CN111996282B - 一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒sc3株系的ssr标记ch0211及其检测方法和应用 - Google Patents

一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒sc3株系的ssr标记ch0211及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定大豆对大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)流行株系SC3抗性鉴定的SSR标记CH0211及其检测方法和应用，通过利用新开发的与抗大豆花叶病毒SC3株系基因紧密连锁的SSR标记CH0211对大豆品种进行抗病性选择，以期获得抗SMV SC3株系的大豆新种质。本发明避免了大豆常规抗花叶病毒育种的周期长、工作量大、选择效率低、抗病表型选择易受环境影响等缺点，可大幅提高抗病育种选择效率，为对基因型的直接选择提供了可能，将极大地推动大豆抗病育种进程。

Description

一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的SSR标记CH0211及其 检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒流行株系SC3品种的SSR标记CH0211及其检测方法和应用。
背景技术
大豆花叶病毒(Soybean Mosaic Virus,SMV)病是大豆生产中最常见、危害最为严重的病毒害之一，严重危害大豆的产量与品质(图2)。传统抗SMV育种需要人工接种鉴定每个后代家系的抗病性，耗时费力、且易受到环境(尤其是温度)等条件的限制，从而影响抗性材料表型的选择。随着现代分子生物学的发展，现代生物技术的进步为作物育种提供了强有力的帮助，分子标记辅助选择育种(Molecular Marker-Assisted Selection,MAS)作为其中一项重要技术，它与传统抗SMV育种相比，MAS技术可对抗病基因直接选择，能够更加高效、精准地选择抗SMV个体，大幅提高育种效率。
微卫星序列(Simple Sequence Repeat,SSR)标记具有重复性好，多态性高，共显性等优点，广泛分布在大豆基因组中。目前SSR标记已被广泛运用于MAS中，利用与抗病相关的SSR标记检测种质抗SMV的准确率较高，且快速、简便，可直接用于大豆抗SMV育种。
国内目前已经筛选了一些与抗SMV相关的分子标记，一些专家也利用这些标记进行抗SMV的辅助筛选，但筛选的标记选择与表型选择符合率不高，且所用材料样本偏小。滕卫丽等利用与SMV1抗性相关的SSR标记Satt114、Satt362、HSP176、Satt510、Satt334、Sct033和与SMV3抗性相关的SSR标记Satt114、Satt362，分别对70份大豆种质资源接种东北株系(SMV1和SMV3)进行抗性鉴定，验证结果表明SSR标记鉴定准确率分别为70.7％和75.6％。韩英鹏等利用SSR标记Satt114对146个F2：5重组自交家系进行接种N1株系后的抗性鉴定，得出分子辅助选择的符合率为87.5％。李文福等用6个与大豆花叶病毒抗性相关的SSR标记Sat_229、Sat_317、Satt335、Satt160、Satt516和Sat_309对186份种质资源接种SMV1株系后进行检测，6个标记中Sat_317、Satt335、Satt516对抗病资源筛选的准确率70％以上。栾晓燕等利用分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)建立的F2群体DNA抗感池中鉴定出与抗性表型紧密相关的SSR标记Satt296，该标记位于D1b连锁群，推测该标记有望用于大豆抗SMV3株系的分子标记辅助选择。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒流行株系SC3的SSR标记CH0211及其检测方法和应用，通过利用新开发的与Rsc3紧密连锁的SSR标记CH0211的专用引物对大豆抗大豆花叶病毒SC3株系进行早期子代选择鉴定，大大减少了抗病育种工作量以及育种周期，因此能够快速、精准、高效地筛选出抗SMV SC3的大豆育种材料。
本发明技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的SSR标记CH0211，所述SSR标记引物序列如下：
上游引物：5’-CAGGTCGATAAGTCTATGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-ATATGAACTCGGTCTGTTG-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明还提供了一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的SSR标记CH0211的引物，所述SSR标记引物序列如下：
上游引物：5’-CAGGTCGATAAGTCTATGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-ATATGAACTCGGTCTGTTG-3’(SEQ ID NO.2)
本发明的第二个目的是提供一种利用前述SSR标记CH0211鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1：提取待鉴定大豆的基因组DNA，以待鉴定大豆的基因组DNA为模板，用SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的SSR标记引物进行PCR扩增；
S2：在步骤S1所得扩增产物加入溴酚蓝染色，用8％浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，银染后进行带型分析。
进一步的，S1所述PCR扩增的PCR扩增体系为10μL，包括2×Taq Plus MasterMix5μL，所述上游引物0.5μL，所述下游引物0.5μL，终浓度＜0.1μg/10μL的模板DNA 1μL，ddH2O 3μL。
进一步的，S1所述PCR扩增的PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性20S，50℃退火20S，72℃延伸20S，运行32个循环，然后72℃终延伸2min后于4℃保存。
进一步的，S2所述8％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离条件为：电压200V，电流150A条件下于5×TBE缓冲液中电泳分离45min。
进一步的，S2所述带型分析为：如扩增产物目的条带大小为123bp，则待鉴定大豆为抗大豆花叶病毒SC3株系品种。即所述引物扩增的与抗大豆花叶病毒SC3株系连锁的SSR标记CH0211特征条带为123bp。
本发明的第三个目的是提供前述的SSR标记CH0211，或前述的SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示的SSR标记引物，或前述的检测方法在筛选抗大豆花叶病毒SC3株系的大豆种质中的应用。
进一步的，所述应用包括以下步骤：
S1：提取待鉴定大豆的基因组DNA，以待鉴定大豆的基因组DNA为模板，用SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的SSR标记引物进行PCR扩增；
S2：在步骤S1所得扩增产物加入溴酚蓝染色，用8％浓度的聚丙烯酰胺凝胶在电压200V，电流150A的条件下于5×TBE缓冲液中电泳分离45min，银染后进行带型分析。
进一步的，S1所述PCR扩增的PCR扩增体系为10μL，包括2×Taq Plus MasterMix5μL，所述上游引物0.5μL，所述下游引物0.5μL，终浓度＜0.1μg/10μL的模板DNA 1μL，ddH2O 3μL。
进一步的，S1所述PCR扩增的PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性20S，50℃退火20S，72℃延伸20S，运行32个循环，然后72℃终延伸2min后于4℃保存。
进一步的，S2所述带型分析为：如扩增产物目的条带大小为123bp，则待鉴定大豆为高抗大豆花叶病毒SC3株系品种。即所述引物扩增的与抗大豆花叶病毒SC3株系连锁的SSR标记CH0211特征条带为123bp。
本发明具有以下有益效果：
应用本发明提供的SSR标记CH0211及检测方法用来检测大豆抗大豆花叶病毒SC3株系，抗病选择符合率为80.56％，感病选择符合率为77.78％，准确率较高，能够高效、快速、精准地用于分子标记辅助选择，节省了大量人工接种鉴定的人力、物力、财力及时间成本。本发明经济效益高，对大豆品系抗大豆花叶病毒SC3株系的抗病选育效率有极大提升。
附图说明
图1为本发明实施例中含有SSR标记CH0211的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图中有Marker带型和288个品种带型。
图2为不同抗性品种接种SC3表型图。
图2A为抗病品种，图2B为感病品种。
具体实施方式
为了更加清楚明白地介绍本发明的目的和优点，以下结合实例来对本发明进行详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可通过商业途径从生物试剂公司买到。
实施例1
实验材料为：
在南京农业大学国家大豆改良中心保存的2018年国内主要育种单位新育成的品种288份。
所用SSR标记CH0211引物序列为：
上游引物：5’-CAGGTCGATAAGTCTATGT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-ATATGAACTCGGTCTGTTG-3’(SEQ ID NO.2)。
上述标记的引物用于检测大豆品种对大豆花叶病毒SC3株系的抗性。
S1、在南京农业大学国家大豆改良中心保存的2018年国内主要育种单位新育成的品种288份中(表1)，按照植物基因组DNA提取试剂盒(康为，CW0531M)操作指南提取基因组DNA，利用所述SSR标记CH0211进行PCR扩增，PCR扩增体系为10μL，包括2×Taq PlusMasterMix5μL，所述上游引物0.5μL，所述下游引物0.5μL，终浓度＜0.1μg/10μL的模板DNA1μL，ddH2O3μL；PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性20S，50℃退火20S，72℃延伸20S，运行32个循环，然后72℃终延伸2min后于4℃保存。其中，扩增产物中含有一个123bp～150bp之间的DNA片段，具有123bp片段的品种为候选具有抗大豆花叶病毒SC3株系的待检大豆品种。
S2、在步骤S1所得扩增产物加入0.5μL溴酚蓝染色，用8％浓度的聚丙烯酰胺凝胶在电压200V，电流150A的条件下于5×TBE缓冲液中电泳分离45min，银染后进行带型检测分析，目的条带大小为123bp为1型，是抗大豆花叶病毒SC3株系品种所具带型，其余带型为2型，为感病品种所具带型；288份大豆品种抗性结果检验采用酶联免疫吸附法(ELISA)与肉眼表型判断相结合，结果如表1所示。
表1 288份大豆品种接种SC3后的抗性、OD值以及标记带型
Figure BDA0002689584180000061
Figure BDA0002689584180000071
Figure BDA0002689584180000081
Figure BDA0002689584180000091
R:抗病；S：感病；1：抗病带型；2：感病带型；血清检测阳性对照OD值：1.9148；血清检测阴性对照OD值：0.0921。R:Resistant；S:Susceptible；1:Resistant allele；2:Susceptible allele；OD value of ELISA positive control:1.9148；OD value ofELISA negative control:0.0921.
结合带型与抗性结果，带型为1且抗性鉴定为抗病则判定为标记符合抗病性；带型为2且抗性鉴定为感病则判定为标记符合感病性。本发明随机检测的288份品种抗病符合率为80.56％，感病符合率为77.78％(表2)。分子标记选择符合率计算方法如下：
Figure BDA0002689584180000092
Figure BDA0002689584180000093
表2标记CH0211对大豆品系抗SC3选择的符合率
Figure BDA0002689584180000094
R:抗病；S：感病；1：抗病带型；2：感病带型；R1:抗病且带型为1；S2：感病且带型为2。
R:Resistant S:Susceptible 1:Resistant allele；2:Susceptible allele R1:Resistant&Resistant allele S2:Susceptible&Susceptible allele.
以上所述尽是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的SSR标记CH0211及其检测方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtcgata agtctatgt 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atatgaactc ggtctgttg 19

Claims (6)

1.鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的SSR标记CH0211，其特征在于，所述SSR标记的引物序列如下：
上游引物SEQ ID NO.1：5’-CAGGTCGATAAGTCTATGT-3’；
下游引物SEQ ID NO.2：5’-ATATGAACTCGGTCTGTTG-3’。
2.一种利用权利要求1所述SSR标记CH0211的引物鉴定大豆抗大豆花叶病毒SC3株系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待鉴定大豆的基因组DNA，以待鉴定大豆的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的SSR标记引物进行PCR扩增；
S2：在步骤S1所得扩增产物加入溴酚蓝染色，用8%浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，银染后进行带型分析，所述带型分析为：如扩增产物包含大小为123bp的目的条带，则待鉴定大豆为抗大豆花叶病毒SC3株系品种。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，S1所述PCR扩增的PCR扩增体系为10μL，包括2×Taq Plus MasterMix5μL，所述上游引物0.5μL，所述下游引物0.5μL，终浓度＜0.1μg/10μL的模板DNA 1μL，ddH2O 3μL。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，S1所述PCR扩增的PCR反应条件为94℃预变性2min；94℃变性20s ，50℃退火20s ，72℃延伸20s ，运行32个循环，然后72℃终延伸2min后于4℃保存。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，S2所述8%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离条件为：电压200V，电流150A条件下于5×TBE缓冲液中电泳分离45min。
6.权利要求1中所述的SSR标记的引物，或权利要求2所述的检测方法在筛选抗大豆花叶病毒SC3株系的大豆种质中的应用，其特征在于，扩增产物包含大小为123bp的目的条带，则待鉴定大豆为抗大豆花叶病毒SC3株系品种。
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