CN110846440B - 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 - Google Patents

一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110846440B
CN110846440B CN201911292171.5A CN201911292171A CN110846440B CN 110846440 B CN110846440 B CN 110846440B CN 201911292171 A CN201911292171 A CN 201911292171A CN 110846440 B CN110846440 B CN 110846440B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
virus
eapv
primer pair
passion flower
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911292171.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110846440A (zh
Inventor
谢丽雪
李韬
张立杰
郑姗
张小艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences filed Critical Pomology Research Institute Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201911292171.5A priority Critical patent/CN110846440B/zh
Publication of CN110846440A publication Critical patent/CN110846440A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110846440B publication Critical patent/CN110846440B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用。所述成套引物对由引物对1‑引物对7组成，7个引物对的核苷酸序列如序列1‑14所示。所述东亚西番莲病毒全基因组测序是以感染东亚西番莲病毒样品的RNA为模板，利用7个引物对进行RT‑PCR扩增与测序。本发明的方法不仅可用于东亚西番莲病毒全基因组的扩增与测序，而且还可用于东亚西番莲病毒的快速检测与鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点。本发明也为东亚西番莲病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段，对于防控东亚西番莲病毒、保护西番莲生产安全具有重要意义。

Description

一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用，适用于在农业生产和口岸植物检疫中东亚西番莲病毒的检测鉴定。
背景技术
西番莲(Passiflora edulia Sims)是一种芳香可口的水果，不仅具有较高的营养价值，同时还具有很高的经济价值。病毒病作为西番莲生产上的第二大病害，对西番莲的产量和品质造成了较大影响。东亚西番莲病毒属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员，为单链正义RNA病毒。该病毒是目前已明确报道能引起西番莲木质化病的主要病原之一，侵染西番莲后引起叶片花叶，果实斑驳、畸形和木质化等一系列症状。由于为害症状和血清学特性与西番莲上另一种为害较大的西番莲木质化病毒相近，早期一直被认为是PWV的一个株系，但其基因组的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列与PWV的一致性低于马铃薯Y病毒属的判断标准，因此被认定为一种新的病毒。
东亚西番莲病毒引起的西番莲木质化病造成的损失巨大，严重威胁西番莲的生产安全，但迄今为止尚无有效的防治药剂。加强病毒检测、及时采取防控措施是当前防治东亚西番莲病毒的主要途径。采用传统的鉴别寄主接种、血清学检测和电镜观察方法检测鉴定东亚西番莲病毒存在较大的局限性，无法对该病毒进行快速、准确鉴定，易出现假阴性或假阳性结果。RT-PCR检测东亚西番莲病毒具有特异性强、灵敏度高的优点，但已报道的方法主要针对某个基因片段，如CP基因序列进行检测和分析(谢丽雪等，园艺学报,2018,45(8)：1587～1594)。RNA植物病毒变异速度快，单个基因片段仅仅是东亚西番莲病毒全基因组的一部分，若该基因片段发生了较大的变异，仍有可能无法对该病毒进行准确检测，因此基于东亚西番莲病毒全基因组序列的鉴定方法更准确、更可靠。同时，东亚西番莲病毒全基因组的获得，对于进一步研究该病毒基因组结构和功能，科学防控东亚西番莲病毒、保护西番莲生产安全具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种东亚西番莲病毒全基因组测序和检测鉴定的方法，以实现快速、准确地检测鉴定东亚西番莲病毒，满足农业生产和口岸植物检疫的需要。
本发明首先保护用于东亚西番莲病毒全基因组测序和检测鉴定的成套引物对。
所述成套引物对由引物对1-引物对7组成；
所述引物对1由EAPV-S1-F和EAPV-S1-R组成；
所述引物对2由EAPV-S2-F和EAPV-S2-R组成；
所述引物对3由EAPV-S3-F和EAPV-S3-R组成；
所述引物对4由EAPV-S4-F和EAPV-S4-R组成；
所述引物对5由EAPV-S5-F和EAPV-S5-R组成；
所述引物对6由EAPV-S6-F和EAPV-S6-R组成；
所述引物对7由EAPV-S7-F和EAPV-S7-R组成；
所述EAPV-S1-F为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S1-R为如下a3)或a4)：
a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S2-F为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S2-R为如下b3)或b4)：
b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S3-F为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S3-R为如下c3)或c4)：
c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S4-F为如下d1)或d2)：
d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S4-R为如下d3)或d4)：
d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S5-F为如下e1)或e2)：
e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；
e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S5-R为如下e3)或e4)：
e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；
e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S6-F为如下f1)或f2)：
f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；
f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S6-R为如下f3)或f4)：
f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；
f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S7-F为如下g1)或g2)：
g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；
g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的单链DNA分子；
所述EAPV-S7-R为如下g3)或g4)：
g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；
g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的单链DNA分子。
所述成套引物对的用途为如下M1)-M12)中任一种：
M1)制备克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组的产品；
M2)克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组；
M3)制备获得东亚西番莲病毒全基因组序列的产品；
M4)获得东亚西番莲病毒全基因组序列；
M5)制备东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定的产品；
M6)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
M7)制备检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的产品；
M8)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
M9)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的产品；
M10)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
M11)制备东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究的产品；
M12)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
上述成套引物对在上述M1)-M12)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护含有上述成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下N1)-N6)中任一种：
N1)克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组；
N2)获得东亚西番莲病毒全基因组序列；
N3)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
N4)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
N5)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
N6)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
进一步的，所述试剂盒还可包括提取东亚西番莲病毒RNA的试剂、反转录获得cDNA的试剂、PCR扩增东亚西番莲病毒全基因组序列的试剂。
更进一步的，所述提取东亚西番莲病毒RNA的试剂可包括TrizoL试剂。
所述反转录获得cDNA的试剂可包括5×RT Buffer、dNTPs、RNasin、M-MuLV反转录酶。
所述PCR扩增东亚西番莲病毒全基因组序列的试剂可包括10×PCR Buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶。
本发明还保护一种获得东亚西番莲病毒全基因组序列的方法。
本发明提供的获得东亚西番莲病毒全基因组序列的方法包括如下步骤：
P1)以东亚西番莲病毒或感染东亚西番莲病毒的样品的cDNA为模板，分别采用上述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7进行PCR扩增，分别得到扩增产物1、扩增产物2、扩增产物3、扩增产物4、扩增产物5、扩增产物6和扩增产物7；
P2)对所述P1)获得的各个扩增产物进行测序，分别得到扩增产物1序列、扩增产物2序列、扩增产物3序列、扩增产物4序列、扩增产物5序列、扩增产物6序列和扩增产物7序列，并将所述扩增产物1序列、所述扩增产物2序列、所述扩增产物3序列、所述扩增产物4序列、所述扩增产物5序列、所述扩增产物6序列和所述扩增产物7序列进行比对分析和拼接，获得所述东亚西番莲病毒全基因组序列。
上述方法中，所述P1)中，所述cDNA是以东亚西番莲病毒或感染东亚西番莲病毒的样品的RNA为模板进行反转录得到的。
所述反转录的具体步骤如下：以东亚西番莲病毒或感染东亚西番莲病毒的样品的RNA(3μL)为模板，加入Random Primer(1μL)和ddH2O(7μL)后先70℃保温10min，然后迅速冰浴5min，再加入5×RT Buffer(5μL)、dNTPs(10mmol·L-1，2μL)、RNasin(40U·μl-1，1μL)和M-MuLV反转录酶(200U·μl-1，1μL)，最后42℃保温1h、70℃保温10min合成cDNA。
所述P2)中，采用直接测序法对所述扩增产物1序列和所述扩增产物7序列进行测序；采用克隆测序法对所述扩增产物2序列、所述扩增产物3序列、所述扩增产物4序列、所述扩增产物5序列和所述扩增产物6序列进行测序。所有扩增产物序列均采用双向测序。
采用DNAMAN软件进行比对分析和拼接。
本发明还保护一种检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的方法。
本发明保护的检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的方法包括如下步骤：
Q1)按照上述获得东亚西番莲病毒全基因组序列的方法获得待测病毒的全基因组序列；
Q2)将所述全基因组序列进行BLAST分析，确定待测病毒是否为东亚西番莲病毒。
所述Q2)中，确定待测病毒是否为东亚西番莲病毒的方法可按照国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒种类的划分标准进行，即若待测病毒的全基因组序列与GenBank中的某东亚西番莲病毒全基因组序列的一致性高于76％，则待测病毒为东亚西番莲病毒。
本发明还保护一种检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的方法。
本发明保护的检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的方法包括如下步骤：
S1)按照上述获得东亚西番莲病毒全基因组序列的方法获得待测样品的全基因组序列；
S2)将所述全基因组序列进行BLAST分析，确定待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒。
所述S2)中，确定待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的方法可按照国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒种类的划分标准进行，即若待测样品的全基因组序列与GenBank中的某东亚西番莲病毒全基因组序列的一致性高于76％，则待测样品感染或携带东亚西番莲病毒。
上述任一所述方法中，所述PCR扩增的反应体系(总体积为25μL)如下：10×PCRBuffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，上游引物(10μmol/L)1μL、下游引物(10μmol/L)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，cDNA2μL，ddH2O 16.25μL。所述上游引物和所述下游引物分别为所述引物对1中的EAPV-S1-F与EAPV-S1-R、所述引物对2中的EAPV-S2-F与EAPV-S2-R、所述引物对3中的EAPV-S3-F与EAPV-S3-R、所述引物对4中的EAPV-S4-F与EAPV-S4-R、所述引物对5中的EAPV-S5-F与EAPV-S5-R、所述引物对6中的EAPV-S6-F与EAPV-S6-R或所述引物对7中的EAPV-S7-F与EAPV-S7-R。每个引物对中的各条引物在所述扩增体系中的终浓度均为0.4μmol/L。
所述PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性3min，94℃变性30s；(51～56)℃退火(30～50)s；72℃延伸(1～2)min，35个循环；72℃保温10min。
进一步的，采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的退火温度分别为53℃、53℃、53℃、55℃、51℃、52℃和56℃；
采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的退火时间分别为30s、45s、45s、45s、50s、50s和30s；
采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的延伸时间分别为1min、2min、2min、2min、2min、2min和1min。
更进一步的，所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7的扩增片段大小依次为624bp、1985bp、1983bp、2073bp、2144bp、2148bp和613bp。
上述任一所述方法中，所述感染东亚西番莲病毒的样品或待测样品为感染东亚西番莲病毒的西番莲(叶片)，所述西番莲具体来自中国台湾或中国福建。
所述来自中国福建的西番莲中携带的东亚西番莲病毒的全基因组序列如序列15所示。所述来自中国台湾的西番莲中携带的东亚西番莲病毒的全基因组序列如序列16所示和序列17所示。本发明获得的东亚西番莲病毒全基因组序列的全长为10,065bp，包括P1、HC-Pro、P3、PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP共11个蛋白编码基因。
序列15或序列16或序列17所示的东亚西番莲病毒全基因组序列及其在如下S1)-S8)中任一所述的应用也均属于本发明的保护范围：
S1)制备东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定的产品；
S2)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
S3)制备检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的产品；
S4)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
S5)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的产品；
S6)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
S7)制备东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究的产品；
S8)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
上述任一所述应用或试剂盒或方法或东亚西番莲病毒全基因组序列中，所述东亚西番莲病毒为东亚西番莲病毒西番莲分离物。所述东亚西番莲病毒西番莲分离物具体为东亚西番莲病毒中国福建西番莲分离物或东亚西番莲病毒中国台湾西番莲分离物。
与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：
1、本发明经过反复设计、测试和优化，筛选出了扩增片段覆盖了东亚西番莲病毒基因组RNA全长序列的成套引物对，有效解决了该病毒全基因组直接一步扩增困难的问题，且各对引物扩增的片段之间相互重叠，重叠部分既验证了扩增片段的准确性，又便于全基因组序列的快速拼接，显著提高了获得东亚西番莲病毒全基因组序列的效率，节约了检测周期。
2、本发明利用东亚西番莲病毒全基因组序列进行该病毒的检测鉴定，与传统的利用某个基因片段检测方法相比，序列涵盖的信息量更全，因此检测鉴定结果更加准确、可靠。与此同时，7个引物对的特异性确保了检测鉴定结果的特异性。
3、由于东亚西番莲病毒常与其他病毒复合侵染西番莲，其分离纯化极其困难，很难利用提纯的病毒提取病毒RNA进行全基因组的扩增。本发明直接以西番莲感病叶片为材料，无需进行繁琐的病毒分离纯化，提取病叶总RNA后即可通过RT-PCR扩增获取东亚西番莲病毒全基因组，具有操作简便、省时省力和灵敏度高的优点。
本发明提供了一种东亚西番莲病毒全基因组测序和检测鉴定方法。本发明所述方法是利用7对特异性引物作为扩增的上下游引物，以感染东亚西番莲病毒的植株为材料，提取其总RNA作为模板进行RT-PCR扩增与测序，7对特异性引物的核苷酸序列如序列1-14所示。本发明测序获得的东亚西番莲病毒全基因组大小为10,065bp，包含P1、HC-Pro、P3、PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP共11个蛋白编码基因。本发明的7个引物对不仅可用于东亚西番莲病毒全基因组的扩增与测序，而且还可用于东亚西番莲病毒的快速检测与鉴定，具有操作简便、特异性强、灵敏度高和准确性好的优点。本发明也为东亚西番莲病毒的进化分析、分子流行病学研究及科学防控提供了有力的技术手段，对于防控东亚西番莲病毒、保护西番莲生产安全具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1的各引物对扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：DNA分子量标准(DL2000)；1-7分别为基因组扩增引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R的扩增片段。
图2为实施例2的东亚西番莲病毒中国福建分离物各引物对扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M：DNA分子量标准(DL2000)；1-7分别为基因组扩增引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R的扩增片段。
图3为实施例2的东亚西番莲病毒中国福建分离物全基因组结构图谱。其中，除PIPO基因竖线上数字表示该基因的起始和终止核苷酸位置外，其余各基因竖线上数字表示起始核苷酸位置。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、用于扩增东亚西番莲病毒全基因组的成套引物对的设计及扩增条件的优化
一、用于扩增东亚西番莲病毒全基因组的成套引物对的设计
利用马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用引物扩增获得的序列和目前已发表的东亚西番莲病毒基因序列，设计东亚西番莲病毒全基因组扩增和测序引物，引物序列如表1所示。
表1、东亚西番莲病毒全基因组扩增和测序引物
Figure GDA0003819526480000071
Figure GDA0003819526480000081
Figure GDA0003819526480000091
注：F表示上游引物，R表示下游引物
经过反复设计、测试和优化，筛选出7对用于克隆东亚西番莲病毒全基因组的成套引物对，该成套引物对由如下7个引物对：EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R组成，各对引物扩增片段之间有长短不等的重叠，引物信息具体见表1。
二、用于扩增东亚西番莲病毒全基因组的成套引物对的扩增条件优化
1、样品总RNA的提取
以感染东亚西番莲病毒的西番莲叶片为材料，称取0.1g，加入TrizoL试剂后按常规方法提取总RNA。提取得到的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测合格后-80℃保存备用。
2、RT-PCR扩增
1)反转录：以提取的样品总RNA 3μL为模板，加入Random Primer 1μL、ddH2O 7μL后先70℃保温10min，然后迅速冰浴5min，再加入5×RT Buffer 5μL、dNTPs(10mmol·L-1)2μL、RNasin(40U·μl-1)1μL和M-MuLV反转录酶(200U·μl-1)1μL，最后42℃保温1h、70℃保温10min合成cDNA。反转录所使用试剂均购自Promega公司。
2)PCR扩增：以步骤1)反转录获得的cDNA为模板，分别采用步骤一中设计的7个引物对对东亚西番莲病毒全基因组进行分段扩增。
每对引物分别在不同的退火温度(51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃)、不同的退火时间(30s、35s、40s、45s、50s)、不同的延伸时间(1min、2min)条件下进行扩增。
每次PCR扩增的反应体系(总体积为25μL)均为：10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，上游引物(10μmol/L)1μL、下游引物(10μmol/L)1μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，cDNA 2μL，ddH2O 16.25μL。PCR所使用试剂均购自TaKaRa公司。
每次PCR扩增的反应条件均为：94℃预变性3min，94℃变性30s；51～56℃退火30～50s；72℃延伸1～2min，35个循环；72℃保温10min。
3、电泳
PCR扩增结束后，取PCR产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过凝胶成像系统观察并记录实验结果。
结果如图1所示，结果表明：引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R扩增片段大小依次约为624bp、1985bp、1983bp、2073bp、2144bp、2148bp和613bp。
引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R的最佳退火温度分别为53℃、53℃、53℃、55℃、51℃、52℃和56℃，最佳退火时间分别为30s、45s、45s、45s、50s、50s、30s，最佳延伸时间分别为1min、2min、2min、2min、2min、2min和1min。
实施例2、东亚西番莲病毒中国福建分离物全基因组测序方法
1、样品总RNA的提取
取感染东亚西番莲病毒的西番莲叶片(中国福建)0.1g，加入TrizoL试剂后按常规方法提取总RNA，并经琼脂糖凝胶电泳检测，获得质量较好的总RNA 50μL。
2、全基因组RT-PCR扩增
1)反转录：以提取的样品总RNA 3μL为模板，加入Random Primer 1μL、ddH2O 7μL后先70℃保温10min，然后迅速冰浴5min，再加入5×RT Buffer 5μL、dNTPs(10mmol·L-1)2μL、RNasin(40U·μl-1)1μL和M-MuLV反转录酶(200U·μl-1)1μL，最后42℃保温1h、70℃保温10min合成cDNA。
2)PCR扩增：以步骤1)反转录获得的cDNA为模板，分别采用实施例1步骤一中设计的7个引物对对东亚西番莲病毒全基因组进行分段扩增。每个引物对分别按照实施例1步骤二中的扩增体系和最佳的扩增条件进行扩增。
3、电泳
PCR扩增结束后，取PCR产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过凝胶成像系统观察并记录实验结果。
结果如图2所示，结果表明：引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R依次扩增出大小约624bp、1985bp、1983bp、2073bp、2144bp、2148bp和613bp的目的片段。
4、全基因组序列的获得
引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R扩增出的目的片段采用直接测序法进行测序，引物对EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R和EAPV-S6-F/EAPV-S6-R扩增出的目的片段采用克隆测序法进行测序。测序均委托大连TaKaRa公司完成。所有片段序列均采用双向测序。
测定的序列采用DNAMAN软件进行比对分析和拼接，获得了全长为10,065bp的东亚西番莲病毒中国福建分离物全基因组序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，包括P1、HC-Pro、P3、PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa、NIb和CP共11个蛋白编码基因。该分离物全基因组结构的组成和图谱分别见表2和图3。将获得的东亚西番莲病毒中国福建分离物全基因组序列进行BLAST分析，结果发现与GenBank上已发表的东亚西番莲病毒中国台湾分离物(GenBank登录号：KP114136)的核苷酸序列高度一致，序列一致性达98.5％。
表2、东亚西番莲病毒福建分离物全基因组结构
Figure GDA0003819526480000101
Figure GDA0003819526480000111
实施例3、中国台湾西番莲样品中东亚西番莲病毒的检测与鉴定
1、样品总RNA的提取
以中国台湾进境西番莲中2份疑似感染东亚西番莲病毒的样品(编号TW-1和TW-2)为材料，分别称取0.1g，加入TrizoL试剂后按常规方法提取总RNA，并经琼脂糖凝胶电泳检测，获得质量较好的总RNA各50μL。
2、全基因组RT-PCR扩增
1)反转录：以提取的样品总RNA 3μL为模板，加入Random Primer 1μL、ddH2O 7μL后先70℃保温10min，然后迅速冰浴5min，再加入5×RT Buffer 5μL、dNTPs(10mmol·L-1)2μL、RNasin(40U·μl-1)1μL和M-MuLV反转录酶(200U·μl-1)1μL，最后42℃保温1h、70℃保温10min合成cDNA。
2)PCR扩增：分别采用实施例1步骤一中设计的7对引物对对东亚西番莲病毒全基因组进行分段扩增。每个引物对分别按照实施例1步骤二中的扩增体系和最佳的扩增条件进行扩增。
3、电泳
PCR扩增结束后，取PCR产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过凝胶成像系统观察并记录实验结果。
结果表明：引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R、EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R、EAPV-S6-F/EAPV-S6-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R从TW-1和TW-2样品上均依次扩增出大小约624bp、1985bp、1983bp、2073bp、2144bp、2148bp和613bp的目的片段。
4、测序和鉴定
引物对EAPV-S1-F/EAPV-S1-R和EAPV-S7-F/EAPV-S7-R扩增出的目的片段采用直接测序法进行测序，引物对EAPV-S2-F/EAPV-S2-R、EAPV-S3-F/EAPV-S3-R、EAPV-S4-F/EAPV-S4-R、EAPV-S5-F/EAPV-S5-R和EAPV-S6-F/EAPV-S6-R扩增出的目的片段采用克隆测序法进行测序。测序均委托大连TaKaRa公司完成。所有片段序列均采用双向测序。测定的序列经比对分析和拼接，分别获得了TW-1和TW-2的东亚西番莲病毒全基因组序列，TW-1和TW-2的东亚西番莲病毒全基因组序列分别如序列表中的序列16和序列17所示。BLAST分析结果表明，TW-1和TW-2的全基因组序列与GenBank上已发表的东亚西番莲病毒中国台湾分离物(GenBank登录号：KP114136)核苷酸序列一致性均达到98％以上。通过对东亚西番莲病毒全基因组的检测鉴定，确认了上述2份中国台湾进境西番莲样品(TW-1和TW-2)均携带有东亚西番莲病毒。
序列表
<110>福建省农业科学院果树研究所
<120>一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用
<160>17
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
catctcataa agacataaca ga 22
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
ttttgcctct actgtcacac 20
<210>3
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
ctggaaccgc tacaatcact aagattttgc ctctactgtc acac 44
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
caatgagcca atagcaagtt tcct 24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
gatgcgctta gggtgttcag aaac 24
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>6
aatagcatcg cttctttcag tgtc 24
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>7
acgatggcgt ccttcacaga acac 24
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>8
taactgtgcc ttcgcttgct gtag 24
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>9
gcacgcatac ctttctacgc acat 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>10
actattggct tgttgtattt gaag 24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>11
tgatgaacag cccagagagg aatt 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>12
tcaactaacg gcttcaatgg gtat 24
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>13
aaatgctcag ccaacattga gac 23
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>14
aggacaacaa acgttgccaa 20
<210>15
<211>10065
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>15
catctcataa agacataaca gaaatcgatc aaacaatttc tcagtctctc agtttacagc 60
aatctttgca aacacacgaa tcacaaactc agtttcataa ctttcaacaa gaattttctc 120
tttattccat actttcaaac attctcaatg gcaggaattg tgttcggaag tttctctcct 180
ctaatactag agaagaaaac tgtgaaggct aagcggttgg ttcctggaac tgctacaatc 240
actaagatgc gggtggaaac tgtgcccgtg aatgttatga aggaggtctc aattggatgc 300
tctgataggt gtggcgggct gtgcgcatac accaaaactt ctctccgacg tgctattaag 360
gagggagacc tgacaagttc tggtgcttgt catcactgtg gccttcatgg ccttgtgggt 420
gaggggcgcc cacgaactca gctggtacca tttcttgaat atcaacagaa ggaagtacca 480
tacactgaag tggcacaaac aatggtggaa gaggaatatg aaatggaggt gccagtttat 540
ggcaaaatat tccccataga ggaggttgca tctgaagcaa ccagagccct ttctgttgca 600
acgcgtgtga cagtagaggc aaaaatgatg gccactgaaa agccatcaat tcaacaagtc 660
tctggcaagc tgaggagaca gagtgcgatt gaaattgcgc agtacaatgc gcaaattgct 720
gcgatggacg agttcctcca gaagaattct gatctggaga ggcgcctttt tatcaataaa 780
tacagtccag tccaacagaa aaagagtggg gctgtttgca tacgtcacct aacgtatgaa 840
caggcaatga ggcgcaagga aaggcatgac aaagagaaag aagccgacaa gaaattctgg 900
gcaggagagt atgaggtcaa agtcggccat gtccaacttc ctactacttt aaacacaagt 960
ggtcgagttg gtttcagaag tgagttctac acaaggactt acaagcagcg taaatcccca 1020
caacaagcga aaaatttcat aatcgacaaa ggcgcgcttg acaaagtcct ccgacttgca 1080
aagcaacttt cattgcctat tgaatttata ggcaagagga gacagcaggc catcaaggcc 1140
acatttgtta agaggggaac taacactctt ccacaagtgt atttgcctca tgctgatggc 1200
atatacaaaa acagagagct caacctagaa catgtggata acacgctttc tgtgctgtgc 1260
aaacatgtga aaatgagcca tttgaaagat gagcaaatca agcgtggtga tagtgggtta 1320
gtgtttgatg agcgctcaca aattacaagg gataatacgg caatgccata ttttgtaatt 1380
cgtggacggt gcaatggaaa gttggttaat gctcttgatt tcatcaaaga aaaagagagt 1440
gttgtgcact actcacaaac acctgaggct caatttttcg caggatggaa gaaggttttt 1500
gataggatgg tgccacacat tgagccacac acttgcacag ttgatttcgc gaatgctcaa 1560
tgtggggagg ttgctgcaac aataagccag acacttttcc ctgtgaggaa gctatcttgc 1620
ctctcttgta ggaaacattt acaggcaatg ggttgggaag gatacaaaca actcctcgca 1680
gcacacttag attattgcag caccattctg caagaaaagg acagagcact tgggtttgag 1740
ctggtggaga agttggtatt gcaggtaaca aagggaaata caaatcttga atcgtcaatg 1800
gagatagtca ggttaactca gaattatacc actactccaa tgttacagat tcaggatatc 1860
aacaaagcgc tcacgaaagg atcatcagtt acacagcaag agctggatca ggcaacaaaa 1920
cagttgcttg aaatgacccg ctggtggaag aaacacatga acttgactga tgaagatgcg 1980
cttagggtgt tcagaaacaa gagatcctca aaagcactat taaatccaag cttgctctgc 2040
gataatcaat tagaccgtaa tggaaatttt gtgtggggtg aaaggggcaa acattcaaag 2100
cggttctttg caaatttctt cgaggaagtg gtcccttcag gaggatatgg caagtatgta 2160
gtgcgacgta atccaaatgg ccaaaggaaa cttgctattg gctcattgat tgtaccattg 2220
gatttcgatc gtgctaggct agcattgcag ggtgaaagca taacaaggga gtcattgact 2280
atggcatgca tttctagaca aaagaataat tttatatacc cttgttgctg tgtcacacat 2340
gacgacggta cgccgcttta ctccgacctt aaaagcccaa caaagaggca cttggtcgtt 2400
ggatcatcag gggacccaaa gtacattgat ctaccagccg aagacacaga tcgcatgtac 2460
attgcaaaag aaggctattg ttacttgaac atttttctgg ctatgcttgt taatgttaat 2520
gagcaggatg caaaagactt cacaaaaatg gtcagagatg taattgttcc gcgacttggg 2580
aagtggcctt caatgatgga tgtggcaaca gctgcgtaca ttcttacagt atttcatcct 2640
gaaacgcgca atgctgaatt acctagaatt ttagtagatc atgctgctca aacaatgcat 2700
gtgattgatt catttggttc cttgacagtt ggttatcaca ttttgaaagc agggaccatt 2760
aatcaattga tacaatttgc atcaaatgat ctactggggg agatgaaatt ttataaggtt 2820
ggaggaatgg tggagcaaag aatgaagtgt gaaacagccc tgatctccag catatttaaa 2880
cccaaaagga tgattcaaat cttggaagat gacccatata tccttctcct tggtatgatt 2940
tcaccatcgg tgctaatcca tatgtaccgt atgcgtcatt ttgagaaggg tatacaaaca 3000
tggatcagta aggaccagaa tgtgacaaaa atttttatca ttatggagca gttgacaagg 3060
aagcttgcag tgaatgacat tctgctcaac caactgcaaa ttatttctgg ttcttcaggg 3120
catcttttgg aattgctgat ggattgccca tcacaatcac actcatacaa gccggctcta 3180
gacctgttga gccagtttct tgagagagat gtcacgaaca gacaattgag tgacaatggg 3240
tttgttgata tcaatgaaag cctctacgta gaaatggaaa aaatctatgt agaaaggtta 3300
aagcaggagt ggcacgcgct aagcttgttg gaaaaatctt ttgtaacttg gcaattgaag 3360
aaattctctc ctgttacgga aagatctttg acagagaaag ttgcagaaga aaaagaagaa 3420
tcttcaaaat tctttgtgag tgcgtgcttt atgaatgctc agtcacacct cagaaacgct 3480
cgcatttctc tttcaagaaa gtgtgaagaa atgtacatat ctttagttag aaaatgtgtt 3540
ggtgtgttgc ttaggactgt acatcgttgt tatagtgata ttttgtatct agttaatgtg 3600
tgcatagtat tttctttatt agtgcagatg tcatcaacat tgcatggtgt tgttaagcga 3660
attcaagtgg atagagcagt gttgcataga atgaaacaag gtgaagagga aactacactt 3720
gttcatatgt atgaactctt tactaaagca gaaggtggaa ttccaacgat ggcgtccttc 3780
acagaacacg tcaaagttgt gaggcctgat ttgttaccaa cactcatgaa gatcataaac 3840
caaagagaag atgtttcatg tcaggcaaag actccagttc aatgtcaatt tgaaaagatt 3900
gtggcattta tggcactgtt aacaatgtgt attgacactg aaagaagcga tgctattttc 3960
aaaattctga acaaactgaa agttgttttc tcaacaatgg gtgaagatgt taaaattcag 4020
agtttggatg aaattgaaga tattgaggta gacaagaaac tcaccataga ttttgatttg 4080
gaaacaaaca aagaaccatc ttctgtttct tttgatgtga aatttgatga atggtggaat 4140
aggcagttga accagaatag agtcgttcca cattacagaa caacaggtga gttcatggag 4200
tttacaagag agactgctgc aaaggttgcg aaccagattt caatttcatc agcaacagag 4260
tttctggtgc gtggtgcagt tggttcagga aagtcaacag gtttgccaca ccacctcgca 4320
aagaaaggaa aagttctcct tctcgagcca acgagaccac ttgctgagaa tgttagcaaa 4380
cagctcaatg gagaaccatt ttatcagatg gtgacactgc gcatgcgagg attgaacaaa 4440
tttggatcta gcaacatcac agtgatgact agtggtttcg cctttcatta ctatgtaaat 4500
aacccaaacc aattagcaga ttttgatttt attattatag atgagtgtca tgtgctggat 4560
agtgctacaa tagccttcaa ttgtgcctta aaggaatatg aatttgcagg caagctaata 4620
aagatttcgg ctacaccacc tgggcgcgaa tgtgagttca ccacgcaaca tccagttaaa 4680
ttgaagatgg aggatcaaat atcatttcag cacttcgtta gtgcacaggg gacaggttca 4740
aatgctgata tgatccaaca tggtcataac atactggttt atgttgcaag ctacaatgag 4800
gttgatcaat tgtcgcgtct cttgatagaa cgacaattca aggttacaaa agttgatgga 4860
agaacaatgc aaaaaggcaa tgtcgaaatt gtcacctcag ggactgaagg taaaccacac 4920
ttcatagtcg caacaaacat cattgagaat ggtgtgacaa ttgatgtgga ttgtgtggtt 4980
gattttggac agaaggttgt agcggtgctt gatagcgact gtcgatgtgt aagatataat 5040
aagaaaccag tcacttacgg tgagcgcatt caaagacttg gtcgggttgg taggtgcaag 5100
ccggggtttg cacttagaat agggcacact gaaaaaggta tcgaggagat acctgagttt 5160
attgctacag aggcagcatt cctctctttt gcgtatggat tgcctgtcac aacacagagc 5220
gtcacaacaa gcattctttc tagatgcact acaaaacagg caagaaatgc gctcaatttt 5280
gaactgactc cattcttttc aattcatttt attaaatatg atggtagtat gcatccagaa 5340
atacacagac ttcttaagcc ttttaaatta agagagtccg aaatgttgct caacaaatta 5400
gccatcccat accagtatgt gaatcagtgg cttacagtgc gtgagtatga taggcaagga 5460
attcatgtac attgtaatga gagtgcacgc atacctttct acgcacatgg aattcccgac 5520
aagttgtatg aagcattgtg ggacacaatt tgtaagtata aaggtgatgc tggttttggt 5580
agagtgtcaa gtgcaagtgc tgcaaagata agctatacat tgagcactga tccaagcgct 5640
gtgcccaaaa caattgcaat cattgaccat ttattagctg aagagatgat gaaaaagaat 5700
cactttgaca caattggctc ttcagttact ggttattcat tctcacttgc aggaattgct 5760
gaaggcttta gaaaaagata catgcgagat tacacccagc ataacatagc aattttacag 5820
caagcgaagg cacagttact tgaatttgac agcacaaagg ttgatttgaa taacttgcat 5880
ggtattgaag gaattggagt attaaatgca gttcagctcc agagtacaca tgaagtatgc 5940
aagttcttga accttaaagg aaagtgggat ggaaagaaat ttatgaatga cgctcttgtg 6000
ggtgttttcg cactcattgg tggtggttgg atgatgtggg agtatttcac caagaaaatg 6060
aaggagccag tgtcaacaca aggaaagaag cgaaccctcc aaaaactcaa gttcagggat 6120
gcttatgacc ggaagatggg tagagaggtg tatgcagatg attacacaat ggagcgaacg 6180
tttggggagg catacactag gcgaggcaag aggaaaggca gtactgagac gagaggaatg 6240
ggtcggaaaa ctaggaattt cattcatatg tatggggtcg agccagaaaa ttatagtatg 6300
atcagatttg ttgaccctat tacaggacac acaatggacg aaaatcccag agttgacata 6360
agaattgtgc aggaagaatt tggtgatata cggatgaaga tgatagaaga agataaactt 6420
gacacccaac atcttgtatc caggccaggt ctgcaagcct atctttttgg aaagaacaca 6480
gaagatgttt taaaagttga tctgacacca catataccaa cacttctgtg tcagaacaca 6540
aatgcaatat caggatttcc agaaagagaa aatgaactga ggcagactgg tccaccagtg 6600
cgggtatcaa aatcagaggt gcccaaacca aatgagcatg ttgagcttga aagcaaatca 6660
gtgtacaagg gtttgagaga ttacagtgct gtagcaacac tgatttgcca attaaccaat 6720
gcatctgatg gtcataaaga aacactttat ggcattggtt atggcgccta catcatcacg 6780
aatggacact tgtttaggcg caataatgga atcttgactg tacgtacatg gcatggtgaa 6840
tttgttatca ataacacaac acagttaaaa attcatttca tagagggcaa ggatgcaatt 6900
ttgattagaa tgcctaagga tttcccacca tttgcaaaaa gaagtttctt tcgccagcca 6960
gttaaagagg aaagagtttg tatggttggc acaaattttc aagaaaagag cctgagagca 7020
acagtatccg aatcatcaat catagtgcct gaaggggtcg gatcattttg gatccactgg 7080
atatcaaccc aagacggctt ctgtgggttg cctcttgttt cagttaacga tggatttgtt 7140
gttggctttc atgggctcaa atcgaatgat tccgagaaga acttctttat cccattcata 7200
gatgattttg aaaagaagta tctgaggagt gctgaaagtc tatcttggga taagcactgg 7260
ttttggcaac ctgacaaaat tgcatggggt tcactcaacc tcgttgatga acagcccaga 7320
gaggaattca aaatatctaa actcatctct gatttgttta gtgactccgt tgttgtacag 7380
agtcaaagga aaagagaaag atgggtccta gataatatgg aagggaatct agtcgcatgt 7440
gggcaaaccg acagtgcttt agtgactaaa catgttgtga aaggaagatg tccacacttt 7500
gagcagtact taatacaaaa tgaagaggcg gctagatttt tcagacctct catgggcgca 7560
taccaaccca gtaaactgaa cagagaagcc ttcaagaaag atttcttcaa atacaacaag 7620
ccaatagttt tgaatgaagt tgatttcgat gcatttgaaa aggcaactga cggagtgaag 7680
tgcatgatga tggaatatgg ctttcatgat tgtacatatg ttacagaccc tgatgaaatc 7740
tttgggtctc tgaatatgaa ggctgcagtg ggagcacagt ataaagggaa gaagagtgaa 7800
taccttgaag gtatggactc ttttgataag gaaaggttgc tttatttgag cagtgaacgt 7860
ctgttttatg gaaagaaggg tctttggaat gggtctctta aagctgaatt gaggccaaaa 7920
gagaaagtgc aagctaataa gaccagaaca ttcactgctg ctcccattga cactctgtta 7980
ggcgccaaag tttgtgtgga tgacttcaac aatcaatttt acagtttaaa tttggcttgt 8040
ccatggactg ttgggatgac aaagttctac ggtggatggg ataagttgat gcgtagttta 8100
ccagatgggt ggctatattg tcacgcagat ggttctcaat tcgatagttc cctaacacca 8160
cttttgctta atgcagtctt ggacatcaga aggtttttta tggaagaatg gtgggttggt 8220
caagaaatgc tcgagaattt gtatgcagaa attgtgtata ctccaatcct tgcaccagat 8280
gggacaatat tcaaaaagtt caggggcaat aacagtgggc aaccatcaac tgtggtggac 8340
aatactttaa tggttgttct tgctatgtat tactcctgcc acaagcaggg ttggactgaa 8400
gatgatcttg aggatcgtat cattttcttt gctaatgggg atgatattat tctggctgtt 8460
aaagaagaag acgcatggat ctatgacaca ctcagtgctt cttttgctga acttggactg 8520
aactacaatt tcgatgatcg atcaaaacgg cgagaagatt tgtggtttat gtctcataca 8580
gcaattgaaa ttgatggagt gtacattccc aagctcgaac ctgaacgaat tgtttcaata 8640
ctagaatggg ataggagtaa agaaattatg cacaggactg aggcaatttg cgcagcaatg 8700
attgaagcgt ggggttatac agatttgctg cgtgaaatca gaaagtttta cctgtggctt 8760
gttcaaaaag atgagttcaa ggaacttgct gcagctggca aagcaccata cattgcagaa 8820
acagctttga gaaagttgta catggatgag gatgctagca tggatgagct acagaaatac 8880
ttgcatgtcc tagacctcga gcatgtggaa ggttgctgtg aatcagtatc tttgcaaacc 8940
aaatcagaaa acgataaaga agaacttgga aaggatgcaa ttgatgcagg caatgatggg 9000
aaaaggagag acaaggaaaa ggaaagaatg gtcacaaccc cgatgaatcc aaatcccaag 9060
aattcagaat ttggtggtag ctcatttaac aggaaagaca aggatgtcga tgctggctca 9120
aaaggtaaaa tggtaccacg gctgcaaaag atcacaaaga agatgaatct accaactgtg 9180
aaaggtaggg tcatactcga cttggatcat ctaattgagt atgcaccaaa tcaagttgat 9240
ctctttaata ccagagctac aaagtcacaa tttgaatcat ggtattcagc agtccaaaga 9300
gaatatgagc tggatgacaa tcagatgagc gtcatcatga atggtttcat ggtgtggtgc 9360
attgacaatg gcacttcacc aaatgttaat ggcacatggg tgatgatgga cggagaagaa 9420
caaattgaat acccattgaa gccgttagtt gaaaatgctc agccaacatt gagacaaatt 9480
atgcatcact tttcagatgc ggctgaggca tacattgaga tgagaaattc taaagagccg 9540
tatatgccta gatatggtac tctgaggaat ttgagggact tgagtttggc gaggtatgct 9600
tttgatttct atgaagtaac ctccaagacg cctaacagag caagagaagc ggtagcacaa 9660
atgaaagccg ctgccctcgc gaacgtttct actaggttgt tcggcctaga tggaaatgtt 9720
tcaaccactg gcgagaacac tgaaaggcat actgtacggg acatcaatca gaacatgcac 9780
acccttttgg gtatgaattc cccgcagtga aggttgggta aaccgaccac agttgctttc 9840
tcgtttagcc tttaaatttc tatagtagta taactttcac tctctttaag ttcagtgtgg 9900
ttacaccacc ttccgtcaaa cttattgtga tagagtggct cagccaccag tgtttgtggt 9960
aactatagtt taaagtaagg gcggggagaa ccgttgcaac gccggagctt tcagagtgga 10020
tgcttctacg cgtactgtcc gaggtttggc aacgtttgtt gtcct 10065
<210>16
<211>10065
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>16
catctcataa agacataaca gaaatcgatc atacaatttc tcagtctctc agtttacagc 60
aatctttcca aacacacgaa tcacaaactc agtttcataa ctttcaacaa gaattttctc 120
tttattccat actttcaaac attctcaatg gcaggaattg tgttcggaag tttctctcct 180
ctaatactag tgaagaaaac tgtgaaggct aagcggttgg ttcctggaac tgctacaatc 240
actaagatgc gggtggaaac tgtgcccgtg aatgttatga aggtggtctc aattggatgc 300
tctgataggt gtggcgggct gtgcgcatac accaaaactt gtctccgacg tgctattaag 360
gagggagacc tgacaagttc tggtgctagt catcactgtg gccttcatgg ccttgtgggt 420
gaggggcgcc cacgaactca gctggtacca tttcttgaat atcaacagaa ggaagtacca 480
tagactgaag tggcacaaac aatggtggta gaggaatatg aaatggaggt gccagtttat 540
ggcaaaatat tccccataga ggaggttgca tctgaagcaa ccagagccct ttctgttgca 600
acgcgtgtga cagtagaggc aaaaatgatg gccactgaaa agccatcaat tcaacaagtc 660
tctgccaagc tgaggagaca gagtgcgatt gaaattgcgc agtacaatgc gcaaattgct 720
gcgatggacg agttcctcca gaagaattct gatctggaga ggcgcctttt tatcaataaa 780
tacagtccag tccaacagaa aaagagtggg gctgtttgca tacgtcacct aacgtatgat 840
caggcaatga ggcgcaagga aaggcatgac aaagagaaag aagccgacaa gaaattctgg 900
gcaggagagt atgaggtcaa agtcggccat gtccaacttc ctactacttt aaacacaagt 960
ggtcgagttg gtttcagaag tgagttctac acaaggtctt acaagcagcg taaatcccca 1020
caacaagcga aaaatttcat aatcgacaaa ggcgcgcttg acaaagtcct ccgacttgca 1080
aagcaacttt cattgcctat tgaatttata ggcaagagga gacagcaggc catcaaggcc 1140
acatttgtta agaggggaac taacactctt ccacaagtgt atttgcctca tgctgatggc 1200
atatacaaaa acagagagct caacctagaa catgtggata acacgctttc tgtgctgtgc 1260
aaacatgtga aaatgagcca tttgaaagat gagcaaatca agcgtggtga tagtgggtta 1320
gtgtttgatg agcgctcaca aattacaagg gataatacgg caatgccata ttttgtaatt 1380
cgtggacggt gcaatggaaa gttggttaat gctcttgatt tcatcaaaga aaaagagagt 1440
gttgtgcact actcacaaac acctgaggct caatttttcg caggatggaa gaaggttttt 1500
gataggatgg tgccacacat tgagccacac acttgcacag ttgatttcgc gaatgctcaa 1560
tgtggggagg ttgctgcaac aataagccag acacttttcc ctgtgaggaa gctatcttgc 1620
ctctcttgta ggaaacattt acaggcaatg ggttgggaag gatacaaaca actcctcgca 1680
gcacacttag attattgcag caccattctg caagaaaagg acagagcact tgggtttgag 1740
ctggtggaga agttggtatt gcaggtaaca aagggaaata caaatcttga atcgtcaatg 1800
gagatagtca ggttaactca gaattatacc actactccaa tgttacagat tcaggatatc 1860
aacaaagcgc tcacgaaagg atcatcagtt acacagcaag agctggatca ggcaacaaaa 1920
cagttgcttg aaatgacccg ctggtggaag aaacacatga acttgactga tgaagatgcg 1980
cttagggtgt tcagaaacaa gagatcctca aaagcactat taaatccaag cttgctctgc 2040
gataatcaat tagaccgtaa tggaaatttt gtgtggggtg aaaggggcaa acattcaaag 2100
cggttctttg caaatttctt cgaggaagtg gtcccttcag gaggatatgg caagtatgta 2160
gtgcgacgta atccaaatgg ccaaaggaaa cttgctattg gctcattgat tgtaccattg 2220
gatttcgatc gtgctaggct agcattgcag ggtgaaagca taacaaggga gtcattgact 2280
atggcatgca tttctagaca aaagaataat tttatatacc cttgttgctg tgtcacacat 2340
gacgacggta cgccgcttta ctccgacctt aaaagcccaa caaagaggca cttggtcgtt 2400
ggatcatcag gggacccaaa gtacattgat ctaccagccg aagacacaga tcgcatgtac 2460
attgcaaaag aaggctattg ttacttgaac atttttctgg ctatgcttgt taatgttaat 2520
gagcaggatg caaaagactt cacaaaaatg gtcagagatg taattgttcc gcgacttggg 2580
aagtggcctt caatgatgga tgtggcaaca gctgcgtaca ttcttacagt atttcatcct 2640
gaaacgcgca atgctgaatt acctagaatt ttagtagatc atgctgctca aacaatgcat 2700
gtgattgatt catttggttc cttgacagtt ggttatcaca ttttgaaagc agggaccatt 2760
aatcaattga tacaatttgc atcaaatgat ctactggggg agatgaaatt ttataaggtt 2820
ggaggaatgg tggagcaaag aatgaagtgt gaaacagccc tgatctccag catatttaaa 2880
cccaaaagga tgattcaaat cttggaagat gacccatata tccttctcct tggtatgatt 2940
tcaccatcgg tgctaatcca tatgtaccgt atgcgtcatt ttgagaaggg tatacaaaca 3000
tggatcagta aggaccagaa tgtgacaaaa atttttatca ttatggagca gttgacaagg 3060
aagcttgcag tgaatgacat tctgctcaac caactgcaaa ttatttctgg ttcttcaggg 3120
catcttttgg aattgctgat ggattgccca tcacaatcac actcatacaa gccggctcta 3180
gacctgttga gccagtttct tgagagagat gtcacgaaca gacaattgag tgacaatggg 3240
tttgttgata tcaatgaaag cctctacgta gaaatggaaa aaatctatgt agaaaggtta 3300
aagcaggagt ggcacgcgct aagcttgttg gaaaaatctt ttgtaacttg gcaattgaag 3360
aaattctctc ctgttacgga aagatctttg acagagaaag ttgcagaaga aaaagaagaa 3420
tcttcaaaat tctttgtgag tgcgtgcttt atgaatgctc agtcacacct cagaaacgct 3480
cgcatttctc tttcaagaaa gtgtgaagaa atgtacatat ctttagttag aaaatgtgtt 3540
ggtgtgttgc ttaggactgt acatcgttgt tatagtgata ttttgtatct agttaatgtg 3600
tgcatagtat tttctttatt agtgcagatg tcatcaacat tgcatggtgt tgttaagcga 3660
attcaagtgg atagagcagt gttgcataga atgaaacaag gtgaagagga aactacactt 3720
gttcatatgt atgaactctt tactaaagca gaaggtggaa ttccaacgat ggcgtccttc 3780
acagaacacg tcaaagttgt gaggcctgat ttgttaccaa cactcatgaa gatcataaac 3840
caaagagaag atgtttcatg tcaggcaaag actccagttc aatgtcaatt tgaaaagatt 3900
gtggcattta tggcactgtt aacaatgtgt attgacactg aaagaagcga tgctattttc 3960
aaaattctga acaaactgaa agttgttttc tcaacaatgg gtgaagatgt taaaattcag 4020
agtttggatg aaattgaaga tattgaggta gacaagaaac tcaccataga ttttgatttg 4080
gaaacaaaca aagaaccatc ttctgtttct tttgatgtga aatttgatga atggtggaat 4140
aggcagttga accagaatag agtcgttcca cattacagaa caacaggtga gttcatggag 4200
tttacaagag agactgctgc aaaggtagcg aaccagattt caatttcatc agcaacagag 4260
tttctggtgc gtggtgcagt tggttcagga aagtcaacag gtttgccaca ccacctcgca 4320
aagaaaggaa aagttctcct tctcgagcca acgagaccac ttgctgagaa tgttagcaaa 4380
cagctcaatg gagaaccatt ttatcagatg gtgacactgc gcatgcgagg attgaacaaa 4440
tttggatcta gcaacatcac agtgatgact agtggtttcg cctttcatta ctatgtaaat 4500
aacccaaacc aattagcaga ttttgatttt attattatag atgagtgtca tgtgctggat 4560
agtgctacaa tagccttcaa ttgtgcctta aaggaatatg aatttgcagg caagctaata 4620
aacatttcgg ctacaccacc tgggcgcgaa tgtgagttca ccacgcaaca tccagttaaa 4680
ttgaagatgg aggatcaaat atcatttcag cacttcgtta gtgcacaggg gacaggttca 4740
aatgctgata tgatccaaca tggtcataac atactggttt atgttgcaag ctacaatgag 4800
gttgatcaat tgtcgcgtct cttgatagaa cgacaattca aggttacaaa agttgatgga 4860
agaacaatgc aaaaaggcaa tgtcgaaatt gtcacctcag ggactgaagg taaaccacac 4920
ttcatagtcg caacaaacat cattgagaat ggtgtgacaa ttgatgtgga ttgtgtggtt 4980
gattttggac agaaggttgt agcggtgctt gatagcgact gtcgatgtgt aagatataat 5040
aagaaaccag tcacttacgg tgagcgcatt caaagacttg gtcgggttgg taggtgcaag 5100
ccggggtttg cacttagaat agggcacact gaaaaaggta tcgaggagat acctgagttt 5160
attgctacag aggcagcatt cctctctttt gcgtatggat tgcctgtcac aacacagagc 5220
gtcacaacaa gcattctttc tagatgcact acaaaacagg caagaaatgc gctcaatttt 5280
gaactgactc cattcttttc aattcatttt attaaatatg atggtagtat gcatccagaa 5340
atacacagac ttcttaagcc ttttaaatta agagagtccg aaatgttgct caacaaatta 5400
gccatcccat accagtatgt gaatcagtgg cttacagtgc gtgagtatga taggcaagga 5460
attcatgtac attgtaatga gagtgcacgc atacctttct acgcacatgg aattcccgac 5520
aagttgtatg aagcattgtg ggacacaatt tgtaagtata aaggtgatgc tggttttggt 5580
agagtgtcaa gtgcaagtgc tgcaaagata agctatacat tgagcactga tccaagcgct 5640
gtgcccaaaa caattgcaat cattgaccat ttattagctg aagagatgat gaaaaagaat 5700
cactttgaca caattggctc ttcagttact ggttattcat tctcacttgc aggaattgct 5760
gaaggcttta gaaaaagata catgcgagat tacacccagc ataacatagc aattttacag 5820
caagcgaagg cacagttact tgaatttgac agcacaaagg ttgatttgaa taacttgcat 5880
ggtattgaag gaattggagt attaaatgca gttcagctcc agagtacaca tgaagtatgc 5940
aagttcttga accttaaagg aaagtgggat ggaaagaaat ttatgaatga cgctcttgtg 6000
ggtgttttcg cactcattgg tggtggttgg atgatgtggg agtatttcac caagaaaatg 6060
aaggagccag tgtcaacaca aggaaagaag cgaaccctcc aaaaactcaa gttcagggat 6120
gcttatgacc ggaagatggg tagagaggtg tatgcagatg attacacaat ggagcgaacg 6180
tttggggagg catacactag gcgaggcaag aggaaaggca gtactgagac gagaggaatg 6240
ggtcggaaaa ctaggaattt cattcatatg tatggggtcg agccagaaaa ttatagtatg 6300
atcagatttg ttgaccctat tacaggacac acaatggacg aaaatcccag agttgacata 6360
agaattgtgc aggaagaatt tggtgatata cggatgaaga tgatagaaga agataaactt 6420
gacacccaac atcttgtatc caggccaggt ctgcaagcct atctttttgg aaagaacaca 6480
gaagatgttt taaaagttga tctgacacca catataccaa cacttctgtg tcagaacaca 6540
aatgcaatat caggatttcc agaaagagaa aatgaactga ggcagactgg tccaccagtg 6600
cgggtatcaa aatcagaggt gcccaaacca aatgagcatg ttgagcttga aagcaaatca 6660
gtgtacaagg gtttgagaga ttacagtgct gtagcaacac tgatttgcca attaaccaat 6720
gcatctgatg gtcataaaga aacactttat ggcattggtt atggcgccta catcatcacg 6780
aatggacact tgtttaggcg caataatgga atcttgactg tacgtacatg gcatggtgaa 6840
tttgttatca ataacacaac acagttaaaa attcatttca tagagggcaa ggatgcaatt 6900
ttgattagaa tgcctaagga tttcccacca tttgcaaaaa gaagtttctt tcgccagcca 6960
gttaaagagg aaagagtttg tatggttggc acaaattttc aagaaaagag cctgagagca 7020
acagtatccg aatcatcaat catagtgcct gaaggggtcg gatcattttg gatccactgg 7080
atatcaaccc aagacggctt ctgtgggttg cctcttgttt cagttaacga tggatttgtt 7140
gttggctttc atgggctcaa atcgaatgat tccgagaaga acttctttat cccattcata 7200
gatgattttg aaaagaagta tctgaggagt gctgaaagtc tatcttggga taagcactgg 7260
ttttggcaac ctgacaaaat tgcatggggt tcactcaacc tcgttgatga acagcccaga 7320
gaggaattca aaatatctaa actcatctct gatttgttta gtgactccgt tgttgtacag 7380
agtcaaagga aaagagaaag atgggtccta gataatatgg aagggaatct agtcgcatgt 7440
gggcaaaccg acagtgcttt agtgactaaa catgttgtga aaggaagatg tccacacttt 7500
gagcagtact taatacaaaa tgaagaggcg gctagatttt tcagacctct catgggcgca 7560
taccaaccca gtaaactgaa cagagaagcc ttcaagaaag atttcttcaa atacaacaag 7620
ccaatagttt tgaatgaagt tgatttcgat gcatttgaaa aggcaactga cggagtgaag 7680
tgcatgatga tggaatatgg ctttcatgat tgtacatatg ttacagaccc tgatgaaatc 7740
tttgggtctc tgaatatgaa ggctgcagtg ggagcacagt ataaagggaa gaagagtgaa 7800
taccttgaag gtatggactc ttttgataag gaaaggttgc tttatttgag cagtgaacgt 7860
ctgttttatg gaaagaaggg tctttggaat gggtctctta aagctgaatt gaggccaaaa 7920
gagaaagtgc aagctaataa gaccagaaca ttcactgctg ctcccattga cactctgtta 7980
ggcgccaaag tttgtgtgga tgacttcaac aatcaatttt acagtttaaa tttggcttgt 8040
ccatggactg ttgggatgac aaagttctac ggtggatggg ataagttgat gcgtagttta 8100
ccagatgggt ggctatattg tcacgcagat ggttctcaat tcgatagttc cctaacacca 8160
cttttgctta atgcagtctt ggacatcaga aggtttttta tggaagaatg gtgggttggt 8220
caagaaatgc tcgagaattt gtatgcagaa attgtgtata ctccaatcct tgcaccagat 8280
gggacaatat tcaaaaagtt caggggcaat aacagtgggc aaccatcaac tgtggtggac 8340
aatactttaa tggttgttct tgctatgtat tactcctgcc acaagcaggg ttggactgaa 8400
gatgatcttg aggatcgtat cattttcttt gctaatgggg atgatattat tctggctgtt 8460
aaagaagaag acgcatggat ctatgacaca ctcagtgctt cttttgctga acttggactg 8520
aactacaatt tcgatgatcg atcaaaacgg cgagaagatt tgtggtttat gtctcataca 8580
gcaattgaaa ttgatggagt gtacattccc aagctcgaac ctgaacgaat tgtttcaata 8640
ctagaatggg ataggagtaa agaaattatg cacaggactg aggcaatttg cgcagcaatg 8700
attgaagcgt ggggttatac agatttgctg cgtgaaatca gaaagtttta cctgtggctt 8760
gttcaaaaag atgagttcaa ggaacttgct gcagctggca aagcaccata cattgcagaa 8820
acagctttga gaaagttgta catggatgag gatgctagca tggatgagct acagaaatac 8880
ttgcatgtcc tagacctcga gcatgtggaa ggttgctgtg aatcagtatc tttgcaaacc 8940
aaatcagaaa acgataaaga agaacttgga aaggatgcaa ttgatgcagg caatgatggg 9000
aaaaggagag acaaggaaaa ggaaagaatg gtcacaaccc cgatgaatcc aaatcccaag 9060
aattcagaat ttggtggtag ctcatttaac aggaaagaca aggatgtcga tgctgcctca 9120
aaaggtaaaa tggtaccacg gctgcaaaag atcacaaaga agatgaatct accaactgtg 9180
aaaggtaggg tcatactcga cttggatcat ctaattgagt atgcaccaaa tcaagttgat 9240
ctctttaata ccagagctac aaagtcacaa tttgaatcat ggtattcagc agtccaaaga 9300
gaatatgagc tggatgacaa tcagatgagc gtcatcatga atggtttcat ggtgtggtgc 9360
attgacaatg gcacttcacc aaatgttaat ggcacatggg tgatgatgga cggagaagaa 9420
caaattgaat acccattgaa gccgttagtt gaaaatgctc agccaacatt gagacaaatt 9480
atgcatcact tttcagatgc ggctgaggca tacattgaga tgagaaattc taaagagccg 9540
tatatgccta gatatggtac tctgaggaat ttgagggact tgagtttggc gaggtatgct 9600
tttgatttct atgaagtaac ctccaagacg cctaacagag caagagaagc ggtagcacaa 9660
atgaaagccg ctgccctcgc gaacgtatct actaggttgt tcggcctaga tggaaatgtt 9720
tcaaccactg gcgagaacac tgaaaggcat actgtacggg acatctatca gaacatgcac 9780
acccttttgg gtatgaattc cccgcagtga aggttgggta aaccgaccac agttgctatc 9840
tcgtttagcc tttaaatttc tatagtagta taactttcac tctctttaag ttcagtgtgg 9900
ttacaccacc ttccgtcaaa cttattgtga tagagtggct cagccaccag tgtttgtggt 9960
aactatagtt taaagtaagg gcggggagaa ccgttgcaac gccggagctt tcagagtgga 10020
tgcttctacg cgtactgtcc gaggtttggc aacgtttgat gtcct 10065
<210>17
<211>10065
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>17
catctcataa agacataaca gaaatcgatc atacaatttc tcagtctctc agtttacagc 60
aatctttcca aacacacgaa tcacaaactc agtttcataa ctttcaacaa gaattttctc 120
tttattccat actttcaaac attctcaatg gcaggaattg tgttcggaag tttctctcct 180
ctaatactag tgaagaaaac tgtgaaggct aagcggttgg ttcctggaac tgctacaatc 240
actaagatgc gggtggaaac tgtgcccgtg aatgttatga aggtggtctc aattggatgc 300
tctgataggt gtggcgggct gtgcgcatac accaaaactt gtctccgacg tgctattaag 360
gagggagacc tgacaagttc tggtgcttgt catcactgtg gccttcatgg ccttgtgggt 420
gaggggcgcc cacgaactca gctggtacca tttcttgaat atcaacagaa ggaagtacca 480
tagactgaag tggcacaaac aatggtggaa gaggaatatg aaatggaggt gccagtttat 540
ggcaaaatat tccccataga ggaggttgca tctgaagcaa ccagagccct ttctgttgca 600
acgcgtgtga cagtagaggc aaaaatgatg gccactgaaa agccatcaat tcaacaagtc 660
tctgccaagc tgaggagaca gagtgcgatt gaaattgcgc agtacaatgc gcaaattgct 720
gcgatggacg agttcctcca gaagaattct gatctggaga ggcgcctttt tatcaataaa 780
tacagtccag tccaacagaa aaagagtggg gctgtttgca tacgtcacct aacgtatgaa 840
caggcaatga ggcgcaagga aaggcatgac aaagagaaag aagcggacaa gaaattctgg 900
gcaggagagt atgacgtcaa agtcggccat gtccaactgc ctactacttt aaacacaagt 960
ggtcgagttg gtttcagaag tgagttctac acaaggactt acaagcagcg taaatcccca 1020
caacaagcga aaaatttcat aatcgacaaa ggcgcgcttg acaaagtcct ccgacttgca 1080
aagcaacttt cattgcctat tgaatttata ggcaagagga gacaccaggc catcaaggcc 1140
acatttgtta agaggggaac taacactctt ccacaagtgt atttgcctca tgctgatggc 1200
atatacaaaa acagagagct caacctagaa catgtggata acacgctatc tgtgctgtgc 1260
aaacatgtga aaatgagcca tttgaaagat gagcaaatca agcgtggtga tagtgggtta 1320
gtgtttgatg agcgctcaca aattacaagg gataatacgg caatgccata ttttgtaatt 1380
cgtggacggt gcaatggaaa gttggttaat gctcttgatt tcatcaaaga aaaagagagt 1440
gttgtgcact actcacaaac acctgaggct caatttttcc caggatggaa gaaggttttt 1500
gataggatgg tgccacacat tgagccacac acttgcacag ttgatttcgc gaatgctcaa 1560
tgtggggagg ttgctgcaac aataagccag acacttttcc ctgtgaggaa gctatcttgc 1620
ctctcttgta ggaaacattt acaggcaatg ggttgggaag gatacaaaca actcctcgca 1680
gcacacttag attattgcag caccattctg caagaaaagg acagagcact tgggtttgag 1740
ctggtggaga agttggtatt gcaggtaaca aagggaaata caaatcttga atcgtcaatg 1800
gagatagtca ggttaactca gaattatacc actactccaa tgttacagat tcaggatatc 1860
aacaaagcgc tcacgaaagg atcatcagtt acacagcaag agctggatca ggcaacaaaa 1920
cagttgcttg aaatgacccg ctggtggaag aaacacatga acttgactga tgaagatgcg 1980
cttagggtgt tcagaaacaa gagatcctca aaagcactat taaatccaag cttgctctgc 2040
gataatcaat tagaccgtaa tggaaatttt gtgtggggtg aaaggggcaa acattcaaag 2100
cggttctttg caaatttctt cgaggaagtg gtcccttcag gaggatatgg caagtatgta 2160
gtgcgacgta atccaaatgg ccaaaggaaa cttgctattg gctcattgat tgtaccattg 2220
gatttcgatc gtgctaggct agcattgcag ggtgaaagca taacaaggga gtcattgact 2280
atggcatgca tttctagaca aaagaataat tttatatacc cttgttgctg tgtcacacat 2340
gacgacggta cgccgcttta ctccgacctt aaaagcccaa caaagaggca cttggtcgtt 2400
ggatcatcag gggacccaaa gtacattgat ctaccagccg aagacacaga tcgcatgtac 2460
attgcaaaag aaggctattg ttacttgaac atttttctgg ctatgcttgt taatgttaat 2520
gagcaggatg caaaagactt cacaaaaatg gtcagagatg taattgttcc gcgacttggg 2580
aagtggcctt caatgatgga tgtggcaaca gctgcgtaca ttcttacagt atttcatcct 2640
gaaacgcgca atgctgaatt acctagaatt ttagtagatc atgctgctca aacaatgcat 2700
gtgattgatt catttggttc cttgacagtt ggttatcaca ttttgaaagc agggaccatt 2760
aatcaattga tacaatttgc atcaaatgat ctactggggg agatgaaatt ttataaggtt 2820
ggaggaatgg tggagcaaag aatgaagtgt gaaacagccc tgatctccag catatttaaa 2880
cccaaaagga tgattcaaat cttggaagat gacccatata tccttctcct tggtatgatt 2940
tcaccatcgg tgctaatcca tatgtaccgt atgcgtcatt ttgagaaggg tatacaaaca 3000
tggatcagta aggaccagaa tgtgacaaaa atttttatca ttatggagca gttgacaagg 3060
aagcttgcag tgaatgacat tctgctcaac caactgcaaa ttatttctgg ttcttcaggg 3120
catcttttgg aattgctgat ggattgccca tcacaatcac actcatacaa gccggctcta 3180
gacctgttga gccagtttct tgagagagat gtcacgaaca gacaattgag tgacaatggg 3240
tttgttgata tcaatgaaag cctctacgta gaaatggaaa aaatctatgt agaaaggtta 3300
aagcaggagt ggcacgcgct aagcttgttg gaaaaatctt ttgtaacttg gcaattgaag 3360
aaattctctc ctgttacgga aagatctttg acagagaaag ttgcagaaga aaaagaagaa 3420
tcttcaaaat tctttgtgag tgcgtgcttt atgaatgctc agtcacacct cagaaacgct 3480
cgcatttctc tttcaagaaa gtgtgaagaa atgtacatat ctttagttag aaaatgtgtt 3540
ggtgtgttgc ttaggactgt acatcgttgt tatagtgata ttttgtatct agttaatgtg 3600
tgcatagtat tttctttatt agtgcagatg tcatcaacat tgcatggtgt tgttaagcga 3660
attcaagtgg atagagcagt gttgcataga atgaaacaag gtgaagagga aactacactt 3720
gttcatatgt atgaactctt tactaaagca gaaggtggaa ttccaacgat ggcgtccttc 3780
acagaacacg tcaaagttgt gaggcctgat ttgttaccaa cactcatgaa gatcataaac 3840
caaagagaag atgtttcatg tcaggcaaag actccagttc aatgtcaatt tgaaaagatt 3900
gtggcattta tggcactgtt aacaatgtgt attgacactg aaagaagcga tgctattttc 3960
aaaattctga acaaactgaa agttgttttc tcaacaatgg gtgaagatgt taaaattcag 4020
agtttggatg aaattgaaga tattgaggta gacaagaaac tcaccataga ttttgatttg 4080
gaaacaaaca aagaaccatc ttctgtttct tttgatgtga aatttgatga atggtggaat 4140
aggcagttga accagaatag agtcgttcca cattacagaa caacaggtga gttcatggag 4200
tttacaagag agactgctgc aaaggtagcg aaccagattt caatttcatc agcaacagag 4260
tttctggtgc gtggtgcagt tggttcagga aagtcaacag gtttgccaca ccacctcgca 4320
aagaaaggaa aagttctcct tctcgagcca acgagaccac ttgctgagaa tgttagcaaa 4380
cagctcaatg gagaaccatt ttatcagatg gtgacactgc gcatgcgagg attgaacaaa 4440
tttggatcta gcaacatcac agtgatgact agtggtttcg cctttcatta ctatgtaaat 4500
aacccaaacc aattagcaga ttttgatttt attattatag atgagtgtca tgtgctggat 4560
agtgctacaa tagccttcaa ttgtgcctta aaggaatatg aatttgcagg caagctaata 4620
aacatttcgg ctacaccacc tgggcgcgaa tgtgagttca ccacgcaaca tccagttaaa 4680
ttgaagatgg aggatcaaat atcatttcag cacttcgtta gtgcacaggg gacaggttca 4740
aatgctgata tgatccaaca tggtcataac atactggttt atgttgcaag ctacaatgag 4800
gttgatcaat tgtcgcgtct cttgatagaa cgacaattca aggttacaaa agttgatgga 4860
agaacaatgc aaaaaggcaa tgtcgaaatt gtcacctcag ggactgaagg taaaccacac 4920
ttcatagtcg caacaaacat cattgagaat ggtgtgacaa ttgatgtgga ttgtgtggtt 4980
gattttggac agaaggttgt agcggtgctt gatagcgact gtcgatgtgt aagatataat 5040
aagaaaccag tcacttacgg tgagcgcatt caaagacttg gtcgggttgg taggtgcaag 5100
ccggggtttg cacttagaat agggcacact gaaaaaggta tcgaggagat acctgagttt 5160
attgctacag aggcagcatt cctctctatt gcgtatggat tgcctgtcac aacacagagc 5220
gtcacaacaa gcattctttc tagatgcact acaaaacagg caagaaatgc gctcaatttt 5280
gaactgactc cattcttttc aattcatttt attaaatatg atggtagtat gcatccagaa 5340
atacacagac ttcttaagcc ttttaaatta agagagtccg aaatgttgct caacaaatta 5400
gccatcccat accagtatgt gaatcagtgg cttacagtgc gtgagtatga taggcaagga 5460
attcatgtac attgtaatga gagtgcacgc atacctttct acgcacatgg aattcccgac 5520
aagttgtatg aagcattgtg ggacacaatt tgtaagtata aaggtgatgc tggttttggt 5580
agagtgtcaa gtgcaagtgc tgcaaagata agctatacat tgagcactga tccaagcgct 5640
gtgcccaaaa caattgcaat cattgaccat ttattagctg aagagatgat gaaaaagaat 5700
cactttgaca caattggctc ttcagttact ggttattcat tctcacttgc aggaattgct 5760
gaaggcttta gaaaaagata catgcgagat tacacccagc ataacatagc aattttacag 5820
caagcgaagg cacagttact tgaatttgac agcacaaagg ttgatttgaa taacttgcat 5880
ggtattgaag gaattggagt attaaatgca gttcagctcc agagtacaca tgaagtatgc 5940
aagttcttga accttaaagg aaagtgggat ggaaagaaat ttatgaatga cgctcttgtg 6000
ggtgttttcg cactcattgg tggtggttgg atgatgtggg agtatttcac caagaaaatg 6060
aaggagccag tgtcaacaca aggaaagaag cgaaccctcc aaaaactcaa gttcagggat 6120
gcttatgacc ggaagatggg tagagaggtg tatgcagatg attacacaat ggagcgaacg 6180
tttggggagg catacactag gcgaggcaag aggaaaggca gtactgagac gagaggaatg 6240
ggtcggaaaa ctaggaattt cattcatatg tatggggtcg agccagaaaa ttatagtatg 6300
atcagatttg ttgaccctat tacaggacac acaatggacg aaaatcccag agttgacata 6360
agaattgtgc aggaagaatt tggtgatata cggatgaaga tgatagaaga agataaactt 6420
gacacccaac atcttgtatc caggccaggt ctgcaagcct atctttttgg aaagaacaca 6480
gaagatgttt taaaagttga tctgacacca catataccaa cacttctgtg tcagaacaca 6540
aatgcaatat caggatttcc agaaagagaa aatgaactga ggcagactgg tccaccagtg 6600
cgggtatcaa aatcagaggt gcccaaacca aatgagcatg ttgagcttga aagcaaatca 6660
gtgtacaagg gtttgagaga ttacagtgct gtagcaacac tgatttgcca attaaccaat 6720
gcatctgatg gtcataaaga aacactttat ggcattggtt atggcgccta catcatcacg 6780
aatggacact tgtttaggcg caataatgga atcttgactg tacgtacatg gcatggtgaa 6840
tttgttatca ataacacaac acagttaaaa attcatttca tagagggcaa ggatgcaatt 6900
ttgattagaa tgcctaagga tttcccacca tttgcaaaaa gaagtttctt tcgccagcca 6960
gttaaagagg aaagagtttg tatggttggc acaaattttc aagaaaagag cctgagagca 7020
acagtatccg aatcatcaat catagtgcct gaaggggtcg gatcattttg gatccactgg 7080
atatcaaccc aagacggctt ctgtgggttg cctcttgttt cagttaacga tggatttgtt 7140
gttggctttc atgggctcaa atcgaatgat tccgagaaga acttctttat cccattcata 7200
gatgattttg aaaagaagta tctgaggagt gctgaaagtc tatcttggga taagcactgg 7260
ttttggcaac ctgacaaaat tgcatggggt tcactcaacc tcgttgatga acagcccaga 7320
gaggaattca aaatatctaa actcatctct gatttgttta gtgactccgt tgttgtacag 7380
agtcaaagga aaagagaaag atgggtccta gataatatgg aagggaatct agtcgcatgt 7440
gggcaaaccg acagtgcttt agtgactaaa catgttgtga aaggaagatg tccacacttt 7500
gagcagtact taatacaaaa tgaagaggcg gctagatttt tcagacctct catgggcgca 7560
taccaaccca gtaaactgaa cagagaagcc ttcaagaaag atttcttcaa atacaacaag 7620
ccaatagttt tgaatgaagt tgatttcgat gcatttgaaa aggcaactga cggagtgaag 7680
tgcatgatga tggaatatgg ctttcatgat tgtacatatg ttacagaccc tgatgaaatc 7740
tttgggtctc tgaatatgaa ggctgcagtg ggagcacagt ataaagggaa gaagagtgaa 7800
taccttgaag gtatggactc ttttgataag gaaaggttgc tttatttgag cagtgaacgt 7860
ctgttttatg gaaagaaggg tctttggaat gggtctctta aagctgaatt gaggccaaaa 7920
gagaaagtgc aagctaataa gaccagaaca ttcactgctg ctcccattga cactctgtta 7980
ggcgccaaag tttgtgtgga tgacttcaac aatcaatttt acagtttaaa tttggcttgt 8040
ccatggactg ttgggatgac aaagttctac ggtggatggg ataagttgat gcgtagttta 8100
ccagatgggt ggctatattg tcacgcagat ggttctcaat tcgatagttc cctaacacca 8160
cttttgctta atgcagtctt ggacatcaga aggtttttta tggaagaatg gtgggttggt 8220
caagaaatgc tcgagaattt gtatgcagaa attgtgtata ctccaatcct tgcaccagat 8280
gggacaatat tcaaaaagtt caggggcaat aacagtgggc aaccatcaac tgtggtggac 8340
aatactttaa tggttgttct tgctatgtat tactcctgcc acaagcaggg ttggactgaa 8400
gatgatcttg aggatcgtat cattatcttt gctaatgggg atgatattat tctggctgtt 8460
aaagaagaag acgcatggat ctatgacaca ctcagtgctt cttttgctga acttggactg 8520
aactacaatt tcgatgatcg atcaaaacgg cgagaagatt tgtggtttat gtctcataca 8580
gcaattgaaa ttgatggagt gtacattccc aagctcgaac ctgaacgaat tgtttcaata 8640
ctagaatggg ataggagtaa agaaattatg cacaggactg aggcaatttg cgcagcaatg 8700
attgaagcgt ggggttatac agatttgctg cgtgaaatca gaaagtttta cctgtggctt 8760
gttcaaaaag atgagttcaa ggaacttgct gcagctggca aagcaccata cattgcagaa 8820
acagctttga gaaagttgta catggatgag gatgctagca tggatgagct acagaaatac 8880
ttgcatgtcc tagacctcga gcatgtggaa ggttgctgtg aatcagtatc tttgcaaacc 8940
aaatcagaaa acgataaaga agaacttgga aaggatgcaa ttgatgcagg caatgatggg 9000
aaaaggagag acaaggaaaa ggaaagaatg gtcacaaccc cgatgaatcc aaatcccaag 9060
aattcagaat ttggtggtag ctcatttaac aggaaagaca aggatgtcga tgctggctca 9120
aaaggtaaaa tggtaccacg gctgcaaaag atcacaaaga agatgaatct accaactgtg 9180
aaaggtaggg tcatactcga cttggatcat ctaattgagt atgcaccaaa tcaagttgat 9240
ctctttaata ccagagctac aaagtcacaa tttgaatcat ggtattcagc agtccaaaga 9300
gaatatgagc tggatgacaa tcagatgagc gtcatcatga atggtttcat ggtgtggtgc 9360
attgacaatg gcacttcacc aaatgttaat ggcacatggg tgatgatgga cggagaagaa 9420
caaattgaat acccattgaa gccgttagtt gaaaatgctc agccaacatt gagacaaatt 9480
atgcatcact tttcagatgc ggctgaggca tacattgaga tgagaaattc taaagagccg 9540
tatatgccta gatatggtac tctgaggaat ttgagggact tgagtttggc gaggtatgct 9600
tttgatttct atgaagtaac ctccaagacg cctaacagag caagagaagc ggtagcacaa 9660
atgaaagccg ctgccctcgc gaacgtatct actaggttgt tcggcctaga tgcaaatgtt 9720
tcaaccactg gcgagaacac tgaaaggcat actgtacggg acatctatca gaacatgcac 9780
acccttttgg gtatgaattc cccgcagtga aggttgggta aaccgaccac agttgctgtc 9840
tcgtttagcc tttaaatttc tatagtagta taactttcac tctctttaag ttcagtgtgg 9900
ttacaccacc ttccgtcaaa cttattgtga tagagtggct cagccaccag tgtttgtggt 9960
aactatagtt taaagtaagg gcggggagaa ccgttgcaac gccggagctt tcagagtgga 10020
tgcttctacg cgtactgtcc gaggtttggc aacgtttgat gtcct 10065

Claims (10)

1.成套引物对，其由引物对1-引物对7组成；
所述引物对1由EAPV-S1-F和EAPV-S1-R组成；
所述引物对2由EAPV-S2-F和EAPV-S2-R组成；
所述引物对3由EAPV-S3-F和EAPV-S3-R组成；
所述引物对4由EAPV-S4-F和EAPV-S4-R组成；
所述引物对5由EAPV-S5-F和EAPV-S5-R组成；
所述引物对6由EAPV-S6-F和EAPV-S6-R组成；
所述引物对7由EAPV-S7-F和EAPV-S7-R组成；
所述EAPV-S1-F为序列表中序列1所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S1-R为序列表中序列2所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S2-F为序列表中序列3所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S2-R为序列表中序列4所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S3-F为序列表中序列5所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S3-R为序列表中序列6所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S4-F为序列表中序列7所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S4-R为序列表中序列8所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S5-F为序列表中序列9所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S5-R为序列表中序列10所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S6-F为序列表中序列11所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S6-R为序列表中序列12所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S7-F为序列表中序列13所示的单链DNA分子；
所述EAPV-S7-R为序列表中序列14所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述的成套引物对在如下M1)-M12)任一中的应用：
M1)制备克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组的产品；
M2)克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组；
M3)制备获得东亚西番莲病毒全基因组序列的产品；
M4)获得东亚西番莲病毒全基因组序列；
M5)制备东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定的产品；
M6)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
M7)制备检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的产品；
M8)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
M9)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的产品；
M10)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
M11)制备东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究的产品；
M12)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
3.含有权利要求1所述的成套引物对的试剂盒；
所述试剂盒的功能为如下N1)-N6)中任一种：
N1)克隆和/或测序东亚西番莲病毒全基因组；
N2)获得东亚西番莲病毒全基因组序列；
N3)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
N4)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
N5)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
N6)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
4.一种获得东亚西番莲病毒全基因组序列的方法，包括如下步骤：
P1)以东亚西番莲病毒或感染东亚西番莲病毒的样品的cDNA为模板，分别采用权利要求1中所述的引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7进行PCR扩增，分别得到扩增产物1、扩增产物2、扩增产物3、扩增产物4、扩增产物5、扩增产物6和扩增产物7；
P2)对所述P1)获得的各个扩增产物进行测序，分别得到扩增产物1序列、扩增产物2序列、扩增产物3序列、扩增产物4序列、扩增产物5序列、扩增产物6序列和扩增产物7序列，并将所述扩增产物1序列、所述扩增产物2序列、所述扩增产物3序列、所述扩增产物4序列、所述扩增产物5序列、所述扩增产物6序列和所述扩增产物7序列进行比对分析和拼接，获得所述东亚西番莲病毒全基因组序列。
5.一种检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的方法，包括如下步骤：
Q1)按照权利要求4所述的方法获得待测病毒的全基因组序列；
Q2)将所述全基因组序列进行BLAST分析，确定待测病毒是否为东亚西番莲病毒。
6.一种检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的方法，包括如下步骤：
S1)按照权利要求4所述的方法获得待测样品的全基因组序列；
S2)将所述全基因组序列进行BLAST分析，确定待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的退火温度分别为53℃、53℃、53℃、55℃、51℃、52℃和56℃；
采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的退火时间分别为30s、45s、45s、45s、50s、50s、30s；
采用所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4、所述引物对5、所述引物对6或所述引物对7进行PCR扩增的延伸时间分别为1min、2min、2min、2min、2min、2min和1min。
8.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于：所述东亚西番莲病毒全基因组序列为序列15或序列16或序列17。
9.序列15或序列16或序列17所示的东亚西番莲病毒全基因组序列在如下S1)-S8)任一中的应用：
S1)制备东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定的产品；
S2)东亚西番莲病毒的检测和/或鉴定；
S3)制备检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒的产品；
S4)检测或辅助检测待测病毒是否为东亚西番莲病毒；
S5)制备检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒的产品；
S6)检测或辅助检测待测样品是否感染或携带东亚西番莲病毒；
S7)制备东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究的产品；
S8)东亚西番莲病毒的进化分析和/或分子流行病学研究。
10.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4-8任一所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述东亚西番莲病毒为东亚西番莲病毒西番莲分离物。
CN201911292171.5A 2019-12-16 2019-12-16 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用 Active CN110846440B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911292171.5A CN110846440B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911292171.5A CN110846440B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110846440A CN110846440A (zh) 2020-02-28
CN110846440B true CN110846440B (zh) 2022-11-22

Family

ID=69609246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911292171.5A Active CN110846440B (zh) 2019-12-16 2019-12-16 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110846440B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025750B (zh) * 2021-02-20 2023-08-25 广东省科学院生物工程研究所 一种同时检测百香果三种病毒的引物组、试剂盒及方法
CN114292964B (zh) * 2022-02-23 2023-09-05 赣南师范大学 西番莲病毒的组合引物对及多重rt-pcr检测方法
CN114934133A (zh) * 2022-03-30 2022-08-23 海南大学 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105602950A (zh) * 2016-03-07 2016-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒
CN106676172A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 北京通州国际种业科技有限公司 番茄212个snp位点及其在鉴定番茄品种真实性和种子纯度中的应用
KR20180054160A (ko) * 2016-11-15 2018-05-24 대한민국(농촌진흥청장) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
CN110468222A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物
CN110527730A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于rpa技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105602950A (zh) * 2016-03-07 2016-05-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种链霉菌中聚酮生物合成基因簇及其扩增引物与试剂盒
KR20180054160A (ko) * 2016-11-15 2018-05-24 대한민국(농촌진흥청장) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
CN106676172A (zh) * 2016-12-16 2017-05-17 北京通州国际种业科技有限公司 番茄212个snp位点及其在鉴定番茄品种真实性和种子纯度中的应用
CN110527730A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于rpa技术的石渠棘球绦虫检测试剂盒及其应用
CN110468222A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一组中国黑龙江立克次体的专用检测引物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"East Asian Passiflora virus genomic RNA, complete genome, strain: AO";Genbank登录号：AB246773.1;《Genbank数据库》;20080621;第2-4页 *
"East Asian Passiflora virus YW genomic RNA, complete genome";Genbank登录号：LC325839.1;《Genbank数据库》;20170930;第2-4页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110846440A (zh) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110846440B (zh) 一种用于东亚西番莲病毒全基因组测定的成套引物对及其应用
CN112725530A (zh) 检测菜豆荚斑驳病毒的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN114410818B (zh) 一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其应用
CN110628945B (zh) 胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重pcr检测方法及专用试剂盒
CN108060267A (zh) 一种检测芜菁花叶病毒所用pcr引物及其检测方法
CN101875983B (zh) 一种快速检测多种甜瓜病毒的方法
CN111996282B (zh) 一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒sc3株系的ssr标记ch0211及其检测方法和应用
CN112011650B (zh) 中华蜜蜂囊状幼虫病毒rt-rpa检测引物和探针及试剂盒
CN106755574B (zh) 一种高灵敏度的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法
CN102796825B (zh) 特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法
AU2021100028A4 (en) One-step multiplex RT-PCR method for simultaneous detection of three pathogens of sugarcane mosaic disease
CN112048573B (zh) 用于检测棉花曲叶病毒的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用
CN110484644B (zh) 一种日本落叶松种质的指纹图谱构建方法及应用
CN109735646B (zh) 一种鉴定水稻品种的caps分子标记和方法及其应用
CN111363832A (zh) 一种用于稻田土壤中拟禾本科根结线虫qPCR定量检测的引物组合物、试剂盒及其应用
CN108315468B (zh) 一种浒苔种群的线粒体分子标记引物及其应用
CN112266979A (zh) 基于西瓜花叶病毒保守区域的rpa检测引物、检测方法及其应用
CN110951923A (zh) 一种同时检测四种甘蔗种传性病毒的多重pcr方法及其引物和试剂盒
CN114606229B (zh) 山药潜隐病毒的rt-lamp检测引物组及检测方法
CN113106164B (zh) 一种用于预测丹参花色的snp分子标记及其应用
CN114045361A (zh) 一种同时检测4种烟草病毒的多重rt-pcr方法
CN117210609B (zh) 一种鉴别白花竹叶兰的引物对、试剂盒和鉴别方法
CN109628444B (zh) 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用
CN105543417A (zh) 一种苹果褪绿叶斑病毒检测试剂盒及检测方法
CN106048068B (zh) 一种兰州百合pr5基因定量检测试剂盒及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant