CN110468222B - 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物。本发明提供了环介导等温扩增的成套引物，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物；所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；所述引物3为序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物；所述引物4为序列表中序列4所示的单链DNA分子或其衍生物。本发明适用采用环介导等温扩增法可对我国斑点热立克次体流行株进行特异性检测，适用于临床标本的快速检测。

Description

一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物。

背景技术

斑点热(Spotted fever)是由斑点热立克次体(spotted fever grouprickettsiae)所致的一类自然疫源性人兽共患病，广泛分布于世界各地，主要包括黑龙江立克次体、立氏立克次体、康氏立克次体、西伯利亚立克次体、小蛛立克次体、澳大利亚立克次体等。蜱是斑点热立克次体主要的传播媒介和保存宿主，可经卵垂直传递，哺乳动物为其自然宿主。立克次体经蜱叮咬进入人体，专性寄生于小血管内皮细胞，引起血管内皮损伤，并通过淋巴道、血流扩散全身，严重感染可引起心、肺、肾等重要脏器功能损伤，以及因循环衰竭而死亡。

我国存在的斑点热主要是由黑龙江立克次体(Rickettsia heilongjiangensis)引起的远东蜱传斑点热(Far Eastern tick-borne spotted fever，FESF)。黑龙江立克次体是1982年从我国黑龙江绥芬河的森林革蜱(Dermacentor sivarum)分得的一斑点热群立克次体新种，感染者可有发热、寒颤、头痛、肌肉关节疼痛以及黄斑或丘疹等症状，目前该病主要流行于我国东北地区，俄罗斯远东地区和日本也有流行。加强斑点热的诊治研究对于我国民生与国防具有重要意义。一方面，斑点热对民众健康威胁日趋严重。近年来随着生活水平的提高，人们旅游或探险活动增加，涉足林区、山区或草甸等自然疫源地的机会也越来越多，斑点热严重威胁旅游服务等职业人群以及旅游者健康。北京多家三甲医院近年来均有斑点热病人确诊。随着我国国际交流迅速发展，携带斑点热立克次体的蜱或动物进入我国的风险正在日益增大，例北京出入境检验检疫局近年来在入境的动物身上检出各种可能携带斑点热立克次体的蜱类。另一方面，斑点热立克次体中致病力最强的立氏立克次体是标准的生物战剂，在我国没有流行，美国、俄罗斯等大国一直开展立氏立克次体的致病性研究，因此斑点热立克次体的检测研究对区分我国主要流行的黑龙江立克次体和斑点热立克次体生物战剂也有重要意义。

目前没有标准化的斑点热立克次体临床诊断方法。传统的外斐实验特异性和敏感性差，只能作为辅助诊断。实验室诊断方法主要有血清学方法和分子生物学方法。血清学诊断以间接免疫荧光为主，然而此方法在发病后1-2周才能检测到特异性抗体，与不同立克次体也存在交叉反应。分子生物学诊断方法准确，现有的基于实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法主要设计斑点热立克次体种特异的qPCR引物和探针进行扩增定量，但需要使用专业仪器，反应时间也较长，且检测的是斑点热立克次体的通用靶基因，不能将黑龙江立克次体单独区分开来，不具有特异性。

环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)能在等温(60-65℃)条件下，短时间内完成核酸大量扩增，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可判断靶基因是否存在，是一种适合现场的、“简便、快速、精确、低价”的基因扩增检测方法。

发明内容

为了检测我国黑龙江热立克次体，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了环介导等温扩增的成套引物。

本发明提供的环介导等温扩增的成套引物，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物；

所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物；

所述引物3为序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生物；

所述引物4为序列表中序列4所示的单链DNA分子或其衍生物。

上述成套引物中，各引物的衍生物为如下1)-3)中任一种：

1)、将各引物的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

2)、与各引物的核苷酸序列具有大于等于85％同源性且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；

3)、各引物核苷酸序列的反向互补序列。

含有上述环介导等温扩增的成套引物的PCR试剂或试剂盒也是本发明保护的范围。

上述PCR试剂中引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比为1:1:8:8；在本发明的实施例中，引物1的浓度为5pmol/L、引物2的浓度为5pmol/L、引物3的浓度为40pmol/L和引物4的浓度为40pmol/L。

上述环介导等温扩增的成套引物或上述的PCR试剂或试剂盒在如下1)-6)至少一种中的应用也是本发明保护的范围：

1)检测或辅助检测黑龙江立克次体；

2)检测或辅助检测待测样本是否感染黑龙江立克次体；

3)检测或辅助检测待测菌体为黑龙江立克次体；

4)制备检测或辅助检测黑龙江立克次体的产品；

5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染黑龙江立克次体的产品；

6)制备检测或辅助检测待测菌体为黑龙江立克次体的产品。

本发明还提供了如下方法：

本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌体是否为黑龙江立克次体的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测斑点热立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为黑龙江立克次体。

上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为黑龙江立克次体方法如下1)-3)中任一种：

1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测菌体为或候选为黑龙江立克次体；

2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测斑点热立克次体为或候选为黑龙江立克次体；

3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测菌体为或候选为黑龙江立克次体。

或，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否感染黑龙江立克次体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测斑点热立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染黑龙江立克次体。

上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染黑龙江立克次体的方法如下：

1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体；

2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体；

3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体。

上述方法中的环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃反应30-90min，再80℃孵育5min终止反应。

所述黑龙江立克次体即为我国斑点热立克次体流行株。

本发明的实验证明，发明人设计合成了环介导等温扩增成套引物，采用环介导等温扩增法对我国黑龙江立克次体进行特异性检测，优点如下：(1)只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业设备；(2)特异性高；(3)灵敏度高；(4)快速且高效，扩增反应在60分钟内即可完成；(5)鉴定方法简单方便；适用于临床标本的快速检测。

附图说明

图1为特异性检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线。

图2为灵敏度检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线。

图3为重复性检测的实时浊度仪扩增结果和扩增曲线。

图4为扩增结束后自然光下目视反应液荧光染料颜色变化。

图5为相同靶序列的不同引物筛选结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中DNeasy Blood&Tissue Kit全基因组提取试剂盒：Qiagen公司。

环介导等温扩增法脱氧核糖核酸扩增试剂盒：北京蓝谱生物科技有限公司。

环介导等温扩增法荧光检测试剂盒：北京蓝谱生物科技有限公司。

环介导等温扩增法专用PCR管：北京蓝谱生物科技有限公司。

仪器LA-320C实时浊度仪：北京蓝谱生物科技有限公司。

下述实施例中部分材料如下：

贝氏柯克斯体(新桥株，文献中记载的名称为coxiella burnetii)在文献“JiaoJ,Xiong X,Qi Y,Gong W,Duan C,Yang X,Wen B.Serological characterization ofsurface-exposed proteins of Coxiellaburnetii.Microbiology.2014Dec；160(Pt12):2718-31.”中公开。

金黄色葡萄球菌(ATCC 6538株)在文献“荧光定量PCR快速检测金黄色葡萄球菌方法的建立，军事医学科学院院刊2010年2月第34卷第1期，25-29,2010.”中公开。

立氏立克次体(R)、西伯利亚立克次体(246)、康氏立克次体(Seven)、小蛛立克次体(Kaplan)、澳大利亚立克次体(Phillips)、马赛立克次体(Mtul)、查菲埃立克体(Sapulpa)、汉赛巴通体(Houston-1)、鼠疫耶尔森菌(EV76)、黑龙江立克次体(054)在文献“实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法建立，解放军医学杂志，第33卷，第11期，1297-1299，2008.”中公开。在符合国家和军队有关规定且经相关部门批准后，公众可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。以下为简便，实施例中的菌没有写菌株名称，但是使用的是上述菌株鉴定。

实施例1、我国黑龙江立克次体专用环介导等温扩增引物及试剂盒的制备

一、我国黑龙江立克次体专用环介导等温扩增引物

根据我国黑龙江立克次体全基因组序列信息设计专用环介导等温扩增引物如下：

F3(序列1)：5’-CGCTACACCGTTAATGAGAG-3’；

B3(序列2)：5’-TGTCGGTTTCTTTTTTTCTTCT-3’；

FIP(序列3)：5’-ATCTTTCCACGCCATTGCCAATTGTTTGTATTTCTCTTTATACTGCTG-3’；

BIP(序列4)：5’-AATTGGGAAAAAAGACTTGGGAAATTTGCTAGTGGCAATAGTGGTAT-3’。

人工合成上述引物，用于实施例2的检测。

二、检测我国黑龙江立克次体的方法的建立

1、提取DNA

提取感染黑龙江立克次体待测样本中基因组DNA。

2、LAMP反应

以上述基因组DNA为模板，用上述一制备的F3、B3、FIP、BIP按照如下表1所示的LAMP反应体系(表1，25μL)加入引物1μL(由F3、B3、FIP、BIP和水混匀得到，其中，F3和B3的浓度均为5pmol/L，BIP和FIP的浓度均为40pmol/L)，2×RM反应混合液(北京蓝谱生物科技有限公司)12.5μL，Bst DNA聚合酶(北京蓝谱生物科技有限公司)1μL，待测DNA 1μL，无核酸酶和脱氧核酶的去离子水6.5μL。以上浓度均为体系中的终浓度。

LAMP反应体系在63℃反应60min，然后80℃5min终止反应(表2)。

表1为LAMP反应体系

组分	体积/μL
		F3、B3、FIP、BIP引物	各1
2×RM反应混合液	12.5
		Bst DNA聚合酶	1
模板DNA	1
		H<sub>2</sub>O	6.5
合计	25

表2扩增反应程序

温度	时间
		63℃	60min
80℃	5min

得到的LAMP反应产物通过如下1)-3)任一种方法判断：

1)、实时浊度仪判断

LAMP反应产物采用实时浊度仪及其配套程序软件实时检测，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，或待测菌体为或候选为黑龙江立克次体；反之则无。

2)、分析反应液的浊度变化

反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与LAMP体系中的金属离子Mg²⁺(或Mn²⁺)结合，从而产生大量焦磷酸镁或焦磷酸锰沉淀。因此可以根据反应液的浊度变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否含靶序列。

若LAMP反应产物浑浊，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，或待测菌体为或候选为黑龙江立克次体；反之则无。

3)、分析荧光染料的颜色变化：

应用本方法进行判断时，LAMP体系中需要另加入钙黄绿素(加入1μL)；反应初始时钙黄绿素与Mg²⁺结合，反应液呈透明橙色，核酸大量合成时，生成的焦磷酸根使使得Mg²⁺游离出来，钙黄绿素和Mn²⁺结合，反应液显示浑浊的黄绿色。因此可以根据反应液中荧光染料颜色变化判断是否有核酸大量合成，从而判断模板是否为靶序列。

若反应产物由透明橙色变为浑浊的黄绿色，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，或待测菌体为黑龙江立克次体；反之则无。

三、检测黑龙江立克次体的试剂盒的构建

将上述一的F3、B3、FIP、BIP引物单独包装，作为检测黑龙江立克次体的试剂盒的组分。

或将上述一中的LAMP反应体系中除去模板DNA的其他试剂，作为检测黑龙江立克次体的试剂盒的组分。

实施例2、黑龙江立克次体专用检测引物的应用

一、立克次体基因组DNA的制备

取黑龙江立克次体感染的鸡胚卵黄囊膜，加入PBS进行研磨；采用差速离心法联合泛影葡胺密度梯度离心纯化黑龙江立克次体，纯化后的菌体用DNeasy Blood&Tissue Kit提取全基因组DNA(具体方法见该试剂盒说明书)，得到黑龙江立克次体基因组DNA。

最后用Nanodrop1000测定提取的菌体DNA的浓度(ng/μL)，计算所纯化的黑龙江立克次体的菌体拷贝数浓度(个基因组/μL)。

使用纯水将提取的菌体DNA进行梯度稀释(浓度分别为1×10⁶个基因组/μL、1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL)。

纯水为阴性对照。

提取11种非黑龙江立克次体的基因组DNA，分别如下：贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、澳大利亚立克次体、马赛立克次体、查菲埃立克体、汉赛巴通体、鼠疫耶尔森菌。

二、专用引物检测我国黑龙江立克次体(实时浊度仪法)

1、特异性检测

用实施例1二的方法对11种非黑龙江立克次体DNA和黑龙江立克次体基因组DNA进行LAMP产物，得到LAMP反应产物。

11种非黑龙江立克次体分别如下：贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、澳大利亚立克次体、马赛立克次体、查菲埃立克体、汉赛巴通体、鼠疫耶尔森菌。所有反应均在专用离心管中进行。

实时浊度仪(LA-320C)检测LAMP反应产物，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，反之则无。

结果见图1(上图1-8分别是贝氏柯克斯体、立氏立克次体、西伯利亚立克次体、康氏立克次体、金黄色葡萄球菌、小蛛立克次体、澳大利亚立克次体和马赛立克次体，下图1-5分别是查菲埃立克体、汉赛巴通体、鼠疫耶尔森菌、黑龙江立克次体和阴性对照)，其中A为扩增结果，B为对应的扩增曲线；可见只有在扩增黑龙江立克次体DNA时，才出现明显扩增曲线，其他样本DNA扩增为阴性；说明本发明的引物和方法的特异性好，特异检测黑龙江立克次体，与其他斑点热立克次体无交叉。

2、灵敏度检测

用实施例1二的方法对上述一中黑龙江立克次体DNA(1×10⁶个基因组/μL、1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL)进行LAMP反应。

实时浊度仪检测LAMP反应产物，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，反之则无。

结果见图2(其中1-8分别为1×10⁶个基因组/μL、1×10⁵个基因组/μL、1×10⁴个基因组/μL、1×10³个基因组/μL、1×10²个基因组/μL、1×10¹个基因组/μL、1×10⁰个基因组/μL和阴性对照)，A为扩增结果，B为对应的扩增曲线。模板DNA拷贝数为1×10¹个基因组/μL可见明显扩增曲线，说明本发明的引物和方法的灵敏度为1×10¹个基因组/反应体系。

3.重复性检测

用实施例1二的方法对黑龙江立克次体DNA(1×10⁶个基因组/μL)，重复检测6次。

实时浊度仪检测LAMP反应产物，若实时浊度仪上观察到典型的扩增曲线，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体，反之则无。

结果见图3(其中1-6均为1×10⁶个黑龙江立克次体基因组DNA，7为阴性对照)，A为扩增结果，B为对应的扩增曲线；可见6次重复均检测到明显扩增曲线，说明本发明的引物和方法的重复性较好。

实施例3、专用引物检测我国黑龙江立克次体(目视荧光染料颜色变化)

用实施例1二的方法检测黑龙江立克次体DNA，反应体系额外直接加入试剂盒内含钙黄绿素(环介导等温扩增法荧光检测试剂盒，北京蓝谱生物科技有限公司，LMP221)1μL，模板DNA分别为5份黑龙江立克次体感染的鸡胚卵黄囊膜提取的DNA。以正常鸡胚卵黄囊膜提取的DNA为阴性对照。

若反应产物由透明橙色变为浑浊的黄绿色，则表明待测样本感染或候选感染黑龙江立克次体；反之则无。

结果见图4，前5管为5份黑龙江立克次体感染的鸡胚卵黄囊膜提取的DNA，其荧光染料颜色均变为黄绿色；最后1管为阴性对照，颜色没有发生变化。

对比例：相同靶序列的不同引物筛选

本发明采用相同的靶序列同时设计如下对照引物：

hlj2-F3 TGCATATCCTTTTTAATCGAGTT

hlj2-B3 CCATAATAAAAAGTTTTACTACCGC

hlj2-FIP GCTCGCTATGTGTAAAATGAAATGATTCCGCAGTCAACTTATGGTT

hlj2-BIP TTACAATGCCCAAAGAAGGTCATTCATAAGATGCTATTAATACTAAGCC

以实施例2中的黑龙江立克次体基因组DNA为模板，用实施例中的F3、B3、FIP、BIP和对照引物进行LAMP反应，方法和体系同实施例2。

结果如图5所示，A为扩增结果，1为实施例1的F3、B3、FIP、BIP，2为对比引物，2组引物都有扩增；B为扩增曲线，左边的曲线为实施例1的F3、B3、FIP、BIP扩增结果，右边的曲线为对照引物扩增结果；可见实施例1的F3、B3、FIP、BIP在26min左右有大量扩增，而对照引物在53min时才见大量扩增。

因此，实施例1的F3、B3、FIP、BIP引物组比对照引物扩增效果好。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cgctacaccg ttaatgagag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tgtcggtttc tttttttctt ct 22

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atctttccac gccattgcca attgtttgta tttctcttta tactgctg 48

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

aattgggaaa aaagacttgg gaaatttgct agtggcaata gtggtat 47

Claims (6)

1.环介导等温扩增的成套引物，由如下引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述引物4为序列表中序列4所示的单链DNA分子。

2.含有权利要求1所述环介导等温扩增的成套引物的PCR试剂或试剂盒。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：

所述PCR试剂中引物1、引物2、引物3和引物4的摩尔比为1:1:8:8。

4.权利要求1所述环介导等温扩增的成套引物或权利要求2所述的PCR试剂或试剂盒在制备检测或辅助检测黑龙江立克次体的产品中的应用。

5.权利要求1所述环介导等温扩增的成套引物或权利要求2所述的PCR试剂或试剂盒在制备检测或辅助检测待测样本是否感染黑龙江立克次体的产品中的应用。

6.权利要求1所述环介导等温扩增的成套引物或权利要求2所述的PCR试剂或试剂盒在制备检测或辅助检测待测菌体为黑龙江立克次体的产品中的应用。

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