CN110628945B - 胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重pcr检测方法及专用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR方法及其专用试剂盒。所述检测方法包括：提取待测胡椒叶片样品总RNA，进行反转录，获得反转录产物cDNA；以反转录产物cDNA为模板，利用引物组合，进行PCR扩增；通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒。所述引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。本发明中的检测方法具有快速准确、特异性强、检测结果易辨别和节约成本等特点，为胡椒病毒病害的早期诊断和监测提供技术支撑，对田间病毒病害的防控具有十分重要的意义。

Description

胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测 方法及专用试剂盒

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，具体涉及一种胡椒叶片中胡椒黄斑驳病 毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试剂盒。

背景技术

胡椒(Piper nigrum L.)为胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)的一种多 年生常绿藤本植物，被誉为“香辛料之王”，是世界最重要的香辛料作物。我国是世 界六大胡椒主产国之一。海南、广东、广西、云南和福建等省均有种植，其中海南 是我国胡椒的主产区，主要分布在海口、文昌、琼海、万宁和定安等5个市县，海 南的种植面积和产量分别占全国83.88％和92.42％以上，种植面积31.95万亩，年总 产量达3.66万吨，年均产值超过30亿元(2016年全国南亚办热带作物生产统计数 据)。

病毒病是胡椒生产上的一类重要病害，目前国内外已明确侵染胡椒并造成为害的病毒有两种，分别是胡椒黄斑驳病毒(Piper yellow mottle virus，PYMoV)和 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)。两种病毒经常复合侵染胡椒，引起 胡椒叶片花叶、斑驳、变狭和卷曲皱缩，节间变短，植株矮缩，生长缓慢，严重影 响胡椒产量，目前尚无有效的化学药剂防治胡椒病毒病。

通过插条进行扦插是生产上胡椒的主要繁殖方法，病毒病可以通过带病的扦插条大范围、快速的传播，所以选取健康的胡椒植株作为扦插条母株，种植健康扦插 条，从源头控制病毒病的发生是田间控制病毒病的最经济有效的措施之一。PYMoV 和CMV两种病毒在田间均存在隐症现象，即在一定的环境条件下，症状暂时消失， 一旦恢复适宜的发病条件，症状又可以重新出现，这种现象导致田间难以判断未显 症植株是否携带病毒。

多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)是在同一PCR反应 体系里加上二对或二对以上特异性引物，同时扩增出两种或两种以上核酸片段的PCR 反应，从而通过一次PCR反应能同时检测两种或两种以上的病原。该项技术因其同 步、快速和准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测。目前未 有利用多重PCR技术同时检测PYMoV和CMV 2种病毒的相关文献和专利。本发明建 立了一种胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试 剂盒，可以同步、快速和准确的检测PYMoV和CMV，为胡椒病毒病害的早期诊断提 供技术支撑，对田间病毒病害的防控具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种同步检测胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花 叶病毒的多重PCR引物、检测方法及专用试剂盒。该方法具有快速准确、特异 性强和检测结果易辨别的特点。

本发明第一方面提供一种同步检测胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的引 物组合，所述引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示 的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

其中，用于检测胡椒黄斑驳病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

PYMoV-F：ACTGGGAAGGAGGTCAAAGG(序列表中序列1)

PYMoV-R：GAGGGTGTCTTGGTACTGCT(序列表中序列2)

用于检测黄瓜花叶病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

CMV-FR1：AGATTTTGGCTGCGCAGAAA(序列表中序列3)

CMV-RR1：CAGCTTAGACATCACGGCAC(序列表中序列4)

本发明的上述引物组合是多重PCR引物，可用于同步检测胡椒叶片中胡椒 黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒。

本发明的上述引物组合中的序列1和序列2所示的引物对能够在含有胡椒 黄斑驳病毒的反转录产物中特异性的扩增出1325bp的产物；序列3和序列4 所示的引物对能够在含有黄瓜花叶病毒的反转录产物中特异性的扩增出833 bp的产物。

本发明第二方面提供了一种同步检测胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜 花叶病毒的多重PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测胡椒叶片样品总RNA，以提取的RNA为模板进行反转录， 获得反转录产物cDNA；

(2)以反转录产物cDNA为模板，利用上述引物组合，进行PCR扩增；

PCR反应体系总体积为25μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、 10μmol/L的PYMoV-F1μL、10μmol/L的PYMoV-R 1μL，10μmol/L的 CMV-FR1 0.5μL、10μmol/L的CMV-RR10.5μL，cDNA 1μL和灭菌ddH₂O 8.5 μL。

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，50.1℃退火45s，72℃ 延伸45s，循环35次；72℃延伸10min。

(3)结果判定：取5μL PCR产物进行电泳，当出现1325bp大小的电 泳条带时，说明胡椒叶片中含有胡椒黄斑驳病毒；当出现833bp大小的电泳 条带时，说明胡椒叶片中含有黄瓜花叶病毒；当同时出现1325bp和833bp 两个条带时说明胡椒叶片含有胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒两种病毒。

本发明还提供了一种利用多重PCR反应同时检测PYMoV和CMV的试剂盒， 包括上述引物组合、2×Taq PCR MasterMix、灭菌ddH₂O和阳性对照。

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选获得的引物组合具有很好的特异性和兼容性，扩增获得 的各目标条带大小区分明显、条带清晰易辨、准确度高；

(2)本发明提供的检测方法，实现了在同一PCR反应体系中同步检测2 种胡椒中存在的病毒，降低了检测成本，缩短了检测时间，提高了检测效率， 具有高效、快速和准确的特点，适用于胡椒病毒病害样品的大规模检测，为种 苗带毒检测和针对性防治这2种病毒引起的病害提供依据，达到早期针对性防 病的目的，可在科学研究和病害监测等部门进行推广使用。

(3)本发明的试剂盒中包括实现PYMoV和CMV检测的试剂和引物，使用 方便快捷。

附图说明

图1A为引物特异性检索验证，引物对PYMoV-F/PYMoV-R的Primer-Blast 检索结果

图1B为引物特异性检索验证，引物对CMV-FR1/CMV-RR1的Primer-Blast 检索结果

图2为多重PCR体系的优化

A、不同引物浓度对多重PCR检测结果的影响。其中M为DL2000 DNA Marker， 泳道1-8分别对应表2中引物浓度处理1-8。

B、不同退火温度对多重PCR检测结果的影响。其中M为DL2000 DNA Marker， 泳道1-8分别对应从高到低的退火温度分别为45℃、45.8℃、47.6℃、50.1℃、 53.2℃、55.8℃、57.3℃和58℃。

图3为多重PCR和单重PCR的灵敏度比较。

A为多重PCR检测PYMoV和CMV。其中M为DL2000 DNA Marker，1-5分别 为原样、稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍和稀释10000倍。

B为单重PCR检测PYMoV。其中M为DL2000 DNA Marker，1-5分别为原样、 稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍和稀释10000倍。

C为单重PCR检测CMV。其中M为DL2000 DNA Marker，1-5分别为原样、 稀释10倍、稀释100倍、稀释1000倍和稀释10000倍。

图4为应用多重PCR对田间采集的胡椒叶片样品进行检测的结果。其中M 为DL2000DNA Marker，1-8为田间样本，9为阳性对照，10为阴性对照。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中 的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：检测胡椒黄斑驳病毒(Piper yellow mottle virus，PYMoV) 和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)多重PCR检测引物的设计、 筛选及特异性检索验证

一、引物设计

根据NCBI已公布的PYMoV和CMV的核苷酸序列，对这些基因序列进行比 对分析，采用在线引物设计软件Primer 3(vers ion 4.1.0)分别设计两种病 毒的特异性引物对，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

二、引物筛选

1、胡椒叶片组织总RNA提取和cDNA合成

采用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总RNA提取试剂盒提取健 康和被PYMoV和CMV侵染的胡椒叶片总RNA，cDNA合成采用北京全式金生物技 术有限公司生产的RNA反转录试剂盒(TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix)，均按照提取说明书进行。

2、单重PCR检测体系

PCR反应体系总体积为25μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、 10μmol/L的上下游引物各1μL，cDNA 1μL和灭菌ddH2O 7.5μL；PCR反应 程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸45s，循 环35次；72℃延伸10min；取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测， 120V稳压电泳30min，然后用凝胶成像系统观察拍照。

PCR反应产物的回收、克隆和测序：将目标电泳条带用普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收，连接到pMD18-T载体，采用热激法转化E.coli DH5α Competent Cells，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京) 有限公司，pMD18-T载体和E.coli DH5αCompetent Cells均购自宝生物工程(大 连)有限公司。通过蓝白斑筛选和PCR检测，选取阳性单克隆，委托北京六 合华大基因科技有限公司测序。

3、引物筛选

PYMoV检测引物的筛选：以步骤1获取的感病叶片cDNA为模板，以步骤2 单重PCR检测体系进行PCR扩增，筛选出特异性强、扩增条带清晰的引物对 PYMoV-F/PYMoV-R(表1)，目标条带大小为1325bp。目标条带回收、克隆和 测序，3个阳性单克隆的测序结果相同(见序列表中序列5)，测序结果提交 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对，目标条带序列 与原参考病毒的序列一致性在97.74％以上。

CMV检测引物的筛选：以步骤1获取的感病叶片cDNA为模板，以实施例2 单重PCR检测体系进行PCR扩增，筛选出特异性强、扩增条带清晰的引物对 CMV-FR1/CMV-RR1(表1)，目标条带大小为833bp，目标条带回收、克隆和 测序，3个阳性单克隆的测序结果相同(见序列表中序列6)，测序结果提交 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对，目标条带 序列与原参考病毒的序列一致性在98.56％以上。

表1 检测PYMoV和CMV 2种病毒的特异性引物组合序列及特征

三、特异性检索验证

为了验证本发明所设计引物的特异性，采用NCBI中Primer-BLAST工具 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)对引物的特异性进 行了检索。检索设置中PCR扩增产物长度为100～2000bp，最大扩增产物长度 为2000bp，检索NR数据库。引物对PYMoV-F/PYMoV-R共检索到5个扩增产 物，产物长度均为1325bp，均为PYMoV(图1A)。引物对CMV-FR1/CMV-RR1 共检索到141个扩增产物，产物长度均为833bp，均为CMV(图1B)。

实施例2：胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测体系的建立

PCR反应体系的优化：以实施例1的步骤二获取的感病叶片的cDNA为模 板和单重PCR检测体系为参考体系，通过调整单个试验因素的梯度水平，先后 对反应体系中的引物使用量和退火温度进行了优化。①不同引物对使用量的优 化：在引物浓度为10μM时，设置8个体积梯度(表2)，综合考虑目的条带 的清晰度等因素，最佳引物体积为PYMoV-F 1μL、PYMoV-R 1μL、CMV-FR1 0.5 μL和CMV-RR1 0.5μL(图2-A)；②退火温度的优化：退火温度设置8个梯度， 分别为45℃、45.8℃、47.6℃、50.1℃、53.2℃、55.8℃、57.3℃和58℃。 综合考虑目的条带的清晰度等因素，最佳退火温度为50.1℃(图2-B)。

表2 多重PCR反应体系优化中引物使用量设置

通过上述扩增条件优化，获得如下多重PCR检测方法：PCR反应体系总 体积为25μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、10μmol/L的PYMoV-F 1μL，10μmol/L的PYMoV-R1μL，10μmol/L CMV-FR1 0.5μL，10μmol/L CMV-RR1 0.5μL，cDNA 1μL和灭菌ddH₂O 8.5μL。PCR反应程序为：95℃ 预变性3min；95℃变性45s，50.1℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸10min。取5μLPCR产物，用1％琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶成像 系统观察拍照，当出现1325bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有 PYMoV；当出现833bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有CMV；当 同时出现1325bp和833bp两个条带时说明胡椒叶片含有PYMoV和CMV两 类病毒。

实施例3：本发明利用多重PCR反应同时检测PYMoV和CMV的试剂盒的建 立

本发明利用多重PCR反应同时检测PYMoV和CMV的试剂盒包括2×Taq PCRMastermix、灭菌ddH₂O、PYMoV和CMV上下游引物(引物对PYMoV-F/PYMoV-R 和引物对CMV-FR1/CMV-RR1)及阳性对照。

其中，阳性对照如下所示：

阳性对照：将实施例1中用引物对PYMoV-F/PYMoV-R和引物对CMV-FR1/ CMV-RR1扩增获得特异片段序列，进行纯化回收，分别与pMD18-T载体连接， 转化至E.coli DH5αCompetent Cells，将获得的阳性克隆测序验证后，提 取质粒，将两种质粒按照拷贝数1：1混合，浓度为1020拷贝/μL，作为试剂 盒的阳性对照。

该试剂盒可用于同时检测PYMoV和CMV 2种病毒，实现按照实施例2建立 的PYMoV和CMV多重RT-PCR检测体系。

实施例4、本发明的多重PCR引物组合的特异性验证

为了验证本发明所设计引物的特异性，采用天根生化科技(北京)有限公 司生产的植物基因组DNA提取试剂盒分别提取感染胡椒瘟病(辣椒疫霉， Phytophthoracapsica)、胡椒炭疽病(胶孢炭疽，Colletotrichum gloeosprioides Penz.)、胡椒枯萎病(尖孢镰刀菌胡椒专化型，Fusarium oxysporum Schl.f.sp.piperis)和胡椒细菌性叶斑病(甘蓝黄单胞菌萎叶致 病变种，Xanthomonas campestris pv.Betlicola)的胡椒叶片总DNA，利用 实施例2建立的PYMoV和CMV的多重RT-PCR检测体系对上述样品进行检测， 未发现特异性条带，说明本发明建立的检测方法有较强的特异性。

实施例5：本发明的多重PCR检测体系与单重PCR检测体系的灵敏度比较

用灭菌ddH₂O将实施例1获取的感病胡椒叶片cDNA以10倍梯度稀释10 倍、100倍、1000倍和10000倍，以未稀释和稀释后的cDNA作为模板，用单 重PCR和实施例4建立的多重PCR检测方法进行检测，结果表明：原样、稀释 10倍、稀释100倍的样品均可以清晰的检测到PYMoV和CMV；当稀释1000倍 时，PYMoV的条带模糊，CMV无条带；当稀释10000倍时，PYMoV和CMV均检 测不到(图3)。上述说明两种方法的检测灵敏度相同。

实施例6：应用本发明的检测试剂盒对田间采集的胡椒叶片样品进行检测

应用本发明的检测试剂盒对田间采集的8份表现病毒病症状的胡椒叶片 样品进行检测，结果显示：样品1、3、5和6中检测到PYMoV和CMV两种病毒， 样品2、7和8中仅检测到PYMoV，样品4中仅检测到CMV(图4)。

将上述这些样品分别使用引物对PYMoV-F/PYMoV-R和引物对CMV-FR1/ CMV-RR1进行单重PCR检测，也得到同样的结果。

<110> 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试剂盒

<130> WHOI190087

<170> Patent-In 3.5

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

actgggaagg aggtcaaagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

gagggtgtct tggtactgct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

agattttggc tgcgcagaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

cagcttagac atcacggcac 20

<210> 5

<211> 1325

<212> DNA

<213> 胡椒黄斑驳病毒（Piper yellow mottle virus）

<400> 5

actgggaagg aggtcaaagg gaaagaaagg ttagtattca attataagag gttgaatgat 60

aatactaaca aagaccaata ttccttgcca gggatcaaca cgattatcag taaggtcgga 120

aacagcaaga tattctcgaa atttgacctt aaatctggtt ttcatcaagt tgctatggac 180

cctgaatcca tcgagtggac tgcttttagt acccctaatg ggctgtatga atggcttgtc 240

atgccgtttg gggtgaagaa cgcgcctgct gtattccaaa gaaagatgga caactgcttc 300

aaaggtatgg aagatttcat tgttgtctat attgatgaca tattggtgtt ctcagaaaat 360

atgaaggacc atgcccaaca cttagtcgca atgcttgaag tgtgcaagaa gaatgggctt 420

atcttaagcc caacaaaaat gaaaattggg cttgggacaa ttgatttcct gggagccact 480

attgggaaca gcaaggtgaa actacaggag cacatcgtga agaaaatatt ggacttcaat 540

accaatgggc tcgaagataa gaagaatctc cgaagctggt tgggtattct taactatgcc 600

agggcataca taccaaacct agggagtatc ctaggcccat tatatgccaa agtcagccca 660

acaggagaaa agaaaatgaa tcaacaggat tggggcattg tggcccaaat taagaaaatt 720

atacaagaat tgcctgagct ggaactgcca ccagagaact gctgcatcgt gatagaaaca 780

gatggatgtg tgaatggctg gggcgccgtc tgcaagtgga agcccatggc gtgtgacccg 840

aagagcacag aaaagatttg cgcctactgc agtggaaaat ttgacccacc aaaatctacc 900

attgatgcag agattcatgc agttatgaac agcctagaga aactaaagat ttattatttg 960

gataagaagg agatagttat taggacagat tgtcaagcca tcatctcttt ctttaataaa 1020

tcttccgtca acaagccttc aagagtccga tggatagggt tcactgacta cataaccgga 1080

ctaggcattg atgttaaatt ccaacatatt gacggtaaag aaaattctct ggctgattct 1140

ttatctagat taacatgttc tttgatcagg caatggcatc aactggagcc ggtagttacc 1200

actatggaag cagctcttgt tcaggagcaa ctgaacccaa cgccagggtc gaccaaagcc 1260

ctgagacagg ctttggacca ggtcaaccaa tggctaagct cgaccagcag taccaagaca 1320

ccctc 1325

<210> 6

<211> 833

<212> DNA

<213> 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus）

<400> 6

agattttggc tgcgcagaaa gccgagaagc tcgctgagaa gcttgcacaa cccgtgattg 60

aggtatcgga cagacctgag gcgtcatctc caacgcctgg tgatacagct gatgtttgtg 120

gaaaagagca agaggtttcg gaacttgact ctttatcagc tcagacacgt tcccccatca 180

ctagaattgc tgaaagggct actgctatgt tagagtatgc cgcttatgag aaacaattgc 240

acgacaccac agtgtctaat ttgaaacgta tttggaacat ggcgggtggt gatgacaaga 300

gaaattccct cgagggtaat ttgaagttcg tttttgatac atacttcact gtcgatccca 360

tggtgaatat tcacttctcc acgggtcggt ggatgcgtcc tgtgcccgaa ggaattgttt 420

actctgtcgg ttacaacgaa cgcggtttag gtccgaagtc agatggagag ctttacattg 480

tcaacagcga gtgtgtgatt tgtaatagtg agtctttgtc tactgtcact cgctcgcttc 540

aagccccgac tggaaccatt agtcaagttg atggggttgc tggttgcggg aagaccacgg 600

caataaaatc catttttgag ccgtccactg acatgatcgt taccgcgaat aagaaatccg 660

cccatgatgt tcgtatggca ctgttcggat cgtctgattc caaagaagct tgcacctttg 720

ttcgtaccgc cgattctgtc ctacttaatg aatgtccgac cgttagtagg gttctggttg 780

atgaggttgt gctgcttcac tttggtcaat tgtgtgccgt gatgtctaag ctg 833

Claims (7)

1.一种同步检测胡椒黄斑驳病毒(Piper yellow mottle virus，PYMoV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的多重PCR引物组合，其特征在于，所述多重PCR引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

2.一种同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的多重PCR引物组合。

3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括2×Taq PCRMastermix、灭菌ddH₂O。

4.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照；所述阳性对照为序列表中序列5和序列6分别与pMD18-T连接的重组质粒的等拷贝数混合物。

5.权利要求1所述的多重PCR引物组合、权利要求2、3或4所述的试剂盒在同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒中的应用。

6.一种同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，包括下述步骤：

1)提取待测胡椒叶片样品总RNA，以提取的RNA为模板进行反转录，获得反转录产物cDNA；

2)以反转录产物cDNA为模板，利用权利要求1所述引物组合，进行多重PCR扩增；

PCR反应体系总体积为25μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、10μmol/L的序列表中序列1所示的核苷酸1μL、10μmol/L的序列表中序列2所示的核苷酸1μL、10μmol/L的序列表中序列3所示的核苷酸0.5μL、10μmol/L的序列表中序列4所示的核苷酸0.5μL，反转录产物cDNA 1μL和灭菌ddH₂O 8.5μL；

(3)结果判定：用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当出现1325bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有胡椒黄斑驳病毒；当出现833bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有黄瓜花叶病毒；当同时出现1325bp和833bp两个条带时说明胡椒叶片含有胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒两种病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应条件为：PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，50.1℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸10min。

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