｓｔ、Ｔｙｐｈｉｄｏｔ／Ｔｙｐｈｉｄｏｔ－Ｍ、ＩｇＭ Ｄｉｐｓｔｉｃｋがあり、これらのキットは、いずれもＩｇＭを検出することを目的とし、血清学的方法の共通の欠点があり、すなわち交差反応が強い。そのため、血清学的検出に使用している抗原が議論されており、特異抗原を探す必要がある。細菌の分離培養及び血清学的検出に加えて、核酸検出は、現在最も敏感で特異的な診断方法であると認められる。ＰＣＲにより核酸検出を行う最大の利点は、培養の結果が陰性である場合、ＰＣＲが微量の核酸断片を増幅し、細菌のトレースを捕捉することである。しかしながら、ＰＣＲ方法としては、まず、汚染しやすく、次に、抗生物質の悪用が血液中の細菌数の減少を促進し、サンプルのＤＮＡテンプレートの製造を困難にし、さらに、９０％以上のサルモネラ属ゲノムが類似であり、個別の塩基のみに差異があるため、現在のＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲであるという欠点があり、このような複雑な増幅より、ゲノムからより多くのユニークな遺伝子を発見するほうがいい。
正確な診断は、患者にタイムリーな医療ケア及び適切な治療を行うことを確保することに重要である。しかしながら、サルモネラ菌生体特有の課題を考慮して、費用対効果が高く、正確な結果を迅速に提供できる新しい診断ツールが、数年前から国際的に開発されている。２０２０年に開催された第１１回チフス及びその他のサルモネラ症に関する国際会議では、臨床的モニタリングの代わりに、環境におけるサルモネラ病原体の数をモニタリングする新たな構想を提供した。したがって、迅速で、効率的で、便利なチフス菌の検出方法を開発することは、特に重要である。
従来技術の欠点を解消するために、本発明の第１の目的は、チフス菌の検査キットを提供することであり、当該キットは、感度が高く、特異性が高く、迅速に可視化される。
本発明の第２の目的は、上記チフス菌の検査キットの製造方法を提供することであり、当該製造方法は、簡単で迅速であり、工業生産に適する。
本発明の第３の目的は、チフス菌の検査キットの用途を提供し、チフス菌の検査キットをチフス菌の核酸検出に使用し、迅速な可視化検出を実現することである。
本発明の第１の目的は、以下の技術的解決手段により達成される。チフス菌の検査キットは、増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含み、
ｃｒＲＮＡは、チフス菌ｆｌａｇ遺伝子の検査セグメントに対する特異的ｃｒＲＮＡであり、
ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸をそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させた配列である。
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ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸をそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させた配列である。
さらに、増幅プライマーは、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１を含み、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示し、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す。
さらに、ｃｒＲＮＡは、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３を含み、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示し、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す。
さらに、一本鎖ＤＮＡ報告システムは、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒを含み、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒは、６－カルボキシフルオレセイン及び蛍光クエンチャーで標識された一本鎖ＤＮＡであり、標識生成物は、／５ ６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ １／である。
本発明の第２の目的は、以下の技術的解決手段により達成される。チフス菌の検査キットの製造方法は、検査キットが増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含み、
ｃｒＲＮＡを含む増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌ｆｌａｇ遺伝子に対して、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲ識別配列ＴＴＴＮ又は／及びＴＣＴＮを含む標的配列を検索し、ｃｒＲＮＡを設計して調製するｃｒＲＮＡ調製ステップと、
Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸に対してそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させて、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列を得てから、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質を得るＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質調製ステップと、を含む。
ｃｒＲＮＡを含む増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌ｆｌａｇ遺伝子に対して、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲ識別配列ＴＴＴＮ又は／及びＴＣＴＮを含む標的配列を検索し、ｃｒＲＮＡを設計して調製するｃｒＲＮＡ調製ステップと、
Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸に対してそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させて、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列を得てから、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質を得るＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質調製ステップと、を含む。
さらに、増幅プライマーの長さは、３０～３７ｂｐである。
さらに、ｃｒＲＮＡ調製ステップにおいて、ｃｒＲＮＡの長さは、２３ｂｐである。
本発明の第３の目的は、以下の技術的解決手段により達成される。チフス菌の検査キットの用途は、チフス菌の検査キットをチフス菌の核酸検出に使用することであり、検査キットが増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含み、
前記チフス菌の核酸検出は、
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術系に添加することにより、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含む検出系に添加して反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して結果を得る検出ステップと、を含む。
前記チフス菌の核酸検出は、
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術系に添加することにより、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含む検出系に添加して反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して結果を得る検出ステップと、を含む。
さらに、増幅ステップにおいて、温度が３７℃の条件で３０ｍｉｎ増幅して、増幅産物を得て、検出ステップにおいて、温度が３７℃の条件で２５ｍｉｎ反応して、検出産物を得る。
さらに、検出ステップにおける蛍光検出法として、マイクロプレートリーダーを用いて検出反応における蛍光値を測定し、検出の励起光を４８５～５２０ｎｍに設定し、又は、検出産物を波長４８５ｎｍの光源下に置いて直接観察する。
本発明の設計原理は、以下のとおりである。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲｓ）は、細菌の適応免疫系であり、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより外来核酸を標的分解する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ酵素の第２のファミリーに属し、ＲＮＡを誘導して二本鎖ＤＮＡが単一のＲｕｖＣ触媒ドメインを分解するように指導するものである。Ｃａｓ１２酵素は、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ、Ｔ）ヌクレオチドに富むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別し、それら自体のガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の成熟を触媒し、相補的にペアリングされた二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を特異的に識別して切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２タンパク質は、配列特異的な様式で標的二本鎖ＤＮＡを識別して切断する場合、強大な非特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）トランス切断活性を誘導することができ、ｓｓＤＮＡに結合された蛍光レポーターは、切断時に蛍光シグナルを生成する。本発明のキットは、Ｃａｓ１２の上記特性に基づいて、臨床検体中のチフス菌核酸を迅速で正確に検出することができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲｓ）は、細菌の適応免疫系であり、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼにより外来核酸を標的分解する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ酵素の第２のファミリーに属し、ＲＮＡを誘導して二本鎖ＤＮＡが単一のＲｕｖＣ触媒ドメインを分解するように指導するものである。Ｃａｓ１２酵素は、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ、Ｔ）ヌクレオチドに富むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を識別し、それら自体のガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の成熟を触媒し、相補的にペアリングされた二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を特異的に識別して切断する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２タンパク質は、配列特異的な様式で標的二本鎖ＤＮＡを識別して切断する場合、強大な非特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）トランス切断活性を誘導することができ、ｓｓＤＮＡに結合された蛍光レポーターは、切断時に蛍光シグナルを生成する。本発明のキットは、Ｃａｓ１２の上記特性に基づいて、臨床検体中のチフス菌核酸を迅速で正確に検出することができる。
従来の技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。
１、本発明の検査キットは、感度が高く、特異性が強く、迅速に可視化され、チフス菌核酸の迅速な検出に用いることができる。
２、本発明の検査キットのｃｒＲＮＡは、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲに基づいて特定のＰＡＭ配列特徴を識別し、ｆｌａｇ遺伝子標的配列に設計された特異的ｃｒＲＮＡは、効率的な特異性を有する。
３、本発明の検査キットのＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、最適化及び変異により、ＴＴＴＮ以外のＴＣＴＮ標的配列を識別することができる。
４、本発明の検査キットの用途は、蛍光灯の下で目視で直接検出することができ、便利で迅速な結果の判読を実現することができ、検出が正確で、迅速で、簡便であり、一次実験及び臨床現場でチフス菌の迅速な検出及び同定診断を容易にする。
５、本発明の検査キットの使用方式は、特異性が高く、消費時間が短く、スループットが高く、大型実験装置に依存しない。
１、本発明の検査キットは、感度が高く、特異性が強く、迅速に可視化され、チフス菌核酸の迅速な検出に用いることができる。
２、本発明の検査キットのｃｒＲＮＡは、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲに基づいて特定のＰＡＭ配列特徴を識別し、ｆｌａｇ遺伝子標的配列に設計された特異的ｃｒＲＮＡは、効率的な特異性を有する。
３、本発明の検査キットのＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、最適化及び変異により、ＴＴＴＮ以外のＴＣＴＮ標的配列を識別することができる。
４、本発明の検査キットの用途は、蛍光灯の下で目視で直接検出することができ、便利で迅速な結果の判読を実現することができ、検出が正確で、迅速で、簡便であり、一次実験及び臨床現場でチフス菌の迅速な検出及び同定診断を容易にする。
５、本発明の検査キットの使用方式は、特異性が高く、消費時間が短く、スループットが高く、大型実験装置に依存しない。
以下、図面及び具体的な実施形態を参照しながら、本発明をさらに説明する。
チフス菌の検査キットは、増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含み、
増幅プライマーは、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１を含み、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示し、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示し、
ｃｒＲＮＡは、チフス菌ｆｌａｇ遺伝子の検査セグメントに対する特異的ｃｒＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡは、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３（等しい割合で混合）を含み、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示し、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示し、
ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い（従来のソフトウェアで最適化を行う）、５３２位及び５９５位のアミノ酸をそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させた配列であり、
一本鎖ＤＮＡ報告システムは、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒを含み、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒは、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）及び蛍光クエンチャー（ＢＨＱ１）で標識された一本鎖ＤＮＡであり、標識生成物は、／５ ６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ １／であり、ｓｓＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒ／５６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ１／と命名される。
増幅プライマーは、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１を含み、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示し、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示し、
ｃｒＲＮＡは、チフス菌ｆｌａｇ遺伝子の検査セグメントに対する特異的ｃｒＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡは、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３（等しい割合で混合）を含み、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示し、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示し、
ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列は、Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い（従来のソフトウェアで最適化を行う）、５３２位及び５９５位のアミノ酸をそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させた配列であり、
一本鎖ＤＮＡ報告システムは、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒを含み、一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒは、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）及び蛍光クエンチャー（ＢＨＱ１）で標識された一本鎖ＤＮＡであり、標識生成物は、／５ ６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ １／であり、ｓｓＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒ／５６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ１／と命名される。
上記チフス菌の検査キットの製造方法は、
ｃｒＲＮＡを含む、長さが３０～３７ｂｐである増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌ｆｌａｇ遺伝子（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）に対して、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲ識別配列（ＰＡＭ）ＴＴＴＮ及びＴＣＴＮを含む標的配列を検索し、長さが２３ｂｐであるｃｒＲＮＡを設計して調製するｃｒＲＮＡ調製ステップと、
Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸に対してそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すようなＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列を得て、改変されたＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の識別領域が広くなり、ＴＴＴＮとＴＣＴＮの両方を識別することができ、次にｐＥＴ２８ａ発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質を得るＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質調製ステップと、を含む。
ｃｒＲＮＡを含む、長さが３０～３７ｂｐである増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌ｆｌａｇ遺伝子（配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）に対して、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲ識別配列（ＰＡＭ）ＴＴＴＮ及びＴＣＴＮを含む標的配列を検索し、長さが２３ｂｐであるｃｒＲＮＡを設計して調製するｃｒＲＮＡ調製ステップと、
Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸に対してそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すようなＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列を得て、改変されたＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の識別領域が広くなり、ＴＴＴＮとＴＣＴＮの両方を識別することができ、次にｐＥＴ２８ａ発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質を得るＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質調製ステップと、を含む。
上記チフス菌の検査キットの用途は、チフス菌の検査キットをチフス菌の核酸検出に使用することであり、検出ステップは、図１に示すように、
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術（ＲＰＡ）系に添加することにより、温度が３７℃で、時間が３０ｍｉｎである増幅条件で、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系がｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含む）に添加し、温度が３７℃の条件で２５ｍｉｎ反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して、結果を得る検出ステップと、を含み、検出ステップにおける蛍光検出法として、マイクロプレートリーダーを用いて検出反応における蛍光値を測定し、検出の励起光を４８５～５２０ｎｍに設定し、又は、検出産物を波長４８５ｎｍの光源下に置いて直接観察する。
増幅プライマーをリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術（ＲＰＡ）系に添加することにより、温度が３７℃で、時間が３０ｍｉｎである増幅条件で、検体核酸を増幅して、増幅産物を得る増幅ステップと、
増幅産物をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系がｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡ報告システムを含む）に添加し、温度が３７℃の条件で２５ｍｉｎ反応させて、検出産物を得て、蛍光検出法で検出して、結果を得る検出ステップと、を含み、検出ステップにおける蛍光検出法として、マイクロプレートリーダーを用いて検出反応における蛍光値を測定し、検出の励起光を４８５～５２０ｎｍに設定し、又は、検出産物を波長４８５ｎｍの光源下に置いて直接観察する。
蛍光検出を使用する場合、検出系にチフス菌核酸が存在すると、チフス菌特異的ｃｒＲＮＡの媒介下でＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性を特異的に活性化する。活性化されたＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質は、蛍光基及び消光基で標識されたｓｓＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒを切断して、活性化された蛍光基を放出し、マイクロプレートリーダーを使用して蛍光の読み取り値を検出し、又は緑色反応を目視することができる。それに応じて、検体にチフス菌核酸が存在しない場合、蛍光の読み取り値がなく、又は緑色反応を目視しない。
実施例１
実施例１
チフス菌の核酸調製：
チフス菌のｆｌａｇ遺伝子断片は、ＮＣＢＩ ＣＭＣＣ５００７１菌株配列に基づいて増幅プライマーが設計され、南京ジェンスクリプト社により合成され、ｆｌａｇ－ＰＣＲ－Ｆ及びｆｌａｇ－ＰＣＲ－Ｒと命名され、対応する配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８である。
チフス菌のｆｌａｇ遺伝子断片は、ＮＣＢＩ ＣＭＣＣ５００７１菌株配列に基づいて増幅プライマーが設計され、南京ジェンスクリプト社により合成され、ｆｌａｇ－ＰＣＲ－Ｆ及びｆｌａｇ－ＰＣＲ－Ｒと命名され、対応する配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８である。
ＰＣＲによりチフス菌のｆｌａｇ遺伝子に対応するＤＮＡ核酸サンプルを調製した。具体的な操作は、以下のとおりである。疾病対策予防センターからチフス菌の標準菌株（ＣＭＣＣ５００７１）を取得し、菌株に対して蘇生及び増幅を行い、細菌ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ（登録商標））を用いて細菌ゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｈａｎｔａ（登録商標）Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＶａｚｙｍｅＰ５０５）により、チフス菌ゲノムＤＮＡをテンプレートとして対応するｆｌａｇ遺伝子のＤＮＡサンプルｐｃＳ．Ｔｙｐｈｉ－ｆｌａｇを増幅した。さらに、ＭＥＧＡｃｌｅａｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃサーモフィッシャーサイエンティフィック）で精製し、ＤＮＡの質量及び濃度を検出し、使用するまで－２０℃で保存した。
実施例２
実施例２
キットのｃｒＲＮＡの調製及び検出：
ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲに基づいて特定のＰＡＭ ＴＴＴＮ及びＴＣＴＮの標的配列を識別し、ｆｌａｇ遺伝子標的配列に２０本の特異的ｃｒＲＮＡを設計し、配列は、表１に示されている。
ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲに基づいて特定のＰＡＭ ＴＴＴＮ及びＴＣＴＮの標的配列を識別し、ｆｌａｇ遺伝子標的配列に２０本の特異的ｃｒＲＮＡを設計し、配列は、表１に示されている。
ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１～ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ２０の効果を順に検出する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系を表２に示すように設定し、体系にそれぞれ１μＬのｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１～ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ２０を添加し、他の各成分を維持したまま、均一に混合し、３７℃で２５ｍｉｎ反応させて、検出産物を得た。
蛍光検出によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系の検出活性を判定した。全波長マイクロプレートリーダーを用いて検出反応の蛍光を測定し、励起波長が４８５ｎｍであり、発光波長が５２０ｎｍであり、２５ｍｉｎ検出した蛍光値を反応値として読み取った。異なるチフス菌の反応検出結果は、図２に示されている。結果として、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３は、対応するｆｌａｇ遺伝子断片を効率的で特異的に検出することができる。
また、検出産物を、波長４８５ｎｍのレーザランプの下に置き、目視で結果を直接判読することができる。ｃｒＲＮＡが標的核酸断片を特異的に識別した後、反応生成物の色は、無色から蛍光緑に変わり、それに応じて、検体に対応する標的核酸がなければ、反応生成物の色は、依然として無色である。図３に示すように、ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３は、対応するｆｌａｇ遺伝子断片を効率的で特異的に検出することができる。
実施例３
実施例３
キットの増幅プライマーを調製して検出し、設計された増幅プライマーの配列は、表３に示されている。
チフス菌のｆｌａｇ遺伝子断片に対応するＤＮＡ核酸サンプルに基づいて、検出される断片の分子量を計算し、１０倍の勾配希釈を行い、μＬ当たり１＊ｅ４コピー数（ｃｏｐｙ／μＬ）のＤＮＡ試験サンプルを得て、表３の増幅プライマーをそれぞれリコンビナーゼポリメラーゼ増幅技術（ＲＰＡ）系（表４に示す）に添加して、ＤＮＡ試験サンプルを増幅する。
ＤＮＡ核酸サンプル、ｄｄＨ２Ｏ、ＲＰＡ－Ｆ、ＲＰＡ－Ｒ及び反応緩衝液を反応管に添加して溶解して均一に混合し、次に、１μＬの酢酸マグネシウムを添加し、温度が３７℃で、時間が３０ｍｉｎである条件で増幅して、増幅産物を得た。
５μＬの等温増幅産物を２０μＬのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系（表２と同じであり、ｃｒＲＮＡがｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１とｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３を等しい割合で混合したものである）に添加し、均一に混合し、３７℃で３０ｍｉｎ反応させて蛍光結果を判読した。蛍光検出によりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系の検出活性を判定し、マイクロプレートリーダー検出（図４に示す）及び蛍光目視検出（図５に示す）をそれぞれ採用して、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１が対応するｆｌａｇ遺伝子断片を効率的に増幅及び検出することができることを発見した。
ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１を増幅プライマーとして選択した。
実施例４
実施例４
チフス菌の核酸検出の高感度検出：
チフス菌のｆｌａｇ遺伝子断片に対応するＤＮＡ核酸サンプルに基づいて、検出される断片の分子量を計算し、１０倍の勾配希釈を行い、μＬ当たり１＊ｅ６、１＊ｅ５、１＊ｅ４、１＊ｅ３、１＊ｅ２、１＊ｅ１及び１＊ｅ０コピー数（ｃｏｐｙ／μＬ）のＤＮＡ試験サンプルを得た。
チフス菌のｆｌａｇ遺伝子断片に対応するＤＮＡ核酸サンプルに基づいて、検出される断片の分子量を計算し、１０倍の勾配希釈を行い、μＬ当たり１＊ｅ６、１＊ｅ５、１＊ｅ４、１＊ｅ３、１＊ｅ２、１＊ｅ１及び１＊ｅ０コピー数（ｃｏｐｙ／μＬ）のＤＮＡ試験サンプルを得た。
増幅ステップにおいて、表５を増幅系とする。
温度が３７℃で、時間が３０ｍｉｎである増幅条件で、検体核酸を増幅して、増幅産物を得た。
検出ステップ：５μＬの増幅産物を表６に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系に添加し、温度が３７℃の条件で２５ｍｉｎ反応させて、検出産物を得た。
検出ステップ：５μＬの増幅産物を表６に示すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ検出系に添加し、温度が３７℃の条件で２５ｍｉｎ反応させて、検出産物を得た。
マイクロプレートリーダーを用いて検出し、全波長マイクロプレートリーダーを用いて検出反応の蛍光を測定し、励起波長が４８５ｎｍであり、発光波長が５２０ｎｍであり、２５ｍｉｎ検出した蛍光値を反応値として読み取り、結果として、図６に示すように、１＊ｅ１コピーの細菌核酸の高感度を検出することができ、検出産物を波長４８５ｎｍのレーザーランプの下に置いて蛍光目視検出を行い、図７に示すように、１＊ｅ１コピーの細菌核酸の高感度を検出することができる。
実施例５
実施例５
蛍光検出法がチフス菌に対して高い特異的反応を行うことができるか否かを検出し、チフス菌及びサルモネラ菌の他の血清型を効果的に区別することができるか否かを検出するために、以下の検出を行った。
まず、実施例１におけるチフス菌核酸検出セグメントｐｃＳ．Ｔｙｐｈｉ－ｆｌａｇに基づいて、実施例１における方法を参照して、サルモネラ菌の他の血清型に対応する遺伝子配列ＤＮＡサンプル：ｐｃＳ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ－ｆｌａｇ、ｐｃＳ．Ｌｏｎｄｏｎ－ｆｌａｇ、ｐｃＳ．Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ－ｆｌａｇ、ｐｃＳ．Ｗｅｌｔｅｖｒｅｄｅｎ－ｆｌａｇ及びｐｃＳ．Ｄｅｒｂｙ－ｆｌａｇを調製した。
次に、実施例４を参照して、μＬ当たり１＊ｅ４コピー数（ｃｏｐｙ／μＬ）のＤＮＡ試験サンプルを使用して、増幅ステップ及び検出ステップにより検出産物を得た。
マイクロプレートリーダーを用いて検出した結果は、図８に示されており、目視で直接検出した結果は、図９に示されており、蛍光検出法は、チフス菌核酸を高い特異性で検出することができ、サルモネラ菌の他の血清型に対して反応しない。
実施例６
実施例６
臨床的に単離されたチフス菌株に対するチフス菌の核酸検出：
まず、臨床的に単離して保存されたチフス菌株に蘇生増幅を行い、細菌ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）で細菌ゲノムＤＮＡを抽出した。１μＬの臨床株のゲノムＤＮＡに実施例４のような増幅ステップ及び検出ステップを行って、検出産物を得た。
まず、臨床的に単離して保存されたチフス菌株に蘇生増幅を行い、細菌ゲノムＤＮＡ抽出キット（ＴＩＡＮＧＥＮ）で細菌ゲノムＤＮＡを抽出した。１μＬの臨床株のゲノムＤＮＡに実施例４のような増幅ステップ及び検出ステップを行って、検出産物を得た。
マイクロプレートリーダーを用いて検出した結果は、図１０に示されており、目視で直接検出した結果は、図１１に示されており、蛍光検出法は、臨床分離株を効果的に判定することができる。
当業者にとって、以上に説明した技術的解決手段及び構想に基づいて、他の様々な対応する変更及び変形を行うことができ、これら全ての変更及び変形は、いずれも本発明の請求項の保護範囲内に属するべきである。
Claims (5)
- 増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡレポーターシステムを含み、
前記ｃｒＲＮＡがチフス菌ｆｌａｇ遺伝子の検査セグメントに対する特異的ｃｒＲＮＡであり、
前記ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列がＣａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸をそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させた配列であり、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される塩基配列からなり、
前記ｃｒＲＮＡがｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３を含み、前記ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される塩基配列からなり、前記ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される塩基配列からなる、チフス菌の検査キット。 - 前記増幅プライマーがｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２及びｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１を含み、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｆ２の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される塩基配列からなり、ｆｌａｇ－ＲＰＡ－Ｒ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される塩基配列からなる、請求項１に記載のチフス菌の検査キット。
- 前記一本鎖ＤＮＡレポーターシステムが一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒを含み、前記一本鎖ＤＮＡ ＦＱ ｒｅｐｏｒｔｅｒが６－カルボキシフルオレセイン及び蛍光クエンチャーで標識された一本鎖ＤＮＡであり、標識生成物が／５ ６ＦＡＭ／ＴＴＴＡＴＴＴ／３ＢＨＱ １／である、請求項１に記載のチフス菌の検査キット。
- 検査キットが増幅プライマー、ｃｒＲＮＡ、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質、及び一本鎖ＤＮＡレポーターシステムを含み、
増幅プライマーを設計する増幅プライマー調製ステップと、
チフス菌ｆｌａｇ遺伝子に対して、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲ識別配列ＴＴＴＮ及びＴＣＴＮを含む標的配列を検索し、ｃｒＲＮＡを設計して調製し、前記ｃｒＲＮＡがｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１及びｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３を含み、前記ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示される塩基配列からなり、前記ｆｌａｇ－ｃｒＲＮＡ３の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される塩基配列からなる、ｃｒＲＮＡ調製ステップと、
Ｃａｓ１２タンパク質核酸配列に対して原核コドン最適化を行い、５３２位及び５９５位のアミノ酸に対してそれぞれＧ５３２Ｒ及びＫ５９５Ｒに変異させて、ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列を得てから、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターに構築し、可溶性タンパク質の低温誘導発現を行い、親和性精製及び分子ふるい精製によりＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質を得るＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質調製ステップと、を含み、前記ＬｂＣａｓ１２ａ－ＲＲタンパク質の発現配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示される塩基配列からなるチフス菌の検査キットの製造方法。 - 前記増幅プライマーの長さが３０－３７ｂｐである、請求項４に記載のチフス菌の検査キットの製造方法。
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